點狀掌跖角化病的致病基因及其用途
【專利摘要】本發明鑒定了與點狀掌跖角化病(Punctate?palmoplantar?keratodermas，PPPK，OMIM：148600)相關的致病基因，COL14A1基因。在此基礎上，本發明提供了突變的COL14A1基因及其用途，包含突變的COL14A1基因的載體、宿主細胞以及試劑盒。此外，本發明還提供了用于診斷或治療點狀掌跖角化病的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
【專利說明】點狀掌跖角化病的致病基因及其用途
【技術領域】[0001]本發明涉及分子遺傳學領域以及疾病診斷和治療領域。特別地，本發明鑒定了與點狀掌妬角化病(Punctate palmoplantar keratodermas,PPPK, OMIM: 148600)相關的致病基因，C0L14A1基因。在此基礎上，本發明提供了突變的C0L14A1基因及其用途，包含突變的C014A1基因的載體、宿主細胞以及試劑盒。此外，本發明還提供了用于診斷或治療點狀掌跖角化病的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
【背景技術】
[0002]掌妬角化病(palmoplantar keratodermas, PPK)是一類類型多樣、發病機制較為復雜、并且具有高度遺傳異質性的、以彌漫性或局限性掌跖增厚為主要特征的皮膚疾病。
[0003]點狀掌跖角化病(PPPK ；0MIM:148600)是一種以不規則分布于掌跖的大量角化性斑塊為特征的罕見的常染色體顯性遺傳性疾病。Buschke和Fischer在1910年第一次描述了該疾病，Brauer在1913年確定了它的遺傳性[13]。因此，該疾病又被命名為點狀掌跖角化病Buschke-Fi scher-Brauer型。PPPK疾病在部分國家有報道，并且其發病率在克羅地亞為10萬分之1.17 [14]，在斯洛文尼亞為10萬分之3.3 [27]。從1991年至今，我國僅報道了 9個PPPK疾病家系，并且在這些家系中，PPPK疾病都以常染色體顯性遺傳的模式遺傳。PPPK疾病患者在手掌與足跖部位具有圓形或卵圓形、較硬的黃色或淡黃色角質丘疹；若去除角質丘疹，則局部可留有火山口樣的凹坑。此外，患者還可伴有甲變形[13，14]。典型的點狀皮損可以融合成塊，這可能與遭受連續性高壓有關[12]，并且足跖部位的皮疹通常比掌部的更大。少數患者不僅可累及掌跖部位，而且可累及其他部位如膝部、手足背部、肘部等等。PPPK疾病的組織病理學特征主要表現為，表皮高度角化過度、角質層明顯增厚、其下方馬爾匹基層被壓凹陷低于一般表皮水平、顆粒層和棘層增厚、基底細胞無異型性增生、真皮乳頭水腫及小血管擴張、真皮內無炎細胞浸潤等。
[0004]PPPK在臨床上與一些其他的發生于掌跖部位的角化性皮膚疾病比較相似，如胼胝、跖疣、持久性豆狀角化過度(HLP) (0ΜΙΜ: 144150)、掌跖部位的點狀汗孔角化癥(0ΜΙΜ: 175860)、砷角化癥、肢端角化性類彈性纖維病等疾病。然而，PPPK疾病仍然可以與此類疾病相區別。例如，(I)胼胝是因壓力所致，跖疣可以通過臨床和組織病理學特征(無角化不全或細胞空泡變性)來排除；(2)持久性豆狀角化過度(HLP):可以觀察到l-5mm點狀角化性丘疹，并且在HLP中，tolly樣角化過度是其組織病理學特征；(3)掌跖部位的汗孔角化癥(又稱為棘狀角化病):其發病年齡多在12-25歲，掌跖部位的點狀汗孔角化癥與點狀角化非常相似，表現為大量的l_3mm凹陷和角化栓[36，37]，并且其也以常染色體顯性遺傳模式遺傳；然而，該疾病本身具有獨特的組織病理學特征，如牛角線和角化不全，汗孔角化等等；(4)肢端角化性類彈性纖維病(0ΜΙΜ: 101850):其屬于常染色體顯性遺傳，在臨床上可以觀察到多邊形或者圓形的火山口樣丘疹，分布于手掌與手背交界部及足跖邊緣；并且其發病年齡大多開始于20歲左右，但也可見于中年與少年；其組織病理學特征可見角質層增厚與角化過度，顆粒層、棘層增厚，真皮下不可見排列紊亂的彈力纖維[38] ；(5)砷角化癥:患者有砷接觸史，其可導致針頭大小的點狀角化斑[39]，類似于尋常疣的表現，多見于手掌與足底，其上可見散在的色素脫失；該疾病可伴發各種惡性皮膚腫瘤，如鮑溫病、基底細胞癌、鱗狀細胞癌；砷角化癥的組織病理學特征可見角化不全、角化過度、可伴輕至中度的角質形成細胞發育不良，表皮突呈不規則向下延伸，在真皮上部可以見到慢性炎性細胞的浸潤，也可見到真皮的嗜堿性變，角質形成細胞呈輕度核異形性、核深染；如若伴發其他疾病，則可出現相應疾病的組織病理學特征。
[0005]Martinez-Mir等[12]對3個不同種族的PPPK家系(I個猶太、I個墨西哥、I個阿拉伯)進行了全基因組掃描，將致病基因定位在15q22 - 15q24.1上D15S534和D15S818之間的9.98cM區域中(其物理距離為7.5Mb)。此外，鑒于該區域的L0C123396基因與K8具有高度的同源性，而角蛋白突變可引起多種不同類型的PPK，他們還把該區域的L0C123396基因作候選基因，進行了序列分析。然而，他們并未在該候選基因中檢測到有意義的突變，而僅僅發現了兩個位點多態性 ，其所對應的氨基酸改變分別為A358T與R392C。
