專利名稱：一種γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和酶工程領域，具體涉及一種固定化酶及其制備方法和應用。
背景技術：
y -谷氨酰轉肽酶(Y -glutamyltranspeptidase, GGT, EC 2. 3. 2. 2)是生物體內谷氨酰循環中的關鍵酶，可特異性催化Y-谷氨酰基轉移至受體分子，得到新的含Y-谷氨 酰基的化合物。通過改變受體種類可獲得不同的谷氨酰化合物，如催化合成藥物或藥物的前體，如L- Y -谷氨酰-L-多巴，它是帕金森綜合癥的前體藥物；谷胱甘肽，其在臨床上用于肝病的輔助治療、有機物及重金屬的戒毒等。由于其催化具有位點特異性和光學選擇性強，無需對反應物進行側鏈保護和脫保護，無需輔酶、反應過程中也不消耗ATP等優點，而成為工業生物催化領域的研究熱點。由于Y-谷氨酰轉肽酶在堿性(pH>9. O)條件下已發生亞基解聚，從而導致酶活的不可逆下降，限制了其在工業合成領域的應用。目前，已有的固定化方法對于提高其PH穩定性的作用有限。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶，可以實現重組Y-谷氨酰轉肽酶的一步純化-固定化，并提高重組Y-谷氨酰轉肽酶的穩定性，降低制備谷氨酰化合物的合成工藝成本。本發明還要解決的技術問題是提供上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶固定化酶的制備方法。本發明最后要解決的技術問題是提供上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的應用。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下一種Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶，它包括酶、固定所述酶的載體和包覆材料，所述的酶為Y-谷氨酰轉肽酶，所述的載體為鎳親和載體，所述的包覆材料為聚乙烯亞胺。其中，所述的鎳親和載體為Ni Sepharose 6 Fast Flow親和載體，其購自GEhealthcare公司，同類鎳親和載體均適用。上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，將鎳親和載體，加入含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液中，于4 45°C下振蕩反應I 6h后，將液體濾出；固體顆粒用pH7. O 9. O的含有200mmol/L咪唑的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用pH7. O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH7. O 9. O的O. 2 1%(ν/ν)的聚乙烯亞胺水溶液，于4 45°C震蕩反應12 24h后，固體顆粒再用ρΗ7· O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出，即制得Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶。上述Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，優選的是，將鎳親和載體，加入含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液中，于4°C下振蕩反應Ih后，將液體濾出，固體顆粒用PH8. O的含有200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH8. O的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH7. O的O. 2%(v/v)的聚乙烯亞胺水溶液，于4 V震蕩反應12h后，固體顆粒再用pH8. O的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出，即制得Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶。其中，所述的細胞破碎液，Y-谷氨酰轉肽酶的酶活為10U/mL以上。其中，其·特征在于對每g濕質量的鎳親和載體，含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液加入體積為10 30mL,優選為10mL。其中，對每g濕質量的鎳親和載體，加入pH7. O的O. 2%(v/v)的聚乙烯亞胺水溶液體積為10 30mL,優選為10mL。其中，制備得到的Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶在ρΗ7· O 9. O的30 60mmol/LTris-HCl緩沖液中保存。上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶在催化制備Y-谷氨酰基化合物中的應用。通過本發明方法制備得到的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶可用于催化制備系列Y-谷氨酰基化合物。有益效果本發明充分利用鎳親和載體對于重組Y -谷氨酰轉肽酶上His-Taq標簽的特異性吸附，直接從細胞破碎液中吸附重組Y-谷氨酰轉肽酶，再用含有咪唑的緩沖液洗去雜質，達到純化-固定化一步完成。在固定化酶的基礎上包覆一層聚乙烯亞胺高分子，大大提高固定化酶在不同PH條件下，尤其是堿性(pH>9. O)條件下的穩定性，從而為實現固定化重組Y-谷氨酰轉肽酶工業應用提供了良好的前提條件。通過本發明方法制備的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶酶活力回收率平均達到20. 0% ;與游離酶相比，固定化酶的最適作用PH和溫度并無改變，但固定化酶的pH穩定性較游離酶有大幅度提高，且重復使用性能好。
圖I為游離酶和固定化酶的最適pH值，圖中顯示Y-谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的最適pH為9。圖2為游離酶和固定化酶的最適溫度，圖中顯示Y-谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的最適溫度為50°C。圖3為游離酶和固定化酶的pH穩定性，圖中顯示Y -谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的穩定性得到了明顯改善，在各PH條件下，經過聚乙烯亞胺包覆的固定化酶的穩定性均較游離酶有大幅提高，在PH 11. O條件下保存15小時，固定化酶的殘余酶活可達44. 4%。圖4為游離酶和固定化酶的保溫4h后的熱穩定性，圖中顯示Y-谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的熱穩定性在45°C以下條件中有所提高，當保溫在45°C下4h時固定化酶的殘余酶活為初始值的77. 6%。圖5為Y -谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的使用穩定性，圖中顯示隨著轉化次數的增多，固定化酶的活力略有下降，但經儲存約30d，轉化20個批次后，聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶活力仍可保持初始值的70%左右。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。以下實施例所使用的Ni Sepharose 6 Fast Flow親和載體購自GE healthcare公司。具體性質可參考說明書。以下實施例中酶活力檢測方法如下稱取O.Olg (濕重)固定化酶，和0.5mL5mmoI · L 1 Y -GpNA 溶液、O. 5mL O. IOmol · L 1 雙甘二妝溶液、I. 5mL SOmmoI /T, pH8. OTris-HCl緩沖一起加入砂芯反應管中。37°C，振蕩速度120r · mirT1，反應20min。反應 液濾出于紫外分光光度計(λ =410nm)下測定吸光值，根據標準曲線計算對硝基苯胺濃度。以下實施例中酶活回收率計算方法如下回收率=(固定化酶活力/總投入酶活)X 100%實施例I :Ni Sepharose 6 Fast Flow親和載體上重組Y -谷氨酰轉肽酶的固定化稱取
