專利名稱：一種低聚糖Lewis X的酶催化制備方法
技術領域：
本發明涉及低聚糖類化合物的酶催化制備方法，具體地說是lewis X(Gal-β -1，4-(Fuc-a-1, 3)-GlcNAc)的制備方法；該化合物的唾液酸衍生物SLex是細胞表面糖脂和糖蛋白的終端寡糖，在細胞相互識別作用中起至關重要的作用。
背景技術：
Lewis X是一個巖藻糖化的三糖抗原，廣泛分布于真核生物和某些細菌的細胞表面，是一個具有多種功能的聚糖，在許多生理和病理過程中發揮重要的作用。例如，唾液酸化的Lewis X,這個四糖表達于白血細胞如粒細胞和單核細胞,這種聚糖與多種腫瘤包括胰 腺癌、乳腺癌、結腸癌和肺癌等組織來源密切相關。含有Lewis X的聚糖還發現于具有傳染性的細菌幽門螺旋桿菌和寄生血吸蟲。已有文獻報道了 Lewis X的化學合成方法，由于糖分子中存在多個性質相似的羥基基團，同時糖苷鍵在形成過程中還可以產生a和β兩種異構體因此糖的合成化學中兩個最基本的問題一直是控制反應的區域選擇性和立體選擇性。因此，該合成方法收率很低，不適合于大規模生產。
發明內容
本發明的目的在于利用酶催化的方法來提供一種簡易、有效的低聚糖lewis X的制備方法。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案實現
本發明制備lewis X的方法,其制備過程為
QRzBr
pyridine BzO0 82AcOH β ￡ΟΒζ
14
31) (BnO)2POO-Et3NH+
2) H2, P d/C; cycloh&tylamine
GMP-morphoIjclste QP O3 ηο「οη ·-
HO ■
GDP-p-L-FucoseS
0^0H0uOH,CH
H0^v00^V-°H
-yt!-■■■■■■■.1.5h I NHAc
a-1,3 fu cosy Itransf erase
Im
HOm
I Lewis X即第一步以巖藻糖(化合物2)為原料，在吡啶條件下與苯乙酰氯反應，生成苯乙酰基保護的巖藻糖(化合物3);第二步，化合物3在溴化氫和乙酸條件下反應得到1-溴代產物(化合物4);第三步，化合物4與磷酸二芐酯三乙胺鹽反應，然后在pd-C/氫化條件下脫除芐基生成1-磷酸巖藻糖(化合物5);第四步，化合物5與GMP-嗎啡啉酯反應，嗎啡啉酯反應生成⑶P-L-巖藻糖(化合物6);第四步，化合物5在α -1，3-巖藻糖基轉移酶的作用下與N-乙酰化乳糖胺(化合物7)反應得到Lewis X (化合物I)。所述第一步中，保護基試劑為乙酸酐、乙酰氯、或苯乙酰氯，其中優選苯乙酰氯；所述第一步中的溶劑為吡啶。所述第一步中苯乙酰氯摩爾用量與巖藻糖的摩爾量之比為5-1 ;反應溫度為0°C ;反應時間為10-15小時，通常在12小時反應完成。所述第二步中，溴化試劑為氫溴酸的乙酸溶液；所用溴化氫摩爾用量與化合物4的摩爾量之比為3-1 ；反應溫度為0°C ;反應時間為3-5小時,通常在4小時反應完成。所述第三步反應中，磷酸化試劑為磷酸二芐酯三乙胺鹽；所述第三步反應中磷酸 化試劑的摩爾用量與化合物4的摩爾量之比為1.2-1 ;反應溫度為0°C;反應在氬氣條件下進行，反應時間為15小時。所述第三步反應中脫保護試劑為pd/C/H2和環己胺。所述第四步反應中，生成⑶P-fucose的試劑為GMP-嗎啡啉酯，所述反應在吡啶中進行；所述第四步反應中GMP-嗎啡啉酯的摩爾用量和化合物5的摩爾用量之比為O. 7-1 ；所述第四步反應中，反應溫度為室溫，通常在3-4天反應完成。所述第五步反應中，生成Lewis X的試劑為N-乙酰化乳糖胺，所述反應的催化劑為α -1, 3-巖藻糖基轉移酶；所述反應在Tris-HCl緩沖溶液中進行；所述反應溫度為37°C;所述反應時間為3-5小時。本發明的優點在于化合物I的化學合成步驟很長，并且收率很低，本發明通過一條全新的合成路線，以廉價易得的巖藻糖為原料，經過多步反應生成巖藻糖在生物體內的通用給他GDP-巖藻糖，然后在α -1, 3-巖藻糖基轉移酶的作用下與N-乙酰化乳糖胺反應可以很方便的得到Lewis X。
