專利名稱：檢測egfr基因突變的引物、探針及其試劑盒和使用方法
技術領域：
本發明涉及基因突變檢測領域，具體講，涉及一種檢測EGFR基因突變的引物、探針及其試劑盒和使用方法。
背景技術：
傳統化療主要針對細胞的DNA，這種作用往往缺乏特異性，在殺死腫瘤細胞的同時，也“錯殺”了很多正常細胞。靶向治療和以前的化療完全不同。腫瘤的發病有多種機制參與，而這些機制往往是腫瘤細胞所特有的。靶向治療就是針對腫瘤發病機制中某特有的信號傳導通路或者某一發病機制，采用單克隆抗體、小分子物質將它打斷，從而達到治療腫瘤的目的，而對正常細胞作用卻很輕微。
靶向治療的特異性很強，只針對癌細胞，沒有化療常見的副作用，不會引起患者掉頭發，不會引起惡心、嘔吐。常見的副作用是皮疹和腹瀉，患者大多可以耐受。靶向治療多數只需每天口服治療一粒，患者可以在家里進行，安全性較好，有望恢復往日的生活，部分患者甚至能重返工作崗位。靶向藥與常規化療藥的另一個不同在于其用藥的判斷上。醫生在給病人使用常規藥物時，一般是根據病人的身體狀況、癥狀等條件選擇用藥，而藥物的有效性要通過一段時間的治療觀察才能判定。而靶向藥物通過與腫瘤細胞的特征性位點結合，干預控制腫瘤細胞生長增殖的基因信號傳導通路；而腫瘤細胞是有多樣性的，并非所有腫瘤細胞都具有一樣的特征性位點，具有個體差異，因此對于某些特定的靶向藥物，在使用前檢測患者體內是否有符合條件的基因，判斷其腫瘤細胞上是否有符合條件的位點，就可以預知該藥物是否會奏效，這從臨床上節省了金錢和時間。這樣的診斷模式被稱為“個體化診斷”。對于靶向藥物來說，使用前進行“個體化診斷”是保證安全、有效用藥的必要步驟。表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)主要位于細胞膜上，屬受體酪氨酸激酶家族。EGFR被配體激活后啟動胞內該通路上的信號傳導，經過細胞質中銜接蛋白、酶的級聯反應，調節轉錄因子激活基因的轉錄，指導細胞遷移、黏附、增值、分化和凋亡。研究表明，在許多實體腫瘤中存在EGFR信號轉導通路上的基因發生體細胞突變及表達異常，從而導致腫瘤細胞無限制的擴增和遷移。因此，近年以EGFR和EGFR信號通路中關鍵的組分為靶標的分子靶標檢測及靶向治療成為國際腫瘤界個體化醫療關注的焦點。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，吉非替尼和厄羅替尼已被FDA批準用于治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)。這些靶向藥物已應用于晚期和不適宜傳統治療方案的NSCLC患者的臨床治療。在這類藥的早期使用過程中，曾發現其有效率并不高，甚至因此而被FDA叫停；對臨床資料的統計表明，這兩種靶向藥物更適合東方人、不吸煙者、女性和腺癌/肺泡癌患者。隨后，進一步研究結果表明，EGFR基因外顯子的突變(體細胞突變)是患者對此類靶向藥物有效的必要前提。美國國家癌癥綜合網絡(NCCN) 2009年版的臨床指南中明確指出EGFR突變，尤其是外顯子19缺失突變與腫瘤對TKIs如吉非替尼的敏感度有重要關系，所以EGFR基因突變的檢測有利于為這些患者選擇最好的治療方法。如圖I所示。目前認為EGFR突變的位點主要集中在18、19、20和21外顯子，其中19號外顯子和21號外顯子的突變最常見，占整個突變的90%左右，21號外顯子主要集中在第858為密碼子的改變，但19號外顯子存在多種缺失突變，而且不同的突變，病人對TKI的療效是不同的。此外，最新的研究也表明，TKI的療效不僅與是否有EGFR基因19號外顯子突變相關，還與基因突變的量有密切關系。廣州的吳一龍教授利用兩種敏感度不同的檢測方法，一種是用測序檢測EGFR突變，另一種是用熒光定量PCR檢測EGFR突變，分別篩查出兩組肺癌病人，都給予靶向藥物治療。結果發現，第一組即基因突變量大的肺癌病人，療效特別好，而第二組即突變量小的病人療效則很一般，差別非常明顯。這個研究將改變肺癌治療策略。目前，對肺癌病人，一般先查有沒有EGFR突變，如果有突變，就建議吃靶向藥物。今后要對有突變的病人進一步分類，根據突變量的大小，決定是否先服用靶向藥物，制定個性化治療方 案。專利ZL200910111499. 2公開了一種用于檢測人類EGFR基因突變的引物、探針，還公開了含有該引物、探針的試劑盒，該試劑盒僅能檢測出以下29種EGFR突變，并不能對突變的類型，尤其是EGFR基因第19號外顯子的突變類型進行分析。此外，也不能對基因突變的量的多少進行判別。為此，本發明提出了一種檢測EGFR基因突變檢測試劑盒，不僅能檢測出31種EGFR基因相關的突變，而且能通過對內參反應液后續的測序反應，在不經過電泳分析的情況下，對EGFR基因19號外顯子不同的突變類型進行判別，并有可能發現新的突變。更重要的是，本發明提出了一種新型的對突變量的判斷標準，通過檢測的突變反應液和內參反應液的差值，對突變的量進行半定量的判斷，從而指導臨床用藥。
