專利名稱：一種β-葡糖苷酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于酶基因和酶工程技術領域，具體涉及一種￠-葡糖苷酶及其應用。
背景技術：
3 _匍糖昔酶(EC 3. 2. I. 21)的英文名稱是@-glucosidase,又稱@-D-匍糖昔水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶。屬于外切水解酶類，是一類在親核分子間催化轉移糖苷的酶，可以在短鏈的寡糖或纖維二糖 內部、在帶有芳香基團或烷基的碳水化合物的殘基之間打斷￠-1,4-糖苷鍵。￠-葡糖苷酶是纖維素酶系中的一種，是纖維素降解的限速酶，在纖維素酶水解過程中將各種寡糖及纖維二糖降解為葡萄糖，是最后的關鍵酶，對纖維素糖化水解具有關鍵性作用。3 -葡糖苷酶還具有轉糖苷作用，在一定的條件下可以通過轉糖苷作用將兩個葡萄糖分子合成一個槐糖分子。已發現槐糖是纖維素酶基因表達的強誘導物。一般認為絲狀真菌中纖維素酶合成的誘導機制是存在于分生孢子和菌絲表面的少量組成性纖維素酶，首先降解纖維素生成纖維二糖等寡糖，然后在質膜結合的葡萄糖苷酶的專苷作用下，生成槐糖等誘導物，經細胞膜上的組成性透性酶系進入細胞內， 啟動纖維素酶的合成。利用3-葡糖苷酶催化合成槐糖來誘導纖維素酶的生產具有巨大的商業價值和現實意義。^ -葡糖苷酶廣泛存在于植物、動物和微生物。在微生物中，曲霉被普遍認為是產生葡糖苷酶的優良菌種，其中尤以黑曲霉和木霉的產量最高。但目前￠-葡糖苷酶液態發酵酶活普遍偏低；而通過固態發酵生產3-葡糖苷酶又會使成分復雜，不宜提取。故采用基因工程技術構建高產P -葡糖苷酶的工程菌株，具有重要的現實意義。紙狀葡萄穗霉具有嗜纖維性，已報道的其所產纖維素酶具有較寬的pH適應性，并且對于堿性條件也有較好的耐受性。因此，從紙狀葡萄穗霉中克隆新型的￠-葡糖苷酶基因，除可以研究其酶學特性以外，還可為研究糖苷水解酶家族特征及酶的體外定向改造提供理論上的指導。
發明內容
本發明的目的是提供一種P -葡糖苷酶及其應用，即一種具有工業應用價值的新型@ -葡糖苷酶，從而彌補現有技術的不足。本發明獲得的￠-葡糖苷酶的基因，包含有2508bp的DNA，編碼一個由817個氨基酸組成的蛋白質。本發明的P -葡糖苷酶，包括有a)序列為 SEQ ID NO 1 的酶；b)在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。編碼上述0 -葡糖苷酶的核苷酸，其序列為SEQ ID NO :2。本發明還提供用于表達上述￠-葡糖苷酶的重組表達質粒，是將序列為SEQ IDNO 2的核苷酸片段插入到原核表達載體中構建的。所述的原核表達載體為pGm。本發明還涉及攜帶有表達上述木糖苷酶的重組表達質粒的重組菌。本發明的葡糖苷酶用于燃料乙醇等能源物質的生產、食品工業中的風味酶、飼料的生產等。本發明提供的β_葡萄糖苷酶，發酵進行到第5天時，發酵液酶量達到最大值5313. 82U/ml ;其最適溫度為50°C，最適pH為5. 8。并且該酶還具有很高的木糖苷酶活性，為58. 20U/ml。另外，本發明的β _葡萄糖苷酶還具有脫氧葡萄糖和潮霉素抗性以及轉糖苷作用。在轉糖苷作用下，可以使纖維二糖等寡糖生成槐糖等誘導物，再經細胞膜上的組成性 透性酶系統進入細胞內，啟動細胞內纖維素酶的合成。故而可以利用葡萄糖苷酶催化合成槐糖來誘導纖維素酶的生產，更具有巨大的商業價值。
圖I :本發明的β -葡糖苷酶基因DNA電泳圖譜；圖2 :本發明的質粒pGm_gl0158的構建圖；圖3 :本發明的葡糖苷酶在不同溫度下的相對活力；圖4 :本發明的葡糖苷酶在不同pH值下的相對活力；圖5 :本發明的葡糖苷酶在不同溫度下的熱穩定性。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。一、β -葡糖苷酶的篩選及檢測I、紙狀葡萄穗霉菌(購自中國微生物菌種保管委員會普通微生物中，CGMCC
