專利名稱：一株產花生四烯酸的高山被孢霉菌株的制作方法
技術領域：
一株產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，屬于生物工程技術領域。本發明涉及ー種高產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，該菌株生長速度快、產量高，對于花生四烯酸的エ業化
生產有著重要意義。
背景技術：
花生四烯酸系統名為全順式Λ-5，8，11，14-二十碳四烯酸，屬于η-6系列的多不飽和脂肪酸，是該系列多不飽和脂肪酸的代謝樞紐。作為人體中含量最多、分布最廣的多不飽和脂肪酸，花生四烯酸具有顯著的生理藥理作用。研究表明花生四烯酸在促進腦部發育、降血脂、抗炎和抗脂質氧化等方面具有很好的生物活性。基于花生四烯酸的這些重要作用，它已經廣泛應用于食品、醫藥等方面。近年來又有人指出花生四烯酸的代謝產物在預防、治療腫瘤方面也具有廣泛的應用前景。花生四烯酸廣泛的存在于動物、微生物 中。目前花生四烯酸的主要來源包括深海魚油、動物組織等，但是其含量低、提取成本高嚴重阻礙了花生四烯酸的エ業化生產。利用發酵法生產花生四烯酸具有含量高、周期短、提取容易的優點，受到國內外學者的青睞。據文獻報道1979年Lizuka (((Production ofarachidonic acid by a hydrocarbon-utilizing strain of Penicillium cyaneumJi,Applied Microbiology and Biotechnology, 1979, 2 (7)，173-180)最先利用應cyaneu進行了微生物發酵生產花生四烯酸的研究。后經研究發現顯微藻類、部分細菌、酵母菌和藻狀菌綱中的耳霉屬iConidiobolus \被孢霉屬iMortierella)，毛霉屬iMucor)，根霉屬iRhizopus \枝霉屬(Masporangium)等都能發酵生產花生四烯酸,尤其以高山被孢霉研究最多(《微生物發酵生產花生四烯酸的研究進展》，中國油脂，2004，9 (29)，7-40)。絲狀真菌高山被孢霉菌絲體內富含花生四烯酸等多不飽和脂肪酸，其花生四烯酸含量高、提純方便，被公認為是生產花生四烯酸的優良菌株。
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花生四烯酸結構式
專利CN101113410A介紹了ー種高產花生四烯酸的高山被孢霉菌株及其應用。專利JP2008113671、專利US5658767A、沈以凌(《高山被孢霉發酵生產花生四烯酸條件的研究》，食品科技，2OO9, 2 (34)，35_38)和 Totani(《The filamentous fungus Mor ti erellaalpina,high in arachidonic acid)), Lipids, 1987, 22,1060 - 1062)等也報道了利用高山被抱
霉發酵產生花生四烯酸的研究。但在已有的報道中，由于受菌種優劣、發酵條件、提取方式等因素的影響，花生四烯酸的產量良莠不齊，發酵周期也不盡相同。1997年chen(《Optimization of ArachidonicAcid ProauctionDy Mortierella alpina^u]i-H4 Isolate》， Journal of the AmericanOil Chemists’ Society, 1997，5 (74)，569-578)等經低溫篩選得到一株花生四烯酸產生Ialpina 辟，搖瓶發酵5天后其花生四烯酸產量達到3. 9g/L。專利CN101113410A，提供了一株高山被孢霉歷其通過搖瓶發酵6. 5天后，花生四烯酸產量提高到IOg/L0 Jin 等(《A novel two-step fermentation process for improved arachidonic acidproduction by Mortierella alpinaj), Biotechnol Lett, 2008, 30 (6), 1087 - 1091)利用菌株I alpina 采用こ醇脅迫及兩步發酵法生產花生四烯酸，經5L發酵罐發酵7天后，花生四烯酸產量可達19. 8g/L。
本發明從江蘇省無錫市惠山樹林的土壌中篩選得到了性狀穩定、發酵周期短、30°C下可高產花生四烯酸的高山被孢霉菌株(iforiiereBaJN168。具有很好的エ業應用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一株產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，得到了性狀穩定，產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，可通過固態或液態發酵生產花生四烯酸。本發明的技術方案一株產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，命名為高山被孢霉(Mortierella alpina) JN168,已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO M2012073。其 18S rDNA 序列為 SEQ ID N0:1。該菌株主要代謝產物為花生四烯酸。該菌株可利用的碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或馬鈴薯淀粉。該菌株可利用的氮源為無機銨鹽、無機硝酸鹽、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生餅粉或豆餅粉。于江蘇省無錫市惠山樹林，選取落葉覆蓋較密的土地，去除表層土，用取樣鏟垂直鏟取10厘米深處土壤裝入取樣盒。稱取Ig左右土樣于50mL離心管中加入9mL去離子水溶解，取ImL溶解液加入到裝有9mL去離子水的離心管中，依次類推制成10' 10_2，10_3，10_4各種梯度的菌懸液，取10_2，IO-3, IO-4三個梯度進行平板涂布，放置在30°C的生化培養箱中倒置培養。分離用培養基為:馬鈴薯200g、葡萄糖10g、瓊脂20g、水1000mL、青霉素20mg，pH自然。30°C恒溫。待單菌落長出后，挑取單菌落用蘇丹黑B染色，脂肪顆粒被染成藍紫色，挑選脂肪顆粒多且染色較深的菌株進行搖瓶復篩。收獲搖瓶培養的菌絲體抽濾，冷凍干燥至恒重，研磨菌絲體，用索式提取法提取油脂，對提得的油脂進行MS-GS聯用分析脂肪酸組成。反復采用以上的方法，經過多次篩選得到花生四烯酸高產菌株#alpinaJN168。本發明涉及到的菌種有如下特征し高山被抱霉紛ァびぽ^ムalpina JN168培養條件