I.Og Ni Sepharose 6Fast Flow親和載體置于砂芯管中，加入含有重組Y -谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液IOmL (酶活為13. 06U/mL),于4°C冰浴振蕩反應lh。反應結束后用pH8. O含有200mmol/L咪唑的50mmol/L的Tris-HCl緩沖液洗去多余的酶溶液和雜質2次，再用pH8. 050mmol/L的Tris-HCl緩沖液洗載體2次，即制得鎳親和載體固定化重組Y -谷氨酰轉肽酶。其酶活力為26. lU/g載體，酶活回收率為20.0%。將所得鎳親和載體固定化重組Y-谷氨酰轉肽酶加入PH7. O的O. 2%聚乙烯亞胺水溶液中，4°C震蕩12h，反應結束后用pH8. 050mmol/L的Tris-HCl緩沖液洗載體2次，即制得聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶。實施例2 將I. Og Ni Sepharose 6Fast Flow,加入IOmL含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液(酶活為13. 06U/mL)中，于45°C下振蕩反應6h后，將液體濾出；固體顆粒用pH7. O的含有200mmol/L咪唑的30mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2次，將液體濾出；固體顆粒再用pH7. O的30mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2次，將液體濾出；固體顆粒再用10mLpH7. O的O. 2%的聚乙烯亞胺水溶液，于4°C震蕩反應12h后，固體顆粒再用pH7. O的30mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2次，將液體濾出，即制得Y _谷氨酰轉肽酶固定化酶。實施例3 將I. Og Ni Sepharose 6Fast Flow,加入30mL含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液(酶活為13. 06U/mL)中，于45°C下振蕩反應6h后，將液體濾出；固體顆粒用pH9. O的含有200mmol/L咪唑的60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH9. O的60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗3次，將液體濾出；固體顆粒再用30mLpH9. O的1%的聚乙烯亞胺水溶液，于45°C震蕩反應24h后，固體顆粒再用pH9. O的60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗3次，將液體濾出，即制得Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶。實施例4:應用。重組Y -谷氨酰轉肽酶作為一種催化劑，可用于酶法合成硫代芐基-Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)，供體為L-谷氨酰胺(Gln)和硫代芐基-L-半胱氨酸(S-Bzl-Cys)0配制Gln和S-Bzl-cys濃度均為20mmol · L—1的底物混合物(pH 9. O),分別加入游離酶和實施例I方法制備的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶，使反應液中酶濃度均為O. 0320U/mL，于40°C水浴反應，定時取樣測定產物S-Bzl-GGC的濃度。在反應初始階段，產物S-Bzl-GGC的產率隨反應時間的延長逐漸增加。但隨著反應的繼續，產物濃度達到最大值后逐漸降低，這一現象與GGT的催化機制有關。實驗結果表明，以固定化酶為催化劑，在相同的酶濃度下，反應22h后產物得率為5. 2mmol · L_\較游離酶提高了 13. 06%。實施例5 :游離酶和聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的最適pH值比較試驗。實施例I制得的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶，分別在pH 6 9 (Tris-HCl緩沖)及PHlO 11 (碳酸氫鈉緩沖)的溶液中測定游離酶及聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的活力，結果如圖I所示。聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶和游離酶的最適作用均為PH9， 當PH小于或大于該值時，游離酶和聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的活性均有下降，且在堿性條件，游離酶的活性下降較聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶更為迅速，表明通過固定化可以有效地擴大重組GGT的作用pH范圍。實施例6 :游離酶和聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的最適溫度比較試驗。實施例I制備得到聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶，在不同溫度(25_50°C)下分別測定游離酶及聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶活力，結果如圖2。由圖可知，聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶和游離酶在均在50°C時酶活最高。實施例7 :游離酶和聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的pH穩定性試驗。將游離酶和實施例I制得的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶分別置于pH 6 11的緩沖液中，37°C保溫15h后測定酶活，以O時刻的初始酶活為100%，計算殘余酶活(圖3)。結果表明，B. subtilis NX-2GGT游離酶的穩定性較差，尤其在堿性條件下(pH>8. O)穩定性更差。在pH 11.0條件下，經過15小時貯存，其殘余酶活僅為初始酶活的I. 79%。