專利名稱：Celligen310生物反應器制備人二倍體細胞狂犬病疫苗工藝的制作方法
Cel I igen310生物反應器制備人二倍體細胞狂犬病疫苗工
-H-
1.發明領域本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種Celligen310)生物反應器制備人二倍體細胞狂犬病疫苗工藝。2.
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病，是世界上病死率最高的疾病，一般被攜帶病毒的動物咬傷后感染。一旦發病，死亡率為100%。狂犬病在世界范圍內廣泛分布，不同種族的人群對狂犬病均有普遍易感性，流行區域以亞洲、非洲和拉丁美洲為主。我國僅次于印度，為世界第二發病率高的國家。近年米，我國狂犬病疫情一直呈上升趨勢，病死數高居我國37種法定報告傳染病首位。幸運的是適當接種狂犬病疫苗對狂犬病也有近乎100%的保護率，提高人群和動物的疫苗接種率對控制狂犬病流行具有決定性意義。在條件許可的情況下對人群的普遍性預防性接種，可望避免由狂犬病引其的人員死亡。目前我國預防接種的疫苗絕大部分是由動物細胞作為基質生產而來。這些疫苗普遍存在局部過敏反應，有時會出現發熱等全身性副作用，甚至有潛在的致腫瘤危險。盡管狂犬病是高致死性疾病、疫苗接種為唯一的控制方法、對于被咬傷人員疫苗接種沒有絕對的禁忌癥。但是世界衛生組織不推薦人們在被咬傷前使用這些疫苗，推薦使用人二倍體細胞培養的疫苗作為暴露前的預防接種疫苗。人二倍體細胞狂犬疫苗(humandiploid cell rabies vaccine, HDCV)在所有現行使用的疫苗中已公認最為安全和有效。臨床藥理試驗證明HDCV可以迅速誘導人體特異性抗體的產生。HDCV是國際狂犬疫苗的金標準，是評價所有人用狂犬疫苗的標準疫苗。適應于暴露前免疫，初次免疫和定期加強免疫，暴露后預防接種。
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發明內容
本發明公開一種Celligen310生物反應器制備人二倍體細胞狂犬病疫苗工藝，采用Celligen310生物反應器培養人二倍體細胞，接種狂犬病毒PM毒株毒種，經過接種、培養、收集病毒濾液，再經過滅活、濃縮、純化，檢定合格后制成品疫苗。本發明的優點在于使用人二倍體細胞作為基質細胞，制備的疫苗與傳統動物源性基質細胞制備疫苗比較比較，后續純化制備工藝簡單，疫苗產品具有更大的安全性。使用Celligen310生物反應器制備疫苗，與傳統方法比較成本較低，更容易工業化生產。具體的，本發明涉及了一種Celligen310生物反應器制備人二倍體細胞狂犬病疫苗的制備方法，其包括如下步驟:1)復蘇培養人二倍體細胞為產毒細胞；2)PM株病毒種子制備，建立適應于二倍體細胞的PM株病毒種子，確認其免疫、遺傳和增殖特性；3)Celligen310生物反應器擴增培養人二倍體細胞，接種、培養以及收獲病毒原液；4)將病毒原液進行滅活、除菌、濃縮和純化；以及5)加入保護液，并檢定合格后制備成品疫苗。本發明所述的制 備工藝，產品質量標準以2010年《中國藥典》第三部狂犬病疫苗規程質量標準為基礎。疫苗主要技術指標:病毒滴度> 7.01gLD50/mL ;疫苗免疫劑量:0.5mL/人；抗生素殘留量:彡50ng/劑；牛血清殘留量:彡50ng/劑；熱原:彡50EU/mL ;疫苗pH:7.6 7.8熱穩定性:符合2010年藥典第三部標準，合格；疫苗效力:彡2.5IU/劑；無菌檢查:符合2010年藥典第三部標準，合格。支原體檢查:符合2010年藥典第三部標準，合格；異常毒性試驗:符合2010年藥典第三部標準，合格。鑒別試驗:合格。
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圖1為Celligen310生物反應器制備人二倍體細胞狂犬病疫苗工藝流程圖。