該菌種的培養常規條件是好氣培養。用于培養菌種的糖質原料可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或馬鈴薯淀粉。培養用的氮源可以是無機銨鹽、無機硝酸鹽、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生餅粉或豆餅粉。該菌株的生長溫度范圍為50C -35°C，花生四烯酸最佳積累溫度為30°C，菌株在pH為2-9范圍內能生長且代謝產花生四烯酸，花生四烯酸最佳積累PH為6. 5。在菌種的培養過程中添加醋酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鎂、磷酸ニ氫鉀等無機鹽對花生四烯酸的產量有促進作用。2、高山被抱霉alpina JNl68的形態描述
平板培養形態alpina JN168培養2天后,平板上出現質地較薄的白色菌落，菌落呈圓形。5天之后菌落開始層層擴展，形成類似花瓣狀的形態。菌落正面白色，背面淺黃色。在含有Triphenyltetrazolium chloride (氯化三苯基四氮唑,TTC)的平板上，菌落呈現紅色。用蘇丹黑B染色后，在顯微鏡下可見菌絲體內藍紫色脂肪顆粒。
3、高山被孢霉iforiiereBa alpina JN168的18S rDNA分子生物學特征見序列表。4、可采用常規的液態發酵方法，利用上述菌種生產花生四烯酸。培養基可用含不同碳源、氮源、無機離子等普通培養基。培養基中也可添加適量的對所使用的微生物生長特別需要的營養物，一般情況，這些營養物存在于上述的天然營養源中。該菌株在液態發酵過程中24小時后開始產花生四烯酸，80小時后花生四烯酸產量達到最大值。本發明的有益效果=JforiiereBa alpina JN168的主要代謝產物為花生四烯酸，菌絲內花生四烯酸含量達50%以上，副產物更少。花生四烯酸最佳積累溫度為30°C，與其它菌種相比有著較高的發酵溫度，因此發酵時間縮短為80小吋，發酵過程更易控制。培養基中也可添加適量的對所使用的微生物生長特別需要的營養物，一般情況，這些營養物存在于上述的天然營養源中。該菌株液態發酵產花生四烯酸的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母粉。用該培養基在30°C下花生四烯酸的產量可達13. Og/L。該菌株液態發酵過程中，24小時后開始產生花生四烯酸，80小時后花生四烯酸產量達到最大。生物材料樣品保藏高山被孢霉(iforiiereBa a7/ i/ a)JN168,已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCCJii :中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO M2012073,保藏日期為2012年03月10日。
具體實施例方式實施例I
高山被孢霉脂肪酸組成分析
發酵菌株為高山被孢霉Ioriierdh alpina JN168，采用液態發酵，采用標準PDA培養基。發酵溫度30°C，7天后發酵結束。抽濾收集菌絲體，冷凍干燥至恒重，用研缽將菌絲體磨碎。取O. Ig左右烘干的菌絲體，加入到有蓋的試管中。向其中加入O. 4mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液5mL，在50°C水浴中保持lh，再向其中加入5mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在50°C水浴中保持lh，加入5mL正己烷抽提，最后加入2mL飽和氯化鈉溶液水洗，移取上層溶液采用GC-MS聯用檢測。分析結果如表I所示。結果表明該菌產生的油脂中以花生四烯酸為主。色譜條件Finnigan Trace MS (美國)氣相色譜-質譜儀。采用DB-MAX毛細管柱(30mX0. 25_X0. 25Mm)。起始柱溫 180°C，保持 lmin，以 5°C /min 升高到 230°C，保持8min。進樣ロ溫度260°C，載氣為氦氣，流速為O. 8mL/min，分流比為10 I。質譜檢測條件EI+ (70Ev)，發射電流200μΑ，離子源溫度350°C，接ロ溫度260°C。表I脂肪酸組成
權利要求
1.一株產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，其分類命名為高山被孢霉(Mortierellaalpina)m^,已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M2012073。
2.根據權利要求I所述的高山被孢霉菌株，其18SrDNA序列為SEQ ID NO :1。
3.根據權利要求I所述的高山被孢霉菌株，其特征在于能代謝產生花生四烯酸。
4.根據權利要求I所述的高山被孢霉菌株，其特征在于可利用的碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或馬鈴薯淀粉。
5.根據權利要求I所述的高山被孢霉菌株，其特征在于可利用的氮源為無機銨鹽、無機硝酸鹽、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生餅粉或豆餅粉。
全文摘要
一株產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，屬于生物工程技術領域。本發明菌株分類命名為高山被孢霉(Mortierellaalpina)JN168，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNOM2012073。該菌株由通過對江蘇省無錫市惠山樹林中的土壤進行分離篩選，得到了性狀穩定，高產花生四烯酸的高山被孢霉菌株，可通過發酵法生產花生四烯酸。
文檔編號C12N1/14GK102827780SQ20121036013
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者蔡宇杰, 丁彥蕊, 周立樹, 金大勇, 朱建航, 廖祥儒, 張大兵, 李枝玲, 羅軍俠 申請人:江南大學