[0006]張等[I]對中國的2個不同地區的PPPK家系進行了連鎖分析，并將該疾病的致病基因定位在8q24.13-8q24.21上D8S1804和D8S1720之間的9.02cM區域中。并且，他們的研究結果提示，PPPK具有遺傳異質性。該區域包括了 10個已知的基因:CDAI1，MTSSl,KIAA0196, NDUFB9(MIM 601445), TRC8(MIM 603046), NSE2, C8FW, P0U5F1(MIM164177),SQLE (MIM 602019)和MYC (MM 190080)，以及11個預測的基因。然而，在這些基因中，并未發現特異性表達于皮膚的基因。
[0007]高等[2]在一個中國的大家系中進行了精心定位，將PPPK致病基因定位在D15S651和D15S988之間的5.06cM區域中。他們還對該區域內的6個基因:KLPH, MAP2K1 (0MIM: 176872)，MADH6 (0M頂:602931)、RPL4 (0ΜΙΜ: 180479)，FLJ10036和 SNAPC5 (0M頂:605979)進行了檢測，然而并未發現有意義的突變位點。
[0008]El Amri I等[16]確定了在染色體15q中的可疑基因座的遺傳因素，此區域位于D15S987和D15S153之間。然而，他們也未能最終鑒定出PPPK的致病基因。
[0009]全基因組外顯子測序(也稱為外顯子組測序(exome sequencing))是一種經濟的測序方法，其主要是對人類基因組的編碼區進行測序，從而探測與罕見和常見疾病相關的新基因。由于該方法只測序全部基因組的編碼區(占全部基因組的約1%)，因此，該方法比較經濟并且伴有較高的覆蓋效率和深度[17，18]。目前公認，大多數單基因疾病由致病基因的功能變異引起，而大部分的此類功能變異又發生于外顯子區域中[3，4]，因此，全基因組外顯子測序被認為是彌補定位克隆技術的重要技術。
[0010]全基因組外顯子測序技術已被證明為減少稀有單基因疾病的候選基因個數甚至發現其致病基因的有力、有效手段。通過對很少的幾個個體(包括患者及正常對照)進行外顯子組測序，以篩選與疾病相關的變異，其成功率大為提升。自2009年以來，國內外已經利用全基因組外顯子測序技術，成功地發現或驗證了一些單基因疾病(Freeman - Sheldon綜合征、Miller綜合征、Kabuki綜合征、BVVL綜合征、逆向性痤瘡、脊髓小腦共濟失調、Schinzel-Giedion綜合征、非綜合征性耳聾)的致病基因[5_11]。另外，還通過將全基因組外顯子測序與連鎖定位方法相結合，發現了一些單基因疾病的致病基因[8，19-23]。
[0011]本發明基于全基因組外顯子測序技術以及全基因組連鎖分析法，成功鑒定出了與PPPK相關的致病基因-C0L14A1基因，以及其中的致病突變(C0L14A1基因的雜合變異:NM_021110.1:外顯子37:c.4505C_>T ;p.Prol502Leu))。在此基礎上，本發明提供了突變的C0L14A1基因及其用途，包含突變的C0L14A1基因的載體、宿主細胞以及試劑盒。此外，本發明還提供了用于診斷或治療PPPK的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。本發明所鑒定的PPPK致病基因，為進一步探明該疾病的發病機制奠定了重要基礎，并且有可能為患者的治療方案提供全新的理論依據。此外，本發明所鑒定的PPPK致病基因還對將來的遺傳咨詢、產前診斷及基因治療具有重要意義。
【發明內容】
[0012]在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學、核酸化學和分子生物學相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
[0013]如本文中所使用的，術語“C0L14A1基因”是指編碼膠原XIV(CXIV)的基因，其跨度為246，922bp，具有47個外顯子，并且其示例性cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。CXIV是一種具有不規則三螺旋結構的纖維相關膠原，它通過與纖維表面相互作用而調節原纖維的形成[28]，并且主要表達在已分化的組織和晚期的胚胎組織中[29]。如本文中所使用的，C0L14A1基因的第N個外顯子被簡稱為外顯子N(N為1_47的整數)。
[0014]如本文中所使用的，當用具體的序列來描述基因或核酸時，其不僅包括該具體序列所代表的基因或核酸，而且包括該具體序列的互補序列所代表的基因或核酸。在本申請中，雖然為了方便起見，在多數情況下針對基因或核酸只給出了一條鏈的序列，然而本領域技術人員可以明確獲知其互補鏈的序列。因此，本申請事實上也公開了所述互補鏈的序列。
[0015]例如，當提及C0L14A1基因的cDNA序列時，其不僅包括cDNA的實際序列，而且包括所述實際序列的互補序列。又如，當提及SEQ ID NO:1時，其不僅包括SEQ ID NO:1所示的序列，而且包括SEQ ID NO:1的互補序列。
[0016]本申請中的核酸序列包括DNA形式和RNA形式。除非上下文特別指明，否則本發明的核酸序列不僅包括DNA形式，而且包括RNA形式。例如，當提及SEQ ID NO:1時，其不僅包括DNA形式(例如，cDNA序列)，而且包括RNA形式(例如，mRNA序列)。
[0017]如本文中所使用的，術語“突變”，當用于描述基因或DNA時，是指基因序列或DNA序列中一個或多個(例如，幾個)堿基的添加、缺失和/或置換；當用于描述蛋白質時，是指蛋白質氨基酸序列中一個或多個(例如，幾個)氨基酸殘基的添加、缺失和/或置換。