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具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。本實施例僅僅用于對本發明的說明，不構成對本發明的限制。實施例1:取凍存人二倍體細胞，37°C解凍，加入37 °C預熱的MEM培養基(Invitrogen)。1000RPM離心10分鐘，收集細胞，新用ImL完全培養基(MEM培養基加上10%胎牛血清、0.3%水解乳蛋白、l%NaHC03、2 mMOL谷氨酰胺溶液)懸浮，進行細胞計數，按1.5X IOVmL細胞接種到每個含IOmL完全培養基的25cm2細胞培養瓶。置于37°C，5%CO2相對濕度90%細胞培養箱培養。當細胞形成完全單層時，倒掉培養基，加入0.25%胰蛋白酶(Invitrogen) (PH7.6 7.8)，消 化到細胞單層表面出現針孔樣時加入IOmL MEM培養基吹到形成單細胞懸液，1000RPM離心10分鐘，收集細胞，ImL完全培養基懸浮，進行細胞計數，每個含OmL完全培養基的25cm2細胞培養瓶接種1.5 X 106/mL細胞，標明時間和世代，置于37°C，5% CO2相對濕度90%細胞培養箱培養。細胞形成完全單層時，常規消化制備單細胞懸液，按1: 2或1: 4進行細胞傳代，37°C培養。實施例2:PM株病毒種子制備狂犬病毒PM株購買于美國Wistar研究所。按照疫苗制備的要求，首先建立適應于人類二倍體細胞的PM適應病毒株。將上述方法傳代的細胞接種PM毒株，MOI為0.01 0.001，調整PH至7.6 7.8后放入33°C 35°C進行培養。96 120小時以后收獲病毒，取樣，用小鼠病內接種法檢查病毒滴度，其IgLD5tlAiL為彡7.0。鑒別試驗用小鼠腦內中和試驗鑒定毒種的特異性。將毒種作10倍系列稀釋，取適宜稀釋度病毒液與等量狂犬病病毒特異性免疫血清混合，同時設立正常血清對照組，試驗組與對照組的每個稀釋度分別接種11 13g小鼠6只，每只腦內接種0.03mL，觀察14天，中和指數應不低于500。病毒滴定取毒種作10倍系列稀釋，每個稀釋度腦內接種體重為11 13g小鼠至少6只，每只腦內接種0.03mL，觀察14天，病毒滴度應不低于7.01gLD5(l/mL。免疫原性檢查。用主種子批毒種制備滅活疫苗，腹腔注射體重為12 14g小鼠，每只0.5mL。7天后重復接種I次作為試驗組，未經免疫小鼠做對照組。第一次免疫后的第14天，試驗組和對照組分別用10倍系列稀釋的CVS病毒腦腔攻擊，每只0.03mL，每個稀釋度10只小鼠。保護指數應不低于100。
病毒滴度合格的毒種合并做各項檢定,合格后即為毒種。凍于后至_60°C保存。收獲的病毒從5代以后，每5代進行免疫原性檢查和DNA序列分析。選擇穩定代次作為主代毒種和工作種子。實施例3:Celligen310生物反應器擴增培養人二倍體細胞采用Celligen310生物反應器培養人二倍體細胞。經上面方法擴增的細胞接種到裝有完全培養基的Celligen310生物反應器中，置于37°C細胞培養。當細胞長滿以后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)對細胞表面進行沖洗。然后換入新的培養液，培養液調整pH至7.6 7.8。實施例4:接種病毒
接種人二倍體細胞適應PM株毒種的MOI為0.01 0.001。接種病毒后的細胞置33°C 35 °C進行培養。實施例5:收獲的病毒液。病毒培養96 120小時后收獲病毒培養液,取樣對病毒進行滴定。以灌注方法補充新的培養液，如此可多次收獲病毒，直至細胞脫落為止。實施例6:病毒滅活采用1: 4000的β -丙內酯滅活，2 8°C 72小時滅活病毒。檢驗滅活效果，將滅活的病毒液接種小鼠腦腔，并盲傳3代，當小鼠全部存活，說明病毒已完全被滅活。實施例7:病毒液濃縮、純化:收獲的病毒液用經過截留分子量300KD以上分子的超濾器(Minipore，USA)超濾濃縮。先并把病毒液濃縮到一定倍數，然后加入適量的PBS稀釋沖洗，然后濃縮到原倍數，再加入適量的PBS沖洗，如此反復4 6次，除去絕大部分殘留的牛血清蛋白。