編碼酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其用途

編碼酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其用途
【專利摘要】本發明涉及被孢霉屬微生物的酰基-CoA合成酶同源物蛋白質及編碼該蛋白質的多核苷酸等。本發明提供例如含有高山被孢霉(Mortierella alpina)的酰基-CoA合成酶同源物基因的多核苷酸、編碼酰基-CoA合成酶同源物蛋白質的多核苷酸、含有這些多核苷酸的表達載體及轉化體、使用該轉化體的脂質或脂肪酸的制造方法、或含有通過該制造方法制造的脂質或脂肪酸的食品等。
【專利說明】編碼酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其用途
[0001] 本申請是申請日為2011年2月1日、申請號為201180007631. 0(國際申請號為 PCT/JP2011/052035)、名稱為編碼酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其用途的發明專 利申請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及編碼酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其利用方法。

【背景技術】
[0003] 含有2個以上不飽和鍵的脂肪酸總稱為多不飽和脂肪酸（PUFA :polyuns aturated)，已知有花生四烯酸（ARA)、二高γ -亞麻酸（DGLA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二 碳六烯酸（DHA)等。多不飽和脂肪酸中存在在動物體內無法合成的多不飽和脂肪酸。因此， 對于此種多不飽和脂肪酸，作為必需脂肪酸需要從食物中攝取。
[0004] 多不飽和脂肪酸分布廣泛，例如花生四烯酸可從由動物的腎上腺、肝臟中提取的 脂質中分離。但是，動物臟器中所含有的多不飽和脂肪酸為少量，僅從動物臟器中分離提 取，不足以進行大量供給。因此，不斷在開發通過培養各種微生物以生產多不飽和脂肪酸的 方法。其中，被孢霉屬（Mortierella)微生物作為生產包含花生四烯酸等多不飽和脂肪酸 在內的脂質的微生物而廣為人知。
[0005] 此外，還進行了在植物體內生產多不飽和脂肪酸的嘗試。已知多不飽和脂肪酸構 成三酰甘油等的貯藏脂質，在微生物的菌體內或植物種子中積累。
[0006] 酰基-CoA合成酶（ACS)是使脂肪酸和輔酶A (CoA)進行硫酯化的酶，催化以下反 應。
[0007] 脂肪酸 +CoASH+ATP -酰基-CoA+AMP+Ppi
[0008] 通過ACS生成的酰基-CoA參與包括脂質的生物合成、重構、通過β -氧化產生能 量、蛋白質的酰化、通過脂肪酸的表達調節等各種生命現象。此外，還報道了 ACS參與從細 胞外攝取脂肪酸、細胞內的脂肪酸輸送等（非專利文獻1及2)。鑒于以上內容，認為利用微 生物、植物生產多不飽和脂肪酸等時,控制ACS的活性非常重要。
[0009] 已知在作為真核模式生物的酵母（釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))中有 6 個酰基-CoA 合成酶基因 （ScFAAl、ScFAA2、ScFAA3、ScFAA4、ScFATl、ScFAT2)(非專利文 獻1)。由這些基因編碼的蛋白質在底物特異性、表達時期、細胞內的定位及功能上不同。
[0010] 在專利文獻1中，作為來自裂殖壺菌屬（Schizochytrium sp.)的酰基-CoA合成酶 基因（ScACS)記載了 9個基因。此外，在專利文獻1中，記載了編碼裂殖壺菌屬PUFA合酶系 的基因和ScACS共表達時與不和ScACS共表達時相比，DPA (n-6)(二十二碳五烯酸（n-6))、 DHA的產生增加。
[0011] 其他，也報道了來自動物及植物的酰基-CoA合成酶基因（非專利文獻2及專利文 獻2)。
[0012] 現有技術文獻
[0013] 專利文獻
[0014] 專利文獻1:日本特表JP2009-529890公報
[0015] 專利文獻2:國際公開公報W00209295公報
[0016] 非專利文獻
[0017] 非專利文獻 1:Β·Β·Α· 1771,286-298,2007
[0018] 非專利文獻 2: Exp. Biol. Med.，233 (5)，507-521，2008


【發明內容】

[0019] 在上述情況下，希望分離出在宿主細胞中表達時使該宿主細胞的脂肪酸生產量增 加或使所產生的脂肪酸的組成改變的新型基因。
[0020] 本
【發明者】深入研究的結果，成功地克隆出了編碼作為脂質生產菌的高山被孢霉 (Mortierella alpina)(以下為"M.alpina"）的 ACS 同源物（MaACS)的基因，從而完成了 本發明。即本發明提供以下多核苷酸、蛋白質、表達載體、轉化體、使用該轉化體的脂質或脂 肪酸組合物及食品等的制造方法以及根據該制造方法制造的食品等。
[0021] 即本發明如下。
[0022] [1] -種多核苷酸，其特征在于，為選自以下（a)?（e)中任一項所述的多核苷 酸：
[0023] (a)多核苷酸，其含有選自序列號46、51、56、36、21、1、6、11、16、26、31及41所示的 堿基序列中的任一個堿基序列。
[0024] (b)多核苷酸，編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自序列號47、52、57、37、22、2、7、 12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列組成；