[0018]如本文中所使用的，術語“沉默突變”是指這樣的基因突變，其引起mRNA中的密碼子發生改變，但由于密碼子的簡并性而未引起編碼的氨基酸發生改變。如本文中所使用的，術語“非沉默突變”是指除了沉默突變以外的基因突變，包括但不限于，錯義突變、無義突變和移碼突變等。
[0019]如本文中所使用的，術語“功能喪失性突變”是指這樣的突變，其導致突變基因所編碼的蛋白喪失了對應的野生型蛋白的生物學功能，或與對應的野生型蛋白相比，具有異常的生物學功能。
[0020]如本文中所使用的，術語“雜合突變”是指這樣的突變，其僅存在于一對等位基因中的一個基因中。如本文中所使用的，術語“純合突變”是指這樣的突變，其在一對等位基因中的兩個基因中同時存在。
[0021]如本文中所使用的，術語“c.4505”是指cDNA序列的第4505位堿基(以起始密碼子ATG的堿基A為第I位堿基)，其中“c.”表示cDNA，數字“4505”表示第4505位堿基。本文中所使用的其他類似的術語具有類似的含義。
[0022]如本文中所使用的，術語“p.1502”是指蛋白質序列的第1502位氨基酸殘基，其中“P.”表示蛋白質，數字“1502”表示第1502位氨基酸殘基。本文中所使用的其他類似的術語具有類似的含義。 [0023]如本文中所使用的，術語“c.4505C — T”是指cDNA序列的第4505位堿基(以起始密碼子ATG的堿基A為第I位堿基)由C突變為T。本文中所使用的其他類似的術語具有類似的含義。
[0024]如本文中所使用的，術語“p.Prol502Leu”是指蛋白質序列的第1502位氨基酸殘基由Pro突變為Leu。本文中所使用的其他類似的術語具有類似的含義。
[0025]如本文中所使用的，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。另外，還用“ ”表示終止密碼子。
[0026]如本文中所使用的，術語“載體(vector) ”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。此類載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于:質粒；噬菌體；柯斯質粒等等。
[0027]載體中可包含與目的基因可操作地連接的表達控制序列。如本文中所使用的，術語“可操作地連接”是指所連接的分子的連接方式使得能夠實現預期的功能。例如，表達控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實現表達控制序列對基因編碼序列的表達的控制作用。如本文中所使用的，術語“表達控制序列”是實現基因表達所需要的控制序列，其是本領域熟知的。表達控制序列通常必須包括啟動子，常常也包括轉錄終止序列，并且還可以包含其他序列，如增強子序列。基因表達對于siRNA、miRNA等而言是指轉錄，并且還可以包括轉錄后加工；對于蛋白質編碼序列而言通常是指轉錄和翻譯，產生蛋白質。
[0028]另外，載體中還可包含選擇標記。此類選擇標記是本領域技術人員熟知的,例如但不限于抗生素抗性基因，例如青霉素抗性基因、紅霉素抗性基因等等。
[0029]如本文中所使用的，“PCR引物”指用于在PCR反應中擴增靶標核酸的多核苷酸片段，其通常為寡核苷酸，例如含有至少5個堿基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個或者更多個堿基的多核苷酸片段。
[0030]本領域技術人員公知，引物不必與待擴增的目的基因或其互補鏈完全互補，只要其能夠特異性擴增目的基因。如本文中所使用的，術語“特異性擴增”是指引物能夠通過PCR反應擴增目的基因，而不擴增其他基因。例如，特異性擴增C0L14A1基因是指，在PCR反應中引物只擴增C0L14A1基因，而不擴增其他基因。此類引物的設計是本領域技術人員公知的，參見例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989);和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。
[0031]通常，引物與待擴增的目的基因或其互補鏈具有大體上的同一性，從而能夠特異性擴增目的基因。例如，引物與待擴增的目的基因或其互補鏈具有至少60%的序列同一性,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一'I"生。[0032]如本文中所使用的，術語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據)，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目XlOO的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如 Align 程序(DNAs tar, Inc.)方便地進行的 Needleman 等人(1970) J.Mol.Biol.48:443-453的方法來實現。[0033]如本文中所使用的，術語“雜交”是指相互間具有互補序列的兩個單鏈核酸分子在一定條件下(適宜的溫度及離子強度等)按堿基互補配對原則退火形成雙鏈核酸的過程。核酸雜交可以在DNA-DNA之間，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之間進行，只要它們之間存在互補序列，可以進行堿基配對。