3.5365)總 DNA 提取(I)將紙狀葡萄穗霉菌用CMC液體培養基，在30°C、200rpm條件下搖床培養48小時；(2)用無菌紗布過濾得菌絲體，將菌絲體在液氮中磨成粉末。(3)提取方法參考試劑盒(Fungal DNA kit)。2、β -葡糖苷酶基因的擴增根據紙狀葡萄穗霉菌全基因組分析得到的β -葡糖苷酶基因序列即SEQ NO. I所示的核苷酸序列，設計一對寡核苷酸引物Pl和Ρ2，其序列為PI:5' -CCATTACGTAAGAATGCGGACCTCACTGTCAGTCG-3'P2:5/ -CTAGTCTAGACTAAGCCTGCACGGGCTGAT-3'以實施例I提取的基因組DNA為模版，擴增葡糖苷酶基因。反應程序如下第一階段變性95°C，3min ;第二階段變性94°C，30s，退火58°C，30s,延伸68°C 3min,共進行25個循環；第三階段延伸72°C，10min。得到的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖I。3、表達載體的構建用SnaBl和Xbal雙酶切實施例2得到的PCR擴增產物和pGm質粒(具有乙酰胺和氨芐選擇標記)，膠回收后，然后用T4連接酶將酶切后的gl0158與pGm質粒置于16°C過夜連接，得到連接產物；將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a (Trans5 a Chemically CompetentCell，北京全式金生物技術有限公司)感受太細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有β_葡糖苷酶基因(gl0158)的重組質粒。測序結果表明篩選出的葡糖苷酶的核苷酸序列為SEQ ID NO :2，翻譯出的氨基酸序列為SEQ ID NO :2。4、轉化黑曲霉及重組子篩選堅定(I)將黑曲霉Gl孢子用CMC液體培養基，30°C培養過夜。(2)將(I)中獲得的菌體用6層無菌紗布過濾，并用SolutionA沖洗(3)將(2)中獲得的菌絲體放入加有 O. 6g Lysing Enzymes 和 40ml Solution B的無菌三角瓶中，混勻，30°C, 150rpm, I小時后，將轉速改為80rpm, I小時。(4)然后用兩層無菌神奇濾布過濾，將濾液分裝到50ml無菌離心管中，加 Solution B 至 45ml, 4000rpm,離心 lOmin。棄上清；加 20ml Solution B 混勻，4000rpm,離心5min,棄上清；再加20ml Solution B混勻，4000rpm,離心5min,棄上清。(5)加IOOul Solution B混勻，加IOul實施例3得到的重組質粒；再加12. 5ulSolution C混勻，冰上靜置20min。(6)加 2ml Solution B, Iml Solution C 和 8ml adms 上層培養基，混勻，倒入 3 個adms下層培養基平板中，30°C恒溫箱培養。3_4天后，觀察有無轉化子長出。(7)將長出的轉化子轉接adms 二次驗證培養基平板中，30°C恒溫箱培養，并進行菌落PCR驗證，獲得陽性菌株。5、重組菌株的培養和β-葡糖苷酶的表達將獲得的陽性菌株接種于Promosoy Special medium液體培養基中，于30 0C 200rpm搖床培養。二、β -葡糖苷酶的活性測定以對-硝基苯酚-β -D-葡萄糖苷(pNPG)為底物測定β -葡萄糖苷酶的活性，以每分鐘催化pNPG生成I微摩爾對-硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量為一個酶活單位(IU)。