通過鎳親和固定化GGT的pH穩定性得到了改善，包覆了聚乙烯亞胺后的鎳親和固定化酶在各pH條件下，固定化GGT的穩定性均有更大幅度得提高，在pH 11. O條件下保存15小時，固定化酶的殘余酶活可達44. 4%。實施例8 :游離酶和聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的保溫4h后的熱穩定性試驗。將游離酶和實施例I制得的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶置于不同溫度(35 550C )下保溫4h后取樣測定酶活，設保溫前初始酶活為100%，計算殘余酶活，結果見圖4。游離酶的熱穩定性較差，隨著溫度升高，酶活迅速下降，45°C時殘余酶活為57. 58%。而鎳親和固定化后GGT在45°C以下熱穩定性提高，尤其是包覆了聚乙烯亞胺的鎳親和固定化酶，當溫度為45°C時固定化酶的殘余酶活可達初始值的77. 6%。但當溫度超過45°C后，固定化酶失活脫落更快。實施例9 :聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的使用穩定性試驗。稱取O. Olg的實施例I制得的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶，于4°C下貯藏，定期測定酶活，聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的儲存穩定性測試結果見圖5。在轉化初期(5 10個批次)固定化酶活有明顯的下降，這可能是由于結合較弱的酶分子脫落造成的。隨著轉化次數的增多，聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的活力略有下降，但經儲存約30d，轉化20個批次后，聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶活力仍可保持初始值的70%左右。·
權利要求
1.ー種Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶，其特征在于，它包括酶、固定所述酶的載體和包覆材料，所述的酶為Y -谷氨酰轉肽酶，所述的載體為鎳親和載體，所述的包覆材料為聚こ烯亞胺。
2.根據權利要求I所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶，其特征在于，所述的鎳親和載體為 Ni Sepharose 6 Fast Flow。
3.權利要求I所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，其特征在干，將鎳親和載體，加入含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液中，于4 45°C下振蕩反應I 6h后，將液體濾出；固體顆粒用PH7. O 9. O的含有200mmol/L咪唑的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用pH7. O 9. O的30 60mmol/LTris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用pH7. O 9. O的O. 2 1%(ν/v)的聚こ烯亞胺水溶液，于4 45°C震蕩反應12 24h后，固體顆粒再用pH7. O 9. O的 30 60mmol/LTriS-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出，即制得Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶。
4.根據權利要求3所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，其特征在于，將鎳親和載體，加入含有重組Y -谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液中，于4°C下振蕩反應Ih后，將液體濾出，固體顆粒用PH8. O的含有200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用pH8. O的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH7. O的O. 2%(v/v)的聚こ烯亞胺水溶液，于4°C震蕩反應12h后，固體顆粒再用pH8. O的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出，即制得Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶。
5.根據權利要求3或4所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，其特征在干，對每g濕質量的鎳親和載體，含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液加入體積為10 30mLo
6.根據權利要求5所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，其特征在干，對于每g濕質量的鎳親和載體，重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液溶液的加入體積為10mL。
7.根據權利要求3或4所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，其特征在干，對每g濕質量的鎳親和載體，加入PH7. O的O. 2%(v/v)的聚こ烯亞胺水溶液體積為10 3 OmL ο
8.根據權利要求7所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，其特征在于對于，每g濕質量的鎳親和載體，加入PH7. O的O. 2%(v/v)的聚こ烯亞胺水溶液體積為10mL。
9.根據權利要求3或4所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，其特征在于，制備得到的Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶在PH7. O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液中保存。
10.權利要求I所述的Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶在催化制備Y-谷氨酰基化合物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶，它包括酶、固定所述酶的載體和包覆材料，所述的酶為γ-谷氨酰轉肽酶，所述的載體為鎳親和載體，所述的包覆材料為聚乙烯亞胺。本發明還公開了上述γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法及其應用。本發明所得到的γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶具有制備簡單快速、酶穩定性強、重復使用性能好等特點，為進一步提高γ-谷氨酰轉肽酶的穩定性以適應工業化應用奠定基礎。
文檔編號C12N11/00GK102851272SQ20121035985
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者姚忠, 田思思, 周治, 王浩綺, 熊強, 仲兆祥, 徐虹 申請人:南京工業大學