一般而言，雜交的雙方是待測核酸分子和已知核酸分子。在雜交體系中已知的核酸分子稱作探針(probe)。核酸雜交包括固-液相雜交和液相雜交。液相雜交是在溶液中進行的雜交反應，其是指待測核酸分子與已知核酸分子(探針)在溶液中退火形成雜交復合物。[0034]如本文中所使用的，術語“特異性檢測C0L14A1基因突變”是指探針能夠區分出含有突變的C0L14A1基因與不含有突變的C0L14A1基因。一般而言，可以通過控制雜交條件的嚴緊性，使得探針能夠區分出含有突變的基因與不含有突變的基因。例如，在高度嚴緊條件下，與C0L14A1基因精確互補的探針可以與不含有突變的C0L14A1基因雜交，而不與甚至只包含一個點突變的突變的C0L14A1基因雜交，從而將二者區分開。同樣，還可以設計與突變的C0L14A1基因精確互補的探針，從而其在高度嚴緊條件下與突變的C0L14A1基因雜交，而不與不含有突變的C0L14A1基因雜交。[0035]在分子生物學領域中，探針的設計和雜交技術是熟知的，參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989);和 Ausubel 等人，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。為了舉例說明的目的，雜交的條件可以是嚴緊條件，例如與濾膜結合的DNA在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45°C下雜交，之后在0.2XSSC/0.1%SDS中于約50 — 65°C下進行一次或多次洗滌；高度嚴緊條件，例如與濾膜結合的核酸在6XSSC中約45°C下雜交，之后在0.1XSSC/0.2%SDS中于約68°C下進行一次或多次洗滌；或本領域技術人員已知的其它嚴緊雜交條件。[0036]通常，探針是經標記的，從而在雜交反應結束后，通過利用探針上的標記物，可以分離和檢測雜交后的雙鏈。同樣，也可以對引物進行標記，從而在PCR后，通過利用引物上的標記物，可以分離和檢測擴增產物。可用于標記探針和引物的標記物在本領域內是已知的，包括但不限于，放射性同位素如1251、酶、酶的底物、發光物質如異魯米諾和吖啶酯、熒光物質如熒光素和羅丹明、生物素和有色物質如乳膠顆粒和膠體金等。標記用的酶可以是過氧化物酶(如辣根過氧化物酶HRP)、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對于這些反應中合適的底物有2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、魯米諾-過氧化氫、鄰苯二胺-過氧化氫(針對過氧化物酶)、對硝基苯磷酸鹽、4-甲基磷酸傘型酮、3_(2’-螺旋金剛燒)_4_甲氧基-4_(3〃-憐酸基)苯基-1,2-二乙氧基燒(針對喊性憐酸酶)、對硝基苯-β-D-半乳糖和甲基傘形酮-β-D-半乳糖(針對β半乳糖苷酶)。其它的標記包括量子點標記、生色團標記、酶標記、親和配體標記、電磁自旋標記、重原子標記、標記有納米微粒光散射標記或其它納米微粒的探針、異硫氰酸熒光素(FI TC)、TRITC、羅丹明、四甲基羅丹明、R-藻紅蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy_7、得克薩斯紅、Phar-Red、異藻紅蛋白(APC)、以及酶標記如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶和半抗原偶聯物如洋地黃毒苷或二硝基苯酚、或能夠形成配合物的結合配對如鏈霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗體配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG;突光基團如傘形三糖(umbelliferone)、突光素、異硫氰酸突光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、綠熒光蛋白、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、二苯乙烯、熒光黃、Cascade藍、二氯三嗪基熒光素、丹磺酰氯、藻紅蛋白、熒光鑭系絡合物如包括銪和鋪、Cy3、Cy5、分子信標(molecular beacons)和其突光衍生物、發光材料如魯米諾；光散射或細胞質基因組共振材料如金或銀顆粒或量子斑(quantum dot):或放射性材料如14C、1231、1241、1311、Tc99m、35S 或 3H;或球珠(spherical shell),以及標記有本領域已知的任何其它信號產生標記物的探針。例如，可檢測的分子包括但不限于熒光基團以及前面所述其它已知的，如在 Joseph R.Lakowicz (Editor)所編的 Principles of FluorescenceSpectroscopy, Plenum Pub Corp,第二版(July 1999)和 Richard P.Hoagland 的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些實施方式中，標記物包括半導體納米微晶如量子斑(即 Qdots),參見 U.S.P 6,207,392。Qdots 可從 Quantum Dot Corporation購得。