I、β -葡糖苷酶最適反應溫度、pH和熱穩定性測定I).測定本發明葡糖苷酶在不同溫度下的比活力反應體系為在IOOul緩沖液中加適當稀釋濃度的粗酶液50ul再加入5mMpNPG50ul。混勻，分別置于30-80°C水浴中，準確計時15min ;反應結束后，迅速、準確地加入IM碳酸鈉溶液100ul，搖勻，然后在410nm下測定吸光值。測定結果參見圖3。從該圖中可以看出，木糖苷酶的最適反應溫度為50°C2、測定本發明葡糖苷酶在不同pH下的比活力反應體系與測定本發明葡糖苷酶在不同溫度下的比活力相同，緩沖液的pH分別為2.4-7.8，反應溫度為501。測定結果參見圖4。從該圖中可以看出，葡糖苷酶的最適反應pH為4. 83、測定本發明葡糖苷酶的熱穩定性將一定濃度的粗酶液放入40、50和60°C水浴中溫浴，每隔一小時取出一部分酶做
酶活反應。
反應體系為在IOOul緩沖液中加適當稀釋濃度的粗酶液50ul再加入5mMpNPG 50ul。混勻，置于50°C水浴中，準確計時15min ;反應結束后，迅速、準確地加入IM碳酸鈉溶液IOOul,搖勻,然后在410nm下測定吸光值。測定結果參見圖5。三、@ -葡糖苷酶的應用在50ml的錐形瓶中加入30ml,400mg/ml的葡萄糖溶液、3ml本發明的P -葡萄糖苷酶的粗酶液，在50°C、pH 4. 5下反應100h，加熱終止反應，所制備成的復合糖液即可用于
誘導纖維素酶生產。在250ml錐形瓶中裝液50ml，接種10%，在30°C，180r/min下培養，測定發酵液中的濾紙酶活力和還原糖含量。結果顯示在利用葡萄糖苷酶制備的復合物為碳源的情況下的產酶結果與以葡萄糖為碳源的對照相比，纖維素酶活力提高了 20倍，顯示了良好的工 業應用前景。
權利要求
1.ー種β-葡糖苷酶，其特征在于，所述的β-葡糖苷酶包括有 a)序列為SEQID NO 1的酶； b)在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加ー個或幾個氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一種核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸用于編碼權利要求I所述的葡糖苷酶。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列為SEQID Ν0:2。
4.一種用于表達權利要求I所述的葡糖苷酶的重組表達質粒，其特征在于，所述的重組表達質粒是將序列為SEQ ID NO 2的核苷酸片段插入到原核表達載體中構建的。
5.如權利要求4所述的重組表達質粒，其特征在于所述的原核表達載體為pGm。
6.ー種重組菌，其特征在于，所述的重組菌攜帶有權利要求4所述的重組表達質粒。
7.權利要求I所述的β-葡糖苷酶在能源物質生產、風味酶和飼料生產中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種β-葡糖苷酶及其應用，包括有a)序列為SEQ ID NO1的酶；b)在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本發明提供的β-葡萄糖苷酶具有脫氧葡萄糖和潮霉素抗性還具有轉糖苷作用，在轉糖苷作用下，可以使纖維二糖等寡糖生成槐糖等誘導物，再經細胞膜上的組成性透性酶系統進入細胞內，啟動細胞內纖維素酶的合成。故而可以利用β-葡萄糖苷酶催化合成槐糖來誘導纖維素酶的生產，更具有巨大的商業價值。
文檔編號C12N1/15GK102827820SQ20121028171
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者王華明, 于海玲 申請人:天津工業生物技術研究所