具體實施例方式下面通過具體的實施方式，對本發明做詳細的描述，但本發明不限于這些實例本身。一、化合物3的制備
L-巖藻糖(化合物2,4. O g, 24. 4 mmol)溶于卩比唳中(50 mL),攪拌下緩慢滴加苯乙酰氯(17. 2 g，122 mmol )，室溫攪拌反應過夜。TLC檢測反應完全后將混合物倒入冰水中，用二氯甲烷(100 mL)稀釋，分別用鹽酸(4 N)和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，有機相用無水硫酸鎂干燥后濃縮得化合物糖漿狀化合物3 (15 g)。二、化合物4的制備
將上述粗產物溶于乙酸(16 mL)中，用冰浴冷卻，加入溴化氫的乙酸溶液(16 mL)，混合物在室溫下攪拌反應4小時。混合物用二氯甲烷(100 mL)稀釋，然后用冰水和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，有機相用無水硫酸鎂干燥后濃縮得到1-溴代巖藻糖(化合物4yHNMR (CDCl3,400 MHz) δ 3. 80 (d, / = 6. 5 Hz, 3H), 4. 50 (dt, / = 6. 5,1. 0 Hz, 1H)，5. 63 (dd,J = 14. 0, 10. 4 Hz, 1H), 5. 85 (dd, / = 3. 4,1. 0 Hz, 1H)，6. 02 (dd, J = 10. 5, 3.5Hz, 1H), 6. 94 (d, / = 4. Ο, 1H)，7. 23-7. 65 (m, 15H)。三、化合物5的制備
化合物4(15 g)溶于干燥的二氯甲烷中，加入4A分子篩，攪拌15分鐘。加入磷酸二芐酯三乙胺鹽(25. 2 mmol)的二氯甲烷(15 mL)溶液和碳酸銀(8. 2 g，29. 7 mmol)。混合物在氮氣保護下攪拌反應2小時，過濾后濃縮。粗產物用硅膠柱提純得漿狀中間體(12.1 g，收率73%)。上述中間體溶于甲苯(100 mL)中，加入吡啶(20 mL)和三乙胺(15 mL)，然后加入Pd-C (10%，700 mg)，通氫氣反應5小時，過濾后濃縮得到泡沫狀產物12. 2 g。上述產物溶于甲醇中(40 mL)，加入環己基胺(40 mL)，加熱至回流反應4小時。反應完全后濃縮，除產物溶于水中，用氯仿萃取三次，水相濃縮、干燥，得白色化合物5 (6.3 g，收率63%)。1HNMR(D20,400 MHz) δ1. 07 (m, 2H)，1. 16 (d, / = 6. 8 Hz, 3H)，1. 24 (m, 8H)，1. 55 (m,2H),1. 70 (m, 4H),1. 88 (m, 4H)，3. 04 (m, 2H)，3. 41 (dd, /=9.9，7. 8 Hz, 1H)，
3.57 (dd, /=9.9，3.5 Hz, 1H)，3. 62 (dd, /=3.5，O. 9 Hz, 1H)，3. 71 (m, 1H)，
4.73 (t, /= 5.1 Hz, 1H)。四、化合物6的制備
化合物5 (3. 7 g)溶于吡啶(10 mL)中，氮氣保護下加入GMP-嗎啡啉酯(4. 3 g)的吡啶(10 mL)溶液，反應用核磁監控，反應結束后濃縮，殘余物溶于少量水中，然后用交聯葡聚糖柱G-1O (50*2.5 cm)分離，得到漿狀⑶P-巖藻糖的鋰鹽(1. 44 g，收率43%)。1HNMR (D2O,400 MHz) δ1. 14 (d, / = 6. 7 Hz, 3H), 3. 48 (dd, J = 10. O, 7.9 Hz, 1H)，3. 58 (dd,J = 10. O, 3. 4 Hz, 1H)，3. 63 (m, 1H)，3. 69 (m, 1H)，4. 16 (m, 2H)，4. 27 (m, 1H)，