用于本發明的半導體納米微晶包括Group I1-V半導體的納米微晶如MgS、MgSe、MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe、SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS、ZnSe、ZnTe, CdS, CdSe、CdTe, HgS, HgSe, HgTe和其混合物以及Group II1-V半導體的納米微晶如GaAs、InGaAs,InP、InAs和其混合物。Group IV半導體如鍺或硅的使用，或有機半導體的使用，在某些條件下可能是方便可行的。半導體納米微晶也可以包括合金，其含有兩種或多種選自于Group II1-V化合物、Group I1-VI化合物、Group IV元素和其組合物的半導體。根據使用的標記物，相應的核酸分離和檢測方法在本領域內也是已知的。參見例如，Henegariu
O等人，(1999).“Custom fluorescent-nucleotide synthesis as an alternativemethod for nucleic acid labeling，，，Nature Biotechnology 18:345-348 ;Ezaki T 等，1989.Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridizationin Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization inwhich Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among BacterialStrains.1nt.J.0f Systemic Bacteriology 29 (3): 224-229 ;和 Herrington C等人，1998.PCR 3:PCR in situ hybridization:a practical approach, Volume 3.0xford:OxfordUniversity Press。
[0037]如本文中所使用的，術語“能夠特異性識別/結合突變的C0L14A1蛋白的抗體或其抗原結合片段”是指這樣的抗體或其抗原結合片段，其特異性識別/結合突變的C0L14A1蛋白，而不識別或結合野生型C0L14A1蛋白。此類抗體通常可采用Kohler等首次報道的雜交瘤技術(Nature, 256:495, 1975)來獲得。
[0038]如本文中使用的，術語“特異性識別/結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。在某些實施方式中，特異性結合某抗原的抗體(或對某抗原具有特異性的抗體)是指，抗體以小于大約10_5m，例如小于大約10_6M、10_7M、10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或更小的親和力(Kd)結合該抗原。如本文中所使用的，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，其用于描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。可使用本領域技術人員公知的技術，例如表面等離子體共振術(SPR)(例如使用BIAC0RE儀)來測定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。
[0039]如本文中所使用的，術語抗體的“抗原結合片段”是指包含全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，FundamentalImmunology, Ch.7 (Paul, ff., ed.,第 2 版，Raven Press, N.Y.(1989),其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的。可通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。在一些情況下，抗原結合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。
[0040]如本文中所使用的，術語“中和性抗體”是指，能阻斷或抑制其所識別的抗原的活性或功能的抗體。
[0041]如本文中所使用的，術語“特異性靶向突變的C0L14A1基因的siRNA”是指，siRNA能夠通過RNA干擾特異性沉默或抑制突變的COL14AI基因的表達，而不影響野生型COL14AI基因的表達。
[0042]如本文中所使用的，術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR, 19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company, 1995),并且包括但不限于:pH 調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，pH調節劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80 ;離子強度增強劑包括但不限于氯化鈉。
