專利名稱：一種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法
技術領域：
本發明涉及以納塔爾鏈霉菌AaiaJefl1Si1S)發酵生產納他霉素的工藝方法，特別是一種利用高山被孢霉發酵生產花生四烯酸所得發酵廢液來提高納他霉素產量的生產方法。
背景技術：
納他霉素(Natamycin)是一種二十六元多烯大環內酯類抗真菌抗生素，可以抑制各種霉菌、酵母菌的生長，也能抑制真菌毒素的產生。作為一種安全高效、無毒、廣譜的抗真菌劑，已成為食品生物防腐劑研究領域的一個熱點。納他霉素主要由恰塔努加鏈霉菌(Streptomyces、納塔爾鏈霉菌 lStreptomyces natalensis)和褐黃抱鏈霉菌^Streptomyces giIvosporeus)三種鏈霉菌經發酵過程生產的。它是通過有效地與真菌細胞膜的主要留醇-麥角固醇結合，破壞細胞膜的選擇滲透性使細胞內的必需物質滲 漏而致使菌體死亡。與其他常用的化學防腐劑相比，納他霉素具有無色無味、對產品的口感特性無影響、適用范圍廣、使用劑量低、專一性好、安全性高等顯著的優勢。1982年6月，美國FDA正式批準納他霉素可用作食品防腐劑。1997年3月，中國衛生部正式批準納他霉素作為食品防腐劑。目前，國內外納他霉素的發酵水平不一，所采用的方法也是多種多樣，主要是采用誘變育種和調整發酵工藝等手段提高其產量，但是采用添加另外一種發酵廢液來提高納他霉素產量的報道并不多見；尤其未發現有公布使用高山被孢霉發酵廢液來提高納他霉素產量的報道，此方法即提高了目標產物產量，縮短了發酵周期，又實現了廢物再利用，節約了能源，有利于環境保護。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法。本發明以納塔爾鏈霉菌iStreptomyces發酵生產納他霉素為基礎進行的，具體方法如下
O搖瓶種子培養
無菌條件下，取納塔爾鏈霉菌孢子涂布于瓊脂斜面培養基中，置于培養間中培養，然后將培養好的孢子刮入盛有搖瓶種子培養基的三角瓶中，搖床培養；
所述培養間培養的溫度為26 30°C，培養的時間為6 9d ;
所述搖床培養的轉速為150 200rmp，搖床培養的溫度為26 30°C，搖床培養的時間為36 48h。所述瓊脂斜面培養基為葡萄糖5. O 15. Og/L,麥芽浸粉I. O 5. Og/L,酵母浸膏
I.O 5. Og/L，蛋白胨 3. O 10. Og/L，瓊脂粉 10. O 20. Og/L, pH 7. O 7. 2。所述種子培養基為葡萄糖10. O 30. 0g/L,酵母浸膏3. O 10. 0g/L,黃豆餅粉30. O 50. 0g/L, pH 7. O 7. 2。
2)搖瓶發酵培養
將種子液按5% 10%的接種量接入盛有發酵培養基的三角瓶中，培養溫度26 30°C， 搖床轉速為150 200rpm，發酵時間96 120h，同時在0 48h發酵時間內一次性添加高山被孢霉發酵廢液10 70% (v/v), pH 7. 0 7. 2，發酵結束后得納他霉素。所述發酵培養基為葡萄糖5. 0 15. Og/L,可溶性淀粉30. 0 50. Og/L,酵母浸膏 5. 0 10. Og/L,黃豆餅粉 20. 0 40. Og/L, pH 7. 0 7. 2。所述高山被孢霉發酵廢液是本公司實驗室保存的高山被孢霉菌株用作實驗室搖瓶發酵產花生四烯酸產品所產生的發酵廢液，或者是高山被孢霉菌株發酵產花生四烯酸工藝所產生的發酵廢液。所述高山被孢霉發酵廢液的最佳添加量為20% 40% (v/v)。經測定，使用本發明所闡述的方法生產所得納他霉素的產量相對沒有添加高山被孢霉發酵廢液的納他 霉素產量提高至少15%。本發明采用添加高山被孢霉發酵廢液方法發酵生產納他霉素，并在發酵初始0 48小時內一次性添加此發酵廢液，納他霉素產量穩定且相對于沒有添加此發酵廢液的納他霉素產量提高至少15%，具有操作簡單、發酵周期短、生產成本降低、產量有較明顯提高、節能環保等優勢。