[0025] (c)多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自序列號47、52、57、37、22、2、7、 12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列中1?100個氨基酸發生缺 失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表 達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性或使組成改變的活性；
[0026] (d)多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質具有與選自序列號47、52、57、37、22、 2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列有60%以上同一性的氨 基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸量 增加的活性或使組成改變的活性；及
[0027] (e)多核苷酸，其與由選自序列號46、51、56、36、21、1、6、11、16、26、31及41所示的 堿基序列中的任一個堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼 具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活 性或使組成改變的活性的蛋白質。
[0028] [2]根據上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，為以下（f)或（g)中任一項所 述的多核苷酸：
[0029] (f)多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自序列號47、52、57、37、22、2、7、 12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列中1?10個氨基酸發生缺失、 取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時 使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性或使組成改變的活性；及
[0030] (g)多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質具有與選自序列號47、52、57、37、22、 2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列有90%以上同一性的氨 基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的 量增加的活性或使組成改變的活性。
[0031] [3]根據上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，含有選自序列號46、51、56、36、 21、1、6、11、16、26、31及41所示的堿基序列中的任一個堿基序列。
[0032] [4]根據上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，編碼由選自序列號47、52、57、 37、22、2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列組成的蛋白質。
[0033] [5]根據上述[1]?[4]中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，為DNA。
[0034] [6] -種蛋白質，其特征在于，由上述[1]?[5]中任一項所述的多核苷酸編碼。
[0035] [7] -種載體，其特征在于，含有上述[1]?[5]中任一項所述的多核苷酸。
[0036] [8] -種非人轉化體，其特征在于，導入了上述[1]?[5]中任一項所述的多核苷 酸或導入了上述[7]中所述的載體。
[0037] [9] -種脂質或脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，從上述[8]中所述的轉化 體的培養物中提取脂質或脂肪酸組合物。
[0038] [10]根據上述[9]中所述的方法，其特征在于，所述脂質為三酰甘油。
[0039] [11]根據上述[9]中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸為碳數18以上的多不 飽和脂肪酸。
[0040] [12] -種食品、醫藥品、化妝品或肥阜，其特征在于，含有通過上述[9]中所述的 制造方法提取的脂質或脂肪酸組合物。
[0041] 本發明的多核苷酸可用于適合的宿主細胞的轉化，如此得到的轉化體可用于制造 脂肪酸組合物、食品、化妝品、醫藥、肥皂等。
[0042] 更加具體地說，本發明的轉化體生產脂質及脂肪酸的效率極高。因此，本發明可有 效用于制造需要大量脂質或脂肪酸的醫藥品或健康食品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1表示MaACS-I的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0044] 圖2A表示MaACS-I的基因組序列和CDS序列的比對圖。
[0045] 圖2B表示圖2A的接續圖。
[0046] 圖3A表示MaACS-2的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0047] 圖3B表示圖3A的接續圖。
[0048] 圖4A表示MaACS-2的基因組序列和CDS序列的比對圖。
[0049] 圖4B表示圖4A的接續圖。
[0050] 圖4C表示圖4B的接續圖。
[0051] 圖5表示MaACS-3的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0052] 圖6A表示MaACS-3的基因組序列和CDS序列的比對圖。
[0053] 圖6B表示圖6A的接續圖。