4.44 (dd, / = 4. O, 3.4 Hz, 1H)，4. 65 (t, / = 5. 5 Hz, 1H)，4. 84 (t, / = 8. O Hz,1H), 5. 81 (d, /= 5.8 Hz, 1H)，8. O (s, 1H)。FABMS: m/z 594 [M-Li]'四、化合物I的制備
化合物6 (O.1 mmol)溶于Tris-HCl緩沖溶液(5 mL, IOOmM, pH 7. 5)，加入N-乙酰化乳糖胺(化合物7,0.1 mmol),硫酸猛(20 mM) ( α-1，3-巖藻糖基轉移酶(2 units),反應混合物在37V反應3-4小時。加入乙醇終止反應， 離心除去不溶物，濃縮除去乙醇，水相凍干后用Bio-GelP2膠分離，凍干后得到產物501 mg，收率95%。MALD1-TOF MS C20H35NO15(529.48) (m/z), 568 [M+K]+。
權利要求
1.一種低聚糖lewis X的酶催化制備方法，以L-巖藻糖為原料，包括如下步驟(a)、L-巖藻糖用苯乙酰基保護羥基；(b)、苯乙酰基保護的L-巖藻糖與溴化氫作用生成1-溴代巖藻糖；(c)、l-溴代巖藻糖與磷酸二芐酯三乙胺鹽反應，然后在Pd-C/氫化條件下脫除芐基生成1-磷酸巖藻糖；(d)、l-磷酸巖藻糖中間體脫除苯乙酰基保護基后與GMP-嗎啡啉酯反應，嗎啡啉酯反應生成⑶P-L-巖藻糖；Ce),⑶P-L-巖藻糖在α -1, 3_巖藻糖基轉移酶的作用下與N-乙酰化乳糖胺反應得到 Lewis X0
2.根據權利要求1所述的一種低聚糖lewisX的酶催化制備方法，其特征在于步驟 Ca)中的保護基為苯乙酰基，所用試劑為苯乙酰氯，反應溶劑為吡啶，所述保護反應溫度為 (TC，所述保護反應時間為7-12小時。
3.根據權利要求1所述的一種低聚糖lewisX的酶催化制備方法，其特征在于步驟(b)中的溴代反應在乙酸中進行，所用的溴代試劑為溴化氫，所述溴代反應溫度為室溫，所述硝化反應時間為3-5小時。
4.根據權利要求1所述的一種低聚糖lewisX的酶催化制備方法，其特征在于步驟(c)中1-溴代巖藻糖與磷酸二芐酯三乙胺鹽反應在干燥的二氯甲烷中進行，所述反應的試劑為碳酸銀，反應溫度為0°C ;
5.根據權利要求1所述的一種低聚糖lewisX的酶催化制備方法，其特征在于步驟 Cd)中1-磷酸巖藻糖與GMP-嗎啡啉酯反應在干燥的吡啶中進行，所述反應溫度為室溫，反應時間為7-12小時；
6.根據權利要求1所述的一種低聚糖lewisX的酶催化制備方法,其特征在于步驟(e)中生成三聚糖Lewis X的反應在Tris-HCl緩沖溶液中進行，所述反應所用的酶為 α-1，3-巖藻糖基轉移酶，所述反應溫度為37°C ；
7.根據權利要求1所述的一種低聚糖lewisX的酶催化制備方法，其特征在于步驟(e)中生成三聚糖Lewis X產物通過Bio-Gel P2色譜柱提純。
全文摘要
本發明涉及低聚糖類化合物的酶催化制備方法，具體地說是lewis X(Gal-β-1,4-(Fuc-α-1,3)-GlcNAc)的制備方法；該化合物的唾液酸衍生物SLex是細胞表面糖脂和糖蛋白的終端寡糖，在細胞相互識別作用中起至關重要的作用。其以L-巖藻糖為原料，經過保護，1-位磷酸化，然后與GMP-嗎啡啉酯反應生成巖藻糖的通用給體GDP-L-巖藻糖；GDP-L-巖藻糖在α-1,3-巖藻糖轉移酶的作用下與N-乙酰化乳糖胺反應得到Lewis X。該方法工藝簡便，借助轉移酶的作用，以簡單易得的糖為原料，立體專一性的得到三聚糖Lewis X。
文檔編號C12P19/18GK102994590SQ20121030866
公開日2013年3月27日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者胡天順, 林海平 申請人:蘇州格蘭斯生物科技有限公司