用Sepharose4ff (GE Healthcare Life Sciences)凝膠層析進一步去除疫苗中的小分子雜質與殘留的牛血清蛋白，用BSA ELISA檢測試劑盒(博生公司，無錫)檢測牛血清殘留量，應低于《國家藥典》規程< 50ng/劑的要求。然后加入0.1%人白蛋白作為疫苗保護液即為疫苗原液。取樣做無菌試驗、總蛋白含量、安全試驗、效力試驗等檢測。放置2 8°C保存。實施例8:疫苗的制備與分裝檢測合格后的疫苗原加入保護劑按2.5IU/劑分裝凍干。凍干后，抽樣進行檢定，各項指標合格后即為成品疫苗。本產品質量標準以2010年《中國藥典》第三部狂犬病疫苗規程質量標準為基礎。疫苗主要技術指標:病母滴度≥7.0lgLD50O疫苗免疫劑量:0.5mL/人。抗生素殘留量.≤50ng/劑。牛血清殘留量≤50ng/劑。熱原:<50EU。疫苗pH: 7.6 7.8。熱穩定性:符合2010年藥典第三部標準，合格。疫苗效力:≥2.5IU/劑。
無菌檢查:符合2010年藥典第三部標準，合格。支原體檢查:符合2010年藥典第三部標準，合格。異常毒性試驗:符合2010年藥典第三部標準，合格。鑒別 試驗:合格。
權利要求
1.一種狂犬病毒純化滅活度苗的制備方法，包括如下步驟:采用Celligen310生物反應器培養人二倍體W1-38或MRC-5(以下簡稱人二倍體細胞)作為為產毒細胞，以狂犬病毒PM株作為毒種，經過接種、培養、收集病毒濾液，再經過濃縮純化并加入保護液制備得到成品疫苗。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其中所述的狂犬病毒PM株為由美國Wistar研究所提供并許可用于生產的，所述的人二培體細胞毒種為通過人二倍體細胞傳代適應的狂犬病毒PM株毒種，所述毒種滴度按IgLD5tlAil法不低于7.0。
3.根據權利要求1所述的制備方法，所述狂犬病毒純化滅活度苗的具體培養方法為: 1)將人二倍體細胞在Celligen310生物反應器上培養，使之成為致密的單層細胞，然后接種病毒種子，即狂犬病毒PM株； 2)在33 35°C的適宜溫度下培養病毒，到期后，以灌注法多次收獲病毒； 3)收獲的病毒先利用連續流離心方法去除細胞雜質，再經超濾300KD超濾膜濃縮，然后利用蔗糖密度梯度離心純化，最后經4FF凝膠柱層析進一步純化； 4)純垢的病毒利用β-丙內酯72小時滅活； 5)過濾除菌后即為原液； 6)各項檢定合格后，加入保護劑 ，分裝凍干； 7)凍干后制品檢定合格后即為成品疫苗； 其中，將所述疫苗按照2010年《中國藥典》第三部狂犬病疫苗規程質量標準進行檢測，得到的疫苗主要技術指標為:病毒滴度7.0lgLD5tlAiL ;疫苗免疫劑量:0.5mL/人；抗生素殘留量50ng/劑；牛血清殘留量:50ng/劑；熱原50EU ;疫苗pH:7.6 7.8 ;熱穩定性符合2010年藥典第三部標準，合格；疫苗效力:^ 2.5IU/劑；無菌檢查:符合2010年藥典第三部標準，合格；支原體檢查:符合2010年藥典第三部標準，合格；異活毒性試驗:符合2010年藥典第三部標準，合格；鑒別試驗:合格。
全文摘要
本發明屬于生物制品領域，具體涉及一種使用Celligen310生物反應器培養人二倍本WI-38，MRC-5(以下稱為人二倍體細胞)為產毒細胞、以狂犬病毒PM株為毒種制備狂犬病疫苗的工藝。包括人二倍體細胞的復蘇；人二倍體細胞培養擴增；在人二倍體細胞上接種狂犬病毒PM株毒種；病毒種子馴化、接種、培養、收集病毒濾液，再經過滅活、純化、濃縮以及加入保護液等步驟制備成品疫苗。疫苗檢定指標符合2010版《中國藥典》標準。該工藝特征在于，使用Celligen310生物反應器培養制備人源二倍體細胞作為基質細胞，可以避免動物傳代細胞的外源污染因子和致瘤性。疫苗在制備過程中接種的病毒毒株為狂犬病毒PM株，免疫效果較傳統疫苗更好。使用該工藝制備的疫苗具有純度高、免疫效果好、安全性高的優點。
文檔編號C12N7/00GK103083654SQ20121030650
公開日2013年5月8日 申請日期2012年8月27日 優先權日2012年8月27日
發明者劉孝民, 劉培生 申請人:萬里明