[0054] 圖7A表示MaACS-4的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0055] 圖7B表示圖7A的接續圖。
[0056] 圖8A表示MaACS-4的基因組序列和CDS序列的比對圖。
[0057] 圖8B表示圖8A的接續圖。
[0058] 圖8C表示圖8B的接續圖。
[0059] 圖9A表示MaACS-5的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0060] 圖9B表示圖9A的接續圖。
[0061] 圖IOA表示MaACS-5的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0062] 圖IOB表示圖IOA的接續圖。
[0063] 圖IIA表示MaACS-6的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0064] 圖IIB表示圖IIA的接續圖。
[0065] 圖12A表示MaACS-6的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0066] 圖12B表示圖12A的接續圖。
[0067] 圖13表示MaACS-7的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0068] 圖14A表示MaACS-7的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0069] 圖14B表示圖14A的接續圖。
[0070] 圖15A表示MaACS-8的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0071] 圖15B表示圖15A的接續圖。
[0072] 圖16A表示MaACS-8的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0073] 圖16B表示圖16A的接續圖。
[0074] 圖16C表示圖16B的接續圖。
[0075] 圖17表示MaACS-9的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0076] 圖18A表示MaACS-9的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0077] 圖18B表示圖18A的接續圖。
[0078] 圖19A表示MaACS-IO的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0079] 圖19B表示圖19A的接續圖。
[0080] 圖20A表示MaACS-IO的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0081] 圖20B表示圖20A的接續圖。
[0082] 圖20C表示圖20B的接續圖。
[0083] 圖2IA表示MaACS-Il的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0084] 圖2IB表示圖2IA的接續圖。
[0085] 圖22A表示MaACS-11的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0086] 圖22B表示圖22A的接續圖。
[0087] 圖23A表示MaACS-12的cDNA序列和推定氨基酸序列的對應圖。
[0088] 圖23B表示圖23A的接續圖。
[0089] 圖24A表示MaACS-12的基因組序列和⑶S序列的比對圖。
[0090] 圖24B表示圖24A的接續圖。
[0091] 圖25A表示與來自釀酒酵母（S. cerevisiae)的FAA蛋白質（FAA:脂肪酸活化 (Fatty Acid Activation))有較高氨基酸序列同源性的MaACS和該FAA蛋白質的比對圖。 單下線部表示ATP-AMP基序，雙下線部表示FACS/VLACS-FATP基序。
[0092] 圖25B表示圖25A的接續圖。
[0093] 圖25C表示圖25B的接續圖。
[0094] 圖26A表不與來自釀酒酵母（S. cerevisiae)的FAT蛋白質（FAT:Fatty Acid Transferase)有較高氨基酸序列同源性的MaACS和該FAT的蛋白質的比對圖。單下線部表 示ATP-AMP基序，雙下線部表示FACS/VLACS-FATP基序。
[0095] 圖26B表示圖26A的接續圖。
[0096] 圖27是表示使MaACS-IO超表達的高山被孢霉（M. alpina)中單位菌體的脂質生 產量（圖27A)和花生四烯酸生產量（圖27B)的經時變化的圖。
[0097] 圖28是表示使MaACS-Il超表達的高山被孢霉（M. alpina)中單位菌體的脂質生 產量（圖28A)和花生四烯酸生產量（圖28B)的經時變化的圖。

【具體實施方式】
[0098] 以下，詳細說明本發明。以下的實施方式是用于說明本發明的例示，并不意味著將 本發明只局限于該實施方式。本發明在不脫離其主旨的前提下，可以以各種方式實施。 [0099] 另外，在本說明書中引用的所有文獻以及公開公報、專利公報等其他專利文獻，均 作為參照列入本說明書中。且本說明書包含2010年2月1日申請的作為本申請優先權主 張的基礎的日本國專利申請（日本特愿2010-19967號）的說明書和附圖中記載的內容。 [0100] 本
【發明者】如后述實施例中所詳細記載，首次成功地克隆了來自作為脂質生產菌高 山被孢霉（Malpina)的ACS同源物的基因（MaACS-I?12)的全長cDNA。且本
