專利名稱：一種面包乳桿菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物菌株，特別涉及一種面包乳桿菌菌株及其應用。
背景技術：
皂苷的毒性主要表現為溶血性，一般認為，溶血性是其苷元可以與紅細胞壁上膽甾醇結合生成不溶于水的復合物沉淀，破壞細胞滲透壓，使紅細胞發生崩解，進而導致溶血現象。皂苷有無溶血活性與皂苷元有關，活性強弱與糖分子的大小、糖分子之間的連接、糖分子上的取代基等有關，此外還與皂苷的濃度有關。 茶皂素的結構如附圖I所示，屬于三萜類皂苷，由糖體、配基和有機酸組成。從分子結構看，茶皂素是一種非離子表面活性劑。其親水基團是強電負性的含氧基團組成，這些基團集中在茶皂素的糖體配體，有機酸配體及皂苷配基的連接部位，構成親水部分。其中配基是由非極性的碳氫環鏈構成，在水溶液中呈現憎水的傾向，成為親油的主體，所以茶阜素的結構分為親水和親油兩部分。Sobolewska等在發表于2010年9月(9卷,3期)《Phytochemistry Review》(植物化學評論)425-474 頁的《Saponins as cytotoxicagents a review》(綜述阜苷一細胞毒素)一文中稱利用酶解法去除阜苷的糖體配體，會降低皂苷的溶血性。酶水解工業化應用成本較高，如能利用微生物發酵來降低茶籽柏的毒性，將更有工業化應用前景。
發明內容
本發明的目的在于提供一種面包乳桿菌菌株，以及利用該菌株進行茶籽柏固態發酵脫毒的方法，經發酵脫毒后的茶籽柏溶血作用明顯下降，降低了茶籽柏的毒性。為解決上述問題，本發明采用以下技術方案一種面包乳桿菌菌株，所述菌株的分類命名為面包乳桿菌(Lactobacilluscrustorum)，保藏編號為CGMCC No. 6304,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰兩路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期為2012年6月28日。所述面包乳桿菌菌株的16s rDNA堿基序列如SEQ ID NO 1所示。本發明還公開了所述面包乳桿菌菌株的篩選和應用于茶籽柏發酵脫毒的方法，包括以下步驟I、種子培養將所述面包乳桿菌菌株于MRS固體培養基上涂布，然后于37°C厭氧培養2-3天，挑取單菌落接種到種子培養基中，繼續37°C培養24h，使菌液的0D_值達到
0.8，備用，所述種子培養基成分為蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母抽提物5. 0g，纖維二糖 20. Og,吐溫-80lml，檸檬酸三銨 2. 0g，K2HP042. 0g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g，MnSO4 ·2Η20 0. 05g，蒸懼水1000ml。2、茶籽柏9g，加入含葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)和硫酸銨2% (w/w)的pH5. O的磷酸鹽緩沖溶液7. 2ml，混合均勻后高壓滅菌備用，得到未發酵的固體培養基。
3、按接種量10% (菌液/茶籽柏，ml/g)將步驟I中經種子培養后的所述面包乳桿菌菌株接種于步驟2所述未發酵的固體培養基中，固液比I : 0.8( 八)，371發酵3611，得發酵的固體培養基。4、茶籽柏發酵脫毒往步驟3中所述發酵的固體培養基中加入50ml70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉蒸發濃縮，濃縮至干，將所得產物稱重并用生理鹽水配制成100 μ g/ml的茶皂素固形物溶液A，備用；往步驟2中所述未發酵的固體培養基中加入50ml70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉蒸發濃縮，濃縮至干，將所得產物稱重并用生理鹽水配制成100 μ g/ml的茶皂素固形物溶液B，作為對照，備用。