圖I為實施例I的發酵產物納他霉素產量曲線。在圖I中，橫坐標為發酵時間(h), 縱坐標為發酵液中所測得的納他霉素產量(g/L)。圖2為實施例2的發酵產物納他霉素產量曲線。在圖2中，橫坐標為發酵時間(h)， 縱坐標為發酵液中所測得的納他霉素產量(g/L)。圖3為實施例3的發酵產物納他霉素產量曲線。在圖3中,橫坐標為發酵時間(h), 縱坐標為發酵液中所測得的納他霉素產量(g/L)。圖4為對比例I的發酵產物納他霉素產量曲線。在圖I中,橫坐標為發酵時間(h)， 縱坐標為發酵液中所測得的納他霉素產量(g/L)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做詳細說明。實施例I
I)搖瓶種子培養無菌條件下，取納塔爾鏈霉菌孢子涂布于瓊脂斜面培養基中，置于培養間中培養，再從培養間里拿出新鮮的納塔爾鏈霉菌實驗菌株，使用無菌接種環挑取少量孢子接種于種子培養基(葡萄糖10g/L，酵母浸膏5g/L，黃豆餅粉50g/L，pH 7. 0)的三角瓶中，搖瓶轉速180rpm、28°C、培養48h。2)搖瓶發酵培養將培養好的種子液以10%的接種量接種于發酵培養基(葡萄糖 10g/L酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黃豆餅粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，搖瓶轉速 180rpm、28°C、培養120h。在發酵培養開始后Oh時三組實驗搖瓶中分別添加10%、20%和70% (v/v)的高山被孢霉發酵廢液(其余時間不添加)。至發酵結束時發酵液中納他霉素產量通過HPLC法測定分別達到3. 027g/L、3. 159g/L和2. 987g/L (參見圖I)。HPLC方法如下取O. 5ml納他霉素發酵液,加入7ml甲醇,充分搖勻后,8000rpm離心IOmin,取上清液用O. 45 m微孔濾膜過濾即得到待測液。標準品的配制精確稱取IOOmg納他霉素標準品，用甲醇溶解并定容至100ml，配制成I. Og/L的標準溶液，再稀釋此標準溶液配制成不同濃度的標準溶液制成標準曲線，待檢測樣品時使用。HPLC條件儀器為島津LC-15C ;流動相為甲醇水冰醋酸=60 40 5 (v/v/v)；色譜柱是島津LC-C18 (5μπι，4· 6mmX250mm);柱溫為室溫；檢測波長為303nm ;進樣流速為
1.Oml/min ;進樣量為20 μ I每次。實施例2
O搖瓶種子培養同實施例I。2)搖瓶發酵培養將培養好的種子液以10%的接種量接種于發酵培養基(葡萄糖10g/L酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黃豆餅粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，搖瓶轉速180rpm、28°C、培養120h。在發酵培養開始后24h時三組實驗搖瓶中分別添加10%、20%和70% (v/v)的高山被孢霉發酵廢液(其余時間不添加)。至發酵結束時發酵液中納他霉素產量通過HPLC法測定分別達到2. 968g/L、3. 131g/L和3. 021g/L (參見圖2)。實施例3
O搖瓶種子培養同實施例I。2)搖瓶發酵培養將培養好的種子液以10%的接種量接種于發酵培養基(葡萄糖10g/L酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黃豆餅粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，搖瓶轉速180rpm、28°C、培養120h。在發酵培養開始后48h時三組實驗搖瓶中分別添加10%、20%和70% (v/v)的高山被孢霉發酵廢液(其余時間不添加)。至發酵結束時發酵液中納他霉素產量通過HPLC法測定分別達到2. 948g/L、3. 094g/L和2. 912g/L (參見圖3)。通過以上實施例可以看出，整個發酵過程只添加一次并且分別在發酵過程中Oh、24h和48h時往發酵培養基中添加10%、20%和70%不同體積的高山被孢霉發酵廢液，產量比較穩定，說明發酵過程中在以上三個時間點添加以上不同體積的高山被孢霉發酵廢液都可以得到較高的納他霉素產量。對比例I