[0043]如本文中所使用的，術語“有效量”是指`足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病(例如PPPK)有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病(例如PPPK)的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發癥的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力范圍之內。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。
[0044]本發明至少部分基于發明人的發現:C0L14A1基因的突變可導致PPPK。在此基礎上，本發明提供了突變的C0L14A1基因及其用途，包含突變的C0L14A1基因的載體、宿主細胞以及試劑盒。此外，本發明還提供了用于診斷或治療PPPK的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
[0045]因此，在一個方面，本發明提供了突變的C0L14A1基因，其與SEQ ID N0:1相比具有至少I個非沉默突變，并且所述突變的C0L14A1基因編碼與野生型C0L14A1蛋白相比，功能異常(例如喪失了功能)的蛋白，或導致PPPK的發生。
[0046]在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的外顯子區域。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的第37個外顯子。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于:c.4505。在進一步優選的實施方案中，所述非沉默突變是:c.4505C — T0
[0047]在另一個方面，本發明提供了包含上述突變的C0L14A1基因的載體。
[0048]在一個優選的實施方案中，所述載體包括但不限于克隆載體和表達載體。在一個優選的實施方案中，所述載體是例如質粒，粘粒，噬菌體，柯斯質粒等等。在一個優選的實施方案中，所述載體是商購可得的。在一個優選的實施方案中，所述載體包含與上述突變的C0L14A1基因可操作地連接的表達控制序列，例如但不限于啟動子，增強子和終止子。在一個優選的實施方案中，所述載體任選地還包含選擇標記。
[0049]在另一個方面，本發明提供了包含上述突變的C0L14A1基因和/或載體的宿主細胞。此類宿主細胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞(如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等)。本發明的宿主細胞還可以是細胞系，例如293T細胞。
[0050]本領域技術人員公知，可將致病基因用于產生疾病動物模型和/或用作藥物靶點，從而研究疾病的發病機制·和開發有效治療疾病的藥物。因此，在另一個方面，本發明提供了上述突變的C0L14A1基因的用途，其用于產生PPPK動物模型，或用作藥物靶點，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產生PPPK動物模型，或用作藥物靶點。在一個優選的實施方案中，所述動物包括但不限于，哺乳動物，例如小鼠，大鼠，兔和猴。
[0051]在另一個方面，本發明提供了上述載體或宿主細胞的用途，其用于產生PPPK動物模型，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產生PPPK動物模型。
[0052]在另一個方面，本發明提供了試劑盒，其包含上述突變的C0L14A1基因和/或載體和/或宿主細胞。
[0053]在另一個方面，本發明提供了用于診斷PPPK的診斷劑，其包含能夠特異性擴增C0L14A1基因或其片段的引物，或能夠特異性檢測C0L14A1基因突變的探針，或能夠特異性識別突變的C0L14A1蛋白的抗體或其抗原結合片段。
[0054]在一個優選的實施方案中，所述引物能夠特異性擴增C0L14A1基因的外顯子，優選第37個外顯子。在一個優選的實施方案中，所述引物的序列選自SEQ ID N0:73和74。在進一步優選的實施方案中，所述引物是如SEQ ID N0:73和74所示的引物對。
[0055]在一個優選的實施方案中，所述C0L14A1基因突變位于C0L14A1基因的外顯子，優選第37個外顯子，更優選地位于:c.4505。在進一步優選的實施方案中，所述突變是
c.4505C — T0
[0056]在一個優選的實施方案中，所述突變的C0L14A1蛋白包含氨基酸突變p.Prol502Leu。
[0057]在一個優選的實施方案中，所述引物、探針或抗體或其抗原結合片段是經標記的。
[0058]在另一個方面，本發明提供了試劑盒，其包含上文所述的診斷劑。在一個優選的實施方案中，所述試劑盒還包含其他試劑，例如用于PCR的試劑(例如dNTP和聚合酶)，用于提取核酸的試劑，用于檢測所述抗體或其抗原結合片段的二抗等。
[0059]在另一個方面，本發明提供了用于治療PPPK的治療劑，其包含分離的正常的C0L14A1基因，或含有所述基因的載體，或具有正常生物學功能的C0L14A1蛋白，或特異性靶向突變的C0L14A1基因的siRNA，或特異性結合突變的C0L14A1蛋白的中和性抗體。如本文中所使用的，術語“正常的C0L14A1基因”是指編碼具有正常生物學功能的C0L14A1蛋白的C0L14A1基因，其例如但不限于，如SEQ ID NO:1所示的C0L14A1基因。