5、溶血實驗驗證發酵效果(I)取血將肝素鈉和裝有生理鹽水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75% (v/v)酒精對動物的取血部位進行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素鈉溶液，抗凝Iml血液不少于15IU肝素鈉；用注射器從動物靜脈中取血后，去除針頭，將血慢慢推到裝有冰生理鹽水的試管中，制得血樣。·(2)血樣處理將所述血樣于4°C冷凍離心，300rmp/5min ;離心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4°C生理鹽水，用移液槍輕吹，使血溶解；重復本步驟至所述血樣上清無色，然后用生理鹽水稀釋到2% (v/v)，得稀釋后的血樣。(3)溶血實驗分別取所述茶皂素固形物溶液A和B各40μ 1、60μ 1、80μ I、100μ I和120 μ 1，分別用生理鹽水定容至500 μ 1，再分別加入500 μ I所述稀釋后的血樣，37°C溶血Ih，IOOOOrpm離心5min，從各管中取上清液600 μ 1，混勻后，于540nm測定OD，空白對照為500 μ I生理鹽水和500 μ I所述稀釋后的血樣的混合液。本發明的優點是利用面包乳桿菌發酵的茶籽柏溶血作用明顯下降，降低了茶籽柏的毒性，從而彌補了茶籽柏在冷血動物飼料應用方面的不足。
圖I為茶皂素結構圖Rp R2 :反(側)白芷酸和醛酸；R1 = CHO, CH2OH, CH3 ；R2 = CHO, CH3。圖2為發酵前后茶籽柏提取物的溶血效果。
具體實施例方式實施例I :I.配制培養基平板培養(MRS固體培養基)蛋白胨lO.Og，牛肉膏lO.Og，酵母抽提物5.0g，葡萄糖 20. Og,吐溫-801ml,乙酸鈉 5g，檸檬酸三銨 2. 0g, K2HP042. 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2g，MnSO4 · 2H20 0. 05g，碳酸隹丐IOg,瓊脂15g,蒸懼水1000ml。121°C滅菌，倒平板。種子培養蛋白胨10.0g，牛肉膏10. 0g，酵母抽提物5. 0g，纖維二糖20. Ogji:溫-801ml，檸檬酸三銨 2. Og, Κ2ΗΡ042· 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2g，MnSO4 · 2H20 0. 05g,蒸餾水IOOOml02.茶籽柏固態發酵
取100 μ L保藏號為CGMCC No. 6304的面包乳桿菌菌液，于MRS固體培養基上涂布，將涂布好的平板37°C厭氧培養2-3天，挑取單菌落接種到種子培養基中，繼續37°C培養24h，使菌液的OD6tltl值達到O. 8，備用。取部分脫去茶皂素的茶籽柏(含2. 3% (w/w)茶皂素)9g，加入7. 2ml的pH5. O磷酸鹽緩沖溶液(添加葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)、硫酸銨2% (w/w))。攪拌均勻后12rC，15min高壓滅菌，備用，得到未發酵的固體培養基。在超凈臺中移取O. 9ml經種子培養后的菌液于上述未發酵的固體培養基中，攪拌均勻，真空脫氣，密封，置于37°C恒溫培養36h，得發酵的固體培養基。3.提取茶皂素 往發酵的固體培養基中加入50ml 70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉蒸發濃縮，濃縮至干，將所得產物稱重并用生理鹽水配制成茶皂素固形物濃度為100 μ g/ml的溶液A，備用；往未發酵的固體培養基中加入50ml 70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉蒸發濃縮至干，將所得產物稱重并用生理鹽水配制成茶皂素固形物濃度同樣為100 μ g/ml的溶液B，作為對照，備用，所述茶皂素的結構如圖I所示。4.溶血實驗驗證發酵效果(I)取血將肝素鈉和裝有生理鹽水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75% (v/v)酒精對動物取血部位進行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素鈉溶液，抗凝Iml血液不少于15IU肝素鈉；用注射器從動物靜脈中取血后，去除針頭，將血慢慢推到裝有冰生理鹽水的試管中。