O搖瓶種子培養同實施例I。2)搖瓶發酵培養將培養好的種子液以10%的接種量接種于發酵培養基(葡萄糖10g/L，酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黃豆餅粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，搖瓶轉速180rpm、28°C、培養120h。至發酵結束時發酵液中納他霉素產量通過HPLC法測定達到
2.649g/L (參見圖4未添加發酵液曲線)。通過對比例和實施例可以看出，添加高山被孢霉發酵廢液所得納他霉素產量比未添加的納他霉素產量提高至少15% (參見圖4)。
權利要求
1.ー種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法，其特征在于包括以下步驟 1)搖瓶種子培養 無菌條件下，取納塔爾鏈霉菌孢子涂布于瓊脂斜面培養基中，置于培養間中培養，然后將培養好的孢子刮入盛有搖瓶種子培養基的三角瓶中，搖床培養； 所述培養間培養的溫度為26 30°C，培養的時間為6 9d ; 所述搖床培養的轉速為150 200rmp，搖床培養的溫度為26 30°C，搖床培養的時間為36 48h ； 2)搖瓶發酵培養 將種子液按5% 10%的接種量接入盛有發酵培養基的三角瓶中，培養溫度26 30°C，搖床轉速為150 200rpm，發酵時間96 120h，同時在O 48h發酵時間內一次性添加高山被孢霉發酵廢液10 70% (v/v), pH 7. O 7. 2，發酵結束后得納他霉素； 所述發酵培養基為葡萄糖5. O 15. Og/L,可溶性淀粉30. O 50. Og/L,酵母浸膏5.O 10. Og/L,黃豆餅粉20. O 40. Og/L，高山被孢霉發酵廢液10 70%(v/v)，pH 7. O 7.2。
2.根據權利要求I所述的ー種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法，其特征在于步驟I)中，所述瓊脂斜面培養基為葡萄糖5. O 15. Og/L，麥芽浸粉I. O 5. Og/L，酵母浸膏 I. O 5. 0g/L，蛋白胨 3. O 10. 0g/L，瓊脂粉 10. O 20. 0g/L,pH 7· O 7· 2。
3.根據權利要求I所述的ー種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法，其特征在于步驟I)中，所述種子培養基為葡萄糖10. O 30. 0g/L，酵母浸膏3. O 10. 0g/L,黃豆餅粉 30. O 50. 0g/L, pH 7· O 7· 2。
4.根據權利要求I所述的ー種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法，其特征在于步驟2)中，所述高山被孢霉發酵廢液的最佳添加量為20% 40% (v/v)。
5.根據權利要求I所述的ー種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法，其特征在于步驟2)中，所述高山被孢霉發酵廢液是指高山被孢霉菌株發酵產花生四烯酸エ藝所產生的發酵廢液。
全文摘要
本發明公開了一種利用高山被孢霉發酵廢液提高納他霉素產量的方法，它是一種往發酵培養基中添加高山被孢霉(Alpinemortierella)發酵廢液提高納他霉素產量的方法。包括以下步驟將納他霉素生產菌株從斜面活化后接入種子培養基中，然后再接入到發酵培養基中發酵時間96～120h，所述發酵培養基為葡萄糖5.0～15.0g/L，可溶性淀粉30.0～50.0g/L，酵母浸膏5.0～10.0g/L，黃豆餅粉20.0～40.0g/L，高山被孢霉發酵廢液10～70%(v/v)，pH7.0～7.2，其中高山被孢霉發酵廢液是在0～48h發酵時間內一次性添加的，發酵結束后得納他霉素；測得的納他霉素產量相對沒有添加高山被孢霉發酵廢液的納他霉素產量提高至少15%。采用添加高山被孢霉發酵廢液的方法，具有操作簡單、周期短、成本低、產量有較明顯提高、節能環保等優勢。
文檔編號C12P19/62GK102827903SQ20121028172
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者郭江, 孫立潔, 李俊, 姚建銘, 劉洋, 盧詩瑤 申請人:武漢中科光谷綠色生物技術有限公司