【發明者】還 鑒定了來自高山被孢霉（M. alpina)的MaACS-I?12的基因組DNA的堿基序列及推定氨基 酸序列。MaACSl、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll及12的ORF序列、推定氨基酸序列、CDS序列、 cDNA序列及基因組序列分別為序列號1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51及56(以下將這 些序列統稱為"MaACS-Ι ?12 的 ORF 序列")、序列號 2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52 及 57(以下將這些序列統稱為"MaACS-Ι?12的氨基酸序列")、序列號3、8、13、18、23、28、33、 38、43、48、53及58(以下將這些序列統稱為"1&^05-1?12的〇^序列")、序列號4、9、14、 19、24、29、34、39、44、49、54及59(以下將這些序列統稱為"]\&^5-1?12的〇0嫩序列")、以 及序列號5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55及60(以下將這些序列統稱為"MaACS-Ι? 12的基因組序列"）。這些多核苷酸及蛋白質可通過后述實施例中所述的方法、公知的基因 工程的方法、公知的合成方法等獲得。
[0101] 1.本發明的多核苷酸
[0102] 首先，本發明提供一種多核苷酸，其特征在于，為選自以下（a)?（g)中任一項所 述的多核苷酸：
[0103] (a)多核苷酸，其含有選自MaACS-I?12的ORF序列中的任一個堿基序列；
[0104] (b)多核苷酸，其含有選自MaACS-I?12的cDNA序列中的任一個堿基序列；
[0105] (c)多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自MaACS-I?12的氨基酸序列中 的任一個氨基酸序列組成；
[0106] ⑷多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自MaACS-I?12的氨基酸序列中 的任一個氨基酸序列中1?100個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組 成，且具有酰基-C 0A合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加 的活性及/或使組成改變的活性；
[0107] (e)多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質具有與選自MaACS-I?12的氨基酸序 列中的任一個氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、 在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或使組成改變的活性；
[0108] (f)多核苷酸，其與由選自MaACS-I?12的ORF序列中的任一個堿基序列的互補 堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細 胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或使組成改變的活性的蛋白質； 及
[0109] (g)多核苷酸，其與由選自MaACS-I?12的cDNA序列中的任一個堿基序列的互補 堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細 胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或使組成改變的活性的蛋白質。
[0110] 本說明書中，"多核苷酸"是指DNA或RNA。
[0111] 本說明書中，"在嚴謹條件下雜交的多核苷酸"是指，例如將由選自MaACS-I? 12的ORF序列中的任一個堿基序列或選自MaACS-I?12的cDNA序列中的任一個堿基 序列的互補堿基序列組成的多核苷酸、或由編碼選自MaACS-I?12的氨基酸序列中的任 一個氨基酸序列的堿基序列組成的多核苷酸的全部或一部分作為探針，采用菌落雜交法、 噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸。關于雜交的方法，例如可以利用在 "Sambrook&Russell, Molecu Iar Cloning ：A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory P ress 2001" 以及"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons 1987-1997" 等中記載的方法。
[0112] 本說明書中，"嚴謹條件"可以是低嚴謹條件、中嚴謹條件以及高嚴謹條件中的任 一種。"低嚴謹條件"例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、32°C的 條件。"中嚴謹條件"例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SD S、50%甲酰胺、42°C或 5XSSC、1% SDS、50mM Tris-HCL(pH7. 5)、50% 甲酰胺、42°C的條件。"高嚴謹條件"例如為 5XSSC、5XDenhardt 溶液、0· 5% SDS、50% 甲酰胺、50°C或 0· 2XSSC、0. 1% SDS、65°C 的條 件。在這些條件中，溫度越高越能期待高效地得到具有高同一性的DNA。但是，作為影響雜 交的嚴謹度的因素，有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領 域技術人員可以通過適當選擇這些因素來實現同樣的嚴謹度。
[0113] 另外，當雜交使用市售的試劑盒時，例如可以使用Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)。此時，按照試劑盒中附帶的操作指南，與標記的探針 孵育過夜后，在55°C的條件下使用含有0. 1% (w/v)SDS的最初的洗滌緩沖液將膜洗滌后， 即可檢測出雜交的DNA。或基于選自MaACS-I?12的ORF序列中的任一個堿基序列或選自 MaACS-I?12的cDNA序列中的任一個堿基序列的互補堿基序列、或編碼選自MaACS-I? 12的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列的全部或一部分制備探針時，使用市售的試劑（例 如PCR標記混合物（Roche Diagnostics公司）等）將該探針進行地高辛（DIG)標記的情 況下，可使用DIG核酸檢測試劑盒（Roche Diagnostics公司）來檢測雜交。