(2)血樣處理將血樣于4°C冷凍離心，300rmp/5min ;離心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4°C生理鹽水，用移液槍輕吹，使血溶解；重復上述實驗至血樣上清無色，將血樣用生理鹽水稀釋到2% (v/v)，得稀釋后的血樣。(3)溶血實驗分別于上述稀釋后的血樣500 μ I中分別添加上述溶液A和B各40μ 1、60μ 1、80μ 1、100μ I和120 μ 1，用生理鹽水補充至總體積為1ml，于37°C溶血Ih后，IOOOOrpm離心5min,從各管中取上清液600 μ I，混勻后，于540nm測定0D,空白對照為500 μ I生理鹽水和500 μ I所述稀釋后的血樣的混合液。OD表示被檢測物吸收掉的光密度。纖細胞溶血量越高，則離心后的血樣顏色越深，血樣的OD54tl越高，因此可以用OD值來反應溶血量。計算半數溶血量(HD5tl),即表示在規定時間內，通過茶皂素作用，使一定量的血紅細胞半數破裂所需最小茶皂素的量。即OD54tl值達到完全溶血時的50%時所需要茶皂素的量。實驗結果如附圖2所示。從圖上可明顯看出發酵后的茶籽柏溶血效果有明顯降低，未發酵茶籽柏的HD5tl為7. 96 μ g，發酵后的茶籽柏的HD5tl為13. 18 μ g，發酵前后HD5tl值增加了 65. 58%oHD50 = (13. 18-7. 96) /7. 96 X 100%= 65. 58 %。
權利要求
1.一種面包乳桿菌菌株，其特征在于，所述菌株的保藏編號為CGMCCNo. 6304。
2.如權利要求I所述的面包乳桿菌菌株在茶籽柏發酵脫毒中的應用。
3.一種應用權利要求I所述的面包乳桿菌菌株進行茶籽柏發酵脫毒的方法，包括以下具體步驟 (1)種子培養將所述面包乳桿菌菌株進行種子培養，使菌液的0D_值達到O.8，備用； (2)按固液比I: O. 8(w/v)往茶籽柏中加入含葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)和硫酸銨2% (w/w)的pH5. O的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后高壓滅菌備用，得到未發酵的固體培養基； (3)將經種子培養后的所述面包乳桿菌菌株接種于(2)中所述未發酵的固體培養基中，37 °C發酵36h，得發酵的固體培養基； (4)茶籽柏發酵脫毒往(3)中所述發酵的固體培養基中加入乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉蒸發濃縮，濃縮至干，制得脫毒的茶籽素。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述種子培養的具體操作為將所述面包乳桿菌菌株于MRS固體培養基上涂布，然后于37°C厭氧培養2-3天，挑取單菌落接種到種子培養基中，繼續37°C培養24h，使菌液的OD6tltl值達到O. 8，備用，所述種子培養基成分為蛋白胨10. Og，牛肉膏10. Og，酵母抽提物5. Og，纖維二糖20. 0g，吐溫-801. 0ml，檸檬酸三銨2. Og,Κ2ΗΡ042· Og, MgSO4 · 7Η20 O. 2g, MnSO4 · 2H20 0. 05g，蒸餾水 1000ml。
5.如權利要求3所述的方法，其中(3)中所述菌株的接種量為10%(ml/g)。
6.如權利要求3所述的方法，其中(4)中所述乙醇的濃度為70%(v/v)。
全文摘要
本發明涉及一種面包乳桿菌菌株及其應用，所述的菌株面包乳桿菌(Lactobacillus crustorum)，保藏編號為CGMCC No.6304，本發明還涉及將所述菌株用于茶籽粕的固態發酵脫毒的方法，具體步驟為(1)斜面培養；(2)種子培養；(3)固態發酵；本發明的有益效果是利用面包乳桿菌發酵的茶籽粕溶血作用明顯下降，降低了茶籽粕的毒性，從而彌補了茶籽粕在冷血動物飼料應用方面的不足。
文檔編號C12N1/20GK102965301SQ20121035913
公開日2013年3月13日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者張建華, 尹麗茸, 黃蓓, 吳秉宇, 李雙雙, 林立 申請人:上海交通大學, 福建天生農業股份有限公司