[0060]在一個優選的實施方案中，所述突變的C0L14A1基因所包含的突變位于C0L14A1基因的外顯子，優選第37個外顯子，更優選地位于:c.4505。在進一步優選的實施方案中，所述突變是c.4505C — T0在一個優選的實施方案中，所述突變的C0L14A1蛋白包含氨基酸突變 P.Prol502Leu。
[0061]在另一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含上文所述的治療劑，和藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
[0062]在另一個方面，本發明提供了診斷受試者是否患有PPPK或處于發展PPPK的風險中的方法，其包括，檢測受試者的C0L14A1基因是否存在非沉默突變，如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有PPPK或處于發展PPPK的風險中。
[0063]在一個優選的實施方案中， 所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的外顯子區域。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的第37個外顯子。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于c.4505。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變是c.4505C — T0
[0064]在另一個方面，本發明提供了診斷受試者是否患有PPPK或處于發展PPPK的風險中的方法，其包括:
[0065]I)獲得來自所述受試者的核酸樣品(例如，基因組DNA樣品或總mRNA樣品)；
[0066]2)在所述核酸樣品中確定C0L14A1基因中是否存在導致C0L14A1基因編碼功能異常的蛋白的非沉默突變；和
[0067]3)如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有PPPK或處于發展PPPK的風險中。
[0068]在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的外顯子區域。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的第37個外顯子。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變位于c.4505。在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變是c.4505C — T0
[0069]在另一個方面，本發明提供了檢測C0L14A1基因的突變的方法，其包括使用上文所述的診斷劑。在一個優選的實施方案中，所述方法不是診斷方法。例如，所述方法可以用于研究目的。
[0070]在另一個方面，本發明提供了治療受試者的PPPK的方法，其包括給有此需要的受試者施用有效量的上文所述的治療劑。
[0071]在另一個方面，本發明提供了上文所述的診斷劑在制備用于檢測C0L14A1基因的突變和/或用于診斷PPPK的試劑盒中的用途。
[0072]在另一個方面，本發明提供了上文所述的治療劑在制備用于治療PPPK的藥物組合物中的用途。
[0073]本發明的試劑、試劑組合物、藥物組合物或試劑盒中可進一步包含與活性成分相容的緩沖液、載體或媒介等，例如選自下列的一種或多種:水、生理鹽水、磷酸緩沖液、左旋糖、甘油、乙醇和其他類似物，以及上述物質的組合。此類緩沖液、載體或媒介可進一步包括微量輔助物質，例如濕潤劑、乳化劑、表面活性劑、防腐劑或助懸劑等。
[0074]發明的有益效果
[0075]本發明通過外顯子組測序技術確定了 PPPK的致病基因，這至少帶來了以下有益效果。
[0076]一方面，本發明為PPPK的診斷和治療提供了新的方法和工具。特別地，本發明所提供的診斷方法以及用于該方法的引物和/或探針和/或抗體可用于快速、有效地確定受試者是否患有PPPK或處于發展PPPK的風險中。
[0077]另一方面，本發明為PPPK的發病機制研究奠定了重要基礎，為PPPK患者的治療提供全新的理論依據。另外，PPPK的致病基因的鑒定對將來的遺傳咨詢、產前診斷及基因治療具有重要意義。此外，利用PPPK致病基因所獲得的疾病動物模型是研究PPPK的發病機制和治療方法的有力工具。
[0078]下面將結合附圖和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的范圍的限定。根據附圖和優選實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說將變得顯然。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0079]圖1展示了實施例1中所使用的PPPK家系(PPPK703)的家系圖譜。其中，〇表示正常女性；□表示正常男性；表示男性患者；?表示女性患者。其中，“+”表示對來自該受試者的樣品進行了全基因組外顯子測序，表示使用Sanger測序法對來自該受試者的樣品進行了家系內點驗證。