[0114] 作為上述以外可進行雜交的多核苷酸，可以列舉通過FASTA、BLAST等同源性檢 索軟件，使用默認參數計算時，與選自MaACS-I?12的ORF序列中的任一個堿基序列或選 自MaACS-I?12的cDNA序列中的任一個堿基序列的DNA、或編碼選自MaACS-I?12的氨 基酸序列中的任一個氨基酸序列的DNA有50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54% 以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61 %以上、62%以上、 63 %以上、64%以上、65 %以上、66%以上、67 %以上、68 %以上、69%以上、70 %以上、71 % 以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、 80 %以上、81 %以上、82 %以上、83%以上、84%以上、85 %以上、86%以上、87 %以上、88% 以上、89%以上、90%以上、91 %以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、 97%以上、98%以上、99%以上、99. 1 %以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5% 以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、或99. 9%以上同一性的DNA。
[0115] 另夕卜，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可以用FASTA(ScienCe 227(4693):1435-1441, (1985))、Karlin-Altschul 的算法 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990 ；Proc Natl Acad Sci USA 90:5873, 1993)來確定。開發出了基于BLAST算法的被稱為blastn、blastx、blastp、 tblastn 和 tblastx 的程序（Altschul SF, et al:J Mol Biol 215:403, 1990)。使用blastn 分析堿基序列時，參數例如為score = 100、wordlength = 12。此外使用blastp分析氨基 酸序列時，參數例如為score = 50、wordlength = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時， 使用各程序的默認參數。
[0116] 上述本發明的多核苷酸可以通過公知的基因工程的方法或公知的合成方法獲得。
[0117] 2.本發明的蛋白質
[0118] 本發明提供如下所示的蛋白質。
[0119] ⑴蛋白質，其由上述（a)?（g)中任一項的多核苷酸編碼。
[0120] (ii)蛋白質，其含有選自MaACS-I?12的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列。
[0121] (iii)蛋白質，其由選自MaACS-I?12的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列中1 或多個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有酰基-CoA合成酶 活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或使組成改變的 活性。
[0122] (iv)蛋白質，其具有與選自MaACS-I?12的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列有 90%以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主 細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或使組成改變的活性。
[0123] 上述（iii)或（iv)所述的蛋白質，代表性的有天然存在的由選自MaAC S-I? 12的氨基酸序列中的任一個氨基酸序列組成的蛋白質的突變體，但也包括可使用例如 "Sambrook&Russell, Molecular Cloning ：A Laboratory Ma nual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons 1987-1997"、"Nuc. Aci ds. Res. ,10, 6487 (1982)"、 "Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79,6409(1982)"、"Gene，34,315 (1985)"、"Nuc.Acids. Res.，13, 4431 (1985) "、"Proc. N ath Acad Sci. USA, 82, 488 (1985) " 等中記載的定點突變 法而人工獲得的蛋白質。