發明內容
本發明的首要發明目的在于提出一種檢測EGFR基因突變的引物和探針。本發明的第二發明目的在于提出含有該引物和探針的試劑盒。本發明的首要發明目的在于提出該試劑盒的使用方法。為了完成本發明的目的，采用的技術方案為本發明涉及一種檢測人EGFR基因突變的引物和探針，其中，所述引物和探針的核苷酸序列為(I)用于檢測18號外顯子突變的引物和探針為由SEQ ID NO I所示的上游引物，由SEQ ID NO 2所示的下游引物和由SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 27所示的探針；(2)用于檢測19號外顯子突變的引物和探針為由SEQ ID NO 4所示的上游引物，由SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 13所示的下游引物，由SEQ ID NO 14所示的探針;(3)用于檢測20號外顯子突變的引物和探針為由SEQ ID NO 15 SEQ IDNO 17所示的上游引物，由SEQ ID NO 18所示的下游引物，由SEQ ID NO 19所示的探針；
(4)用于檢測21號外顯子突變的引物和探針為由SEQ ID NO 20所示的上游引物，由SEQ ID NO 21所示的下游引物，由SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 23所示的探針；(5)作為內參的引物和探針由SEQ ID NO 24所示的上游引物，由SEQ IDNO 25所示的下游引物，由SEQ ID NO 26所示的探針；其中，所述探針的核苷酸鏈的5’端標記有FAM，3’端標記有TAMRA。本發明的第一優選技術方案為所述的試劑盒的組成為所述的試劑盒包括核酸擴增試劑、對照品和測序試劑，其中，所述的核酸擴增試劑包括表I :
權利要求
1.一種檢測人EGFR基因突變的引物和探針，其中，所述引物和探針的核苷酸序列為 (1)用于檢測18號外顯子突變的引物和探針為由SEQID NO I所示的上游引物，由SEQ ID NO 2所示的下游引物，由SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 27所示的探針； (2)用于檢測19號外顯子突變的引物和探針為由SEQID NO 4所示的上游引物，由SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 13所示的下游引物，由SEQ ID NO 14所示的探針； (3)用于檢測20號外顯子突變的引物和探針為由SEQID NO 15 SEQ ID NO 17所示的上游引物，由SEQ ID NO 18所示的下游引物，由SEQ ID NO 19所示的探針； (4)用于檢測21號外顯子突變的引物和探針為由SEQID NO 20所示的上游引物，由SEQ ID NO 21所示的下游引物，由SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 23所示的探針； (5)作為內參的引物和探針由SEQID NO 24所示的上游引物，由SEQ ID NO 25所示的下游引物，由SEQ ID NO 26所示的探針； 其中，所述探針的核苷酸鏈的5’端均標記有FAM，3’端均標記有TAMRA。
2.一種含有權利要求I所述檢測人EGFR基因突變的引物和探針的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的組成為所述的試劑盒包括核酸擴增試劑、對照品和測序試劑，其中，所述的核酸擴增試劑包括
3.根據權利要求2所述的檢測EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述各組核酸擴增試劑中各成分的含量為含有6mmol/L引物各lul、4mmol/L探針各lul、5mM的dNTPsO. 5ul、10Xbuffer2. 5ul，加水至 21 μ I ;所述的 EGFR 酶液中含有 Taq 酶 5u/ 管、UNGO. 5u/ 管。
4.根據權利要求2所述的檢測EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的對照品包括
5.根據權利要求2所述的檢測EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述的測序試劑包括