[0080]圖2示例性顯示了 PPPK703家系中患者和正常人的C0L14A1基因的Sanger測序法的測序結果，其中患者具有雜合突變:c.4505C — T (p.Prol502Leu)，而正常人在c.4505處具有純合的堿基C，而不具有該雜合突變。
[0081]序列信息
[0082]本發明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
[0083]
【權利要求】
1.突變的C0L14A1基因，其與SEQID NO:1相比具有至少I個非沉默突變，并且所述突變的C0L14A1基因編碼與野生型C0L14A1蛋白相比，功能異常(例如喪失了功能)的蛋白，或導致PPPK的發生； 例如，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種； 例如，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的外顯子區域； 例如，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的第37個外顯子； 例如，所述非沉默突變位于:c.4505 ； 例如，所述非沉默突變是:c.4505C — T0
2.一種載體，其包含權利要求1的突變的C0L14A1基因； 例如，所述載體選自克隆載體和表達載體； 例如，所述載體還包含與所述突變的C0L14A1基因可操作地連接的表達控制序列，例如但不限于啟動子，增強子和終止子； 例如，所述載體還包含選擇標記。
3.一種宿主細胞，其包含權利要求1的突變的C0L14A1基因或權利要求2的載體。
4.權利要求1的突變的C0L14A1基因或權利要求2的載體或權利要求3的宿主細胞的用途，其用于產生PPPK動物模型，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產生PPPK動物模型。
5.診斷受試者是否患有PPPK或處于發展PPPK的風險中的方法，其包括， 1)獲得來自所述受試者的核酸樣品(例如，基因組DNA樣品或總mRNA樣品)； 2)在所述核酸樣品中確定C0L14A1基因中是否存在導致C0L14A1基因編碼功能異常的蛋白的非沉默突變；和 3) 如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有PPPK或處于發展PPPK的風險中； 例如，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種； 例如，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的外顯子區域； 例如，所述非沉默突變位于C0L14A1基因的第37個外顯子； 例如，所述非沉默突變位于:c.4505 ； 例如，所述非沉默突變是:c.4505C — T0
6.用于診斷PPPK的診斷劑，其包含能夠特異性擴增C0L14A1基因或其片段的引物，或能夠特異性檢測C0L14A1基因突變的探針，或能夠特異性識別突變的C0L14A1蛋白的抗體或其抗原結合片段； 例如，所述引物能夠特異性擴增C0L14A1基因的外顯子，優選第37個外顯子； 例如，所述引物的序列選自SEQ ID NO:73和74 ； 例如，所述引物是如SEQ ID NO:73和74所示的引物對; 例如，所述C0L14A1基因突變位于C0L14A1基因的外顯子，優選第37個外顯子，更優選地位于:c.4505 ； 例如，所述C0L14A1基因突變是c.4505C — T ； 例如，所述突變的C0L14A1蛋白包含氨基酸突變p.Prol502Leu ； 例如，所述引物、探針或抗體或其抗原結合片段是經標記的。
7.一種試劑盒，其包含權利要求6的診斷劑； 優選地，所述試劑盒還包含其他試劑，例如用于PCR的試劑(例如dNTP和聚合酶)，用于提取核酸的試劑，用于檢測所述抗體或其抗原結合片段的二抗。
8.權利要求6的診斷劑在制備用于檢測C0L14A1基因的突變和/或用于診斷PPPK的試劑盒中的用途。
9.用于治療PPPK的治療劑，其包含分離的野生型C0L14A1基因，或含有所述基因的載體，或野生型COL14AI蛋白，或特異性靶向突變的COL14AI基因的s iRNA，或特異性結合突變的C0L14A1蛋白的中和性抗體； 例如，所述野生型C0L14A1基因具有如SEQ ID NO:1所示的序列； 例如，所述突變的C0L14A1基因所包含的突變位于C0L14A1基因的外顯子，優選第37個外顯子，更優選地位于:c.4505,更優選地，所述突變是c.4505C — T ； 例如，所述突變的C0L14A1蛋白包含氨基酸突變p.Prol502Leu。
10.一種藥物組合物，其包含權利要求9的治療劑，和藥學上可接受的載體和/或賦形劑。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103571848SQ201210282602
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月10日 優先權日:2012年8月10日
【發明者】張學軍, 楊森, 孫良丹, 崔勇, 肖風麗, 張青, 肖晶晶, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請人:安徽醫科大學第一附屬醫院, 深圳華大基因科技有限公司