6.一種權利要求2 5所述的檢測EGFR基因突變檢測試劑盒的使用方法，其特征在 于， (1)PCR熒光檢測 a.樣本處理提取人類基因組DNA;提取完的DNA-20°C保存； b.擴增試劑準備從試劑盒中取出相應的PCR反應液，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心IOs ;按每管21ul反應液和Iul酶液,分裝于PCR反應管中； c.加樣從對照品或樣本處理液中分別取3ul，加至裝有上述PCR反應混合液的離心管中，蓋緊管蓋、將其移至檢測區； d.PCR擴增 ABI PRISM 熒光 PCR 檢測儀擴增條件42°C,5min ；94°C,3min ;94°C，15sec ；60°C,60sec ;共40個循環；反應體系為25ul ;在PCR循環第二步60°C時收集熒光信號；檢測通道為FAM-TAMRA，參比熒光設定為none ； Stratagene 突光 PCR 檢測儀擴增條件42 °C，5min ；94 °C，3min ；94 °C，45sec ；60 °C，80sec ;共40個循環；反應體系為25ul ;在PCR循環第二步60°C時收集熒光信號；檢測通道為 FAM ； e.檢測用chromas2.23軟件自動處理和分析數據； (2)EGFR基因19外顯子測序檢測對EGFR(exonl9)為陽性的突變標本，并且滿足內參基因的(^值< 30、且相關基因與內參基因Ct值差值< I，對該標本進打測序。
7.根據權利要求6所述的檢測EGFR基因突變檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述的檢測結果的判定方法為 (I)、有效性判定 A.陰性對照有效性判定 對于 EGFR (exonl8) PCR 反應液管、EGFR(exon20)PCR 反應液管、EGFR(exon21)PCR 反應液管、內參基因PCR反應液管CT值均彡38或顯示“Undet”判定為有效； 對于EGFR(exonl9) PCR反應液管CT值> 38或顯示“Undet”判定為有效；或相關檢測基因與內參基因Ct值差值> 10判定為有效； B.陽性對照有效性判定 對于EGFR(exonl8)反應液管、EGFR(exon20)反應液管、EGFR(exon21)反應液管Ct值均< 36判定為有效； 對于EGFR(exonl9)反應液管、內參基因反應液管(^值< 36，且相關檢測基因與內參基因Ct值差值< 1，判定為有效；內參基因測序圖清晰，判定enonl9為純合缺失突變； (2)結果判定 A.PCR檢測結果判定 對于EGFR(exonl8)反應液管、EGFR(exon20)反應液管、EGFR(exon21)反應液管 ①相關檢測基因Ct值<38,且相關基因與內參基因Ct值差值< I ;判定該相關檢測基因中有突變； ②相關檢測基因Ct值<38，且相關基因與內參基因Ct值差值> I ;判定存在少量EGFR突變； ③相關檢測基因Ct值彡38或顯示“Undet”，且內參基因Ct值<38. O ;判定該相關檢測基因中無突變或突變低于最低檢出限； ④相關檢測基因Ct值>38或顯示“Undet”，且內參基因Ct值> 38或顯示“Undet”;需增加取樣量重新抽提后進行檢測； 對于EGFR(exonl9)反應液管 ①相關檢測基因Ct值>38或顯不“Undet”,且內參基因Ct值〈38. O ;或標本的相關檢測基因Ct值< 38，且相關基因與內參基因Ct值差值> 10 ;判定該相關檢測基因中無突變或突變低于最低檢出限； ②相關檢測基因Ct值<38,且相關基因與內參基因Ct值差值< I ;判定該相關檢測基因中有突變； ③相關檢測基因Ct值<38，且相關基因與內參基因Ct值差值在I 10之間；判定存在少量EGFR (exonl9)突變； ④相關檢測基因Ct值>38或顯示“Undet”，且內參基因Ct值> 38或顯示“Undet”;判定為需增加取樣量重新抽提后進行檢測； B.EGFR基因19號外顯子突變測序檢測結果判定 運行ChiOmas程序，對測序得到的序列進行分析首先刪除不穩定的測序區域及內含子區域，然后將測序得到的序列與正常19外顯子的氨基酸序列K745 P753進行對比，如果不存在缺失，則為野生型；反之，則為突變型。
全文摘要
本發明涉及基因突變檢測領域，具體講，涉及一種檢測EGFR基因突變的引物、探針及其試劑盒和使用方法。本發明的試劑盒能檢出含0.1-1％EGFR基因突變DNA的樣本、對含10％EGFR19號外顯子基因突變DNA樣本，通過測序能準確分型；本發明的試劑盒靈敏度高，最低檢出限為5拷貝基因，并能對EGFR基因突變的定性檢測，給出不同的靈敏度參考范圍，以幫助臨床判斷突變量的多少，確定最終診療方案能對不同突變。
文檔編號C12N15/11GK102851375SQ201210334208
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者熊慧, 程新建, 謝立群, 陳嘉錚, 包文靜, 陶慧卿, 丁璐, 徐任, 占閩寧, 楊青喜 申請人:上海源奇生物醫藥科技有限公司