[0124] 本說明書中，作為"蛋白質，其由選自MaACS-I?12的氨基酸序列中的任一個氨 基酸序列中1或多個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序組成，且具有酰 基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或 使組成改變的活性"，可列舉如下蛋白質，其由在選自MaACS-I?12的氨基酸序列中的任一 個氛基酸序列中的例如1?100個、1?90個、1?80個、1?70個、1?60個、1?50個、 1?40個、1?39個、1?38個、1?37個、1?36個、1?35個、1?34個、1?33個、1? 32個、1?31個、1?30個、1?29個、1?28個、1?27個、1?26個、1?25個、1?24 個、1?23個、1?22個、1?21個、1?20個、1?19個、1?18個、1?17個、1?16個、 1?15個、1?14個、1?13個、1?12個、1?11個、1?10個、1?9個（1?數個）、 1?8個、1?7個、1?6個、1?5個、1?4個、1?3個、1?2個或1個氨基酸殘基發生 缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序組成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表 達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或使組成改變的活性。上述氨基酸殘 基發生缺失、取代、插入及/或附加的數量通常優選越少越好。
[0125] 且作為此種蛋白質，還可以列舉如下蛋白質，其具有與選自MaACS-I?12的氨基 酸序列中的任一個氨基酸序列有60%以上、61 %以上、62%以上、63%以上、64%以上、65% 以上、66%以上、67 %以上、68 %以上、69%以上、70 %以上、71 %以上、72 %以上、73%以上、 74%以上、75 %以上、76 %以上、77%以上、78 %以上、79%以上、80 %以上、81 %以上、82 % 以上、83%以上、84%以上、85 %以上、86%以上、87 %以上、88%以上、89 %以上、90%以上、 91 %以上、92 %以上、93 %以上、94%以上、95 %以上、96%以上、97 %以上、98%以上、99 % 以上、99. 1 %以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7% 以上、99. 8%以上、或99. 9%以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿 主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性及/或使組成改變的活性。上述 同一性的數值通常優選越大越好。
[0126] 本發明的蛋白質的氨基酸序列中1個或多個氨基酸殘基發生缺失、取代、插入及/ 或附加，是指在同一序列中的任意且1個或多個氨基酸序列中的位置上有1個或多個氨基 酸殘基發生缺失、取代、插入及/或附加，缺失、取代、插入及附加中的2種以上也可同時發 生。
[0127] 以下所示為能相互取代的氨基酸殘基的例子。在同一組中包含的氨基酸殘基可相 互取代。A組：亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨 酸、〇-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己基丙氨酸；B組：天冬氨酸、谷氨酸、 異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組：天冬酰胺、谷氨酰胺；D組：賴 氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2,4_二氨基丁酸、2,3_二氨基丙酸；E組：脯氨酸、3-羥基脯氨酸、 4_羥基脯氨酸；F組：絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組：苯丙氨酸、酪氨酸。
[0128] 另外，本發明的蛋白質也可通過Fmoc法（9-莉甲氧羰基法）、tBoc法（叔丁氧 羰基法）等化學合成法制造。此外，還可利用Advanced Automation Peptide Protein Technologies 公司制、拍金埃爾默（Perkin Elmer)公司制、Protein Technologies 公司 制、PerSeptive公司制、Applied Biosystems公司制、SHIMADZU公司制等的肽合成儀進行 化學合成。
[0129] 由本發明的多核苷酸編碼的蛋白質或本發明的蛋白質均為ACS的同源物蛋白質， 且因對酰基-CoA合成酶活性重要的ATP-AMP基序及FACS/VLACS-FATP基序保守，所以認 為具有酰基-CoA合成酶活性。在此，ATP、AMP、F ACS、VLACS及FATP分別指三磷酸腺苷 (Adenosine Triphosphate)、一憐酸腺苷（Adenosine Monophosphate)、脂醜輔酶 A 合成酶 (Fatty Acyl CoA Synt hetase)、極長鏈醜基輔酶 A 合成酶（Very Long Chain Acyl-CoA Synthetase)及脂肪酸轉運蛋白（Fatty Acid Transport Protein)。本發明的蛋白質中所 含有的ATP-AMP基序及FACS/VLACS-FATP基序的具體的氨基序列分別如圖25及26的單下 線部分及雙下線部分所示。有關ATP-AMP基序及FACS/VLAC S-FATP基序的代表性氨基序 列，可參照 pfam(http://pfam. sanger. ac. uk/)等的數據庫。
[0130] 在此，"酰基-CoA合成酶活性（ACS活性）"指促進脂肪酸和輔酶A之間生成硫酯 鍵、生成酰基-CoA的反應（下述化學反應式）的活性。
[0131] 脂肪酸+輔酶A -酰基-C〇A+H20
[0132] 酰基-CoA合成酶活性例如可如下確認，將導入本發明的多肽的宿主細胞培養一 定時間后，制備該宿主細胞的細胞溶解物，將該細胞溶解物、經過標記的脂肪酸（例如用放 射性同位素標記的多不飽和脂肪酸等）和輔酶A混合反應一定時間，而后用η-庚烷提取游 離脂肪酸并除去，通過將水層中所含有的由上述反應生成的脂肪酸-CoA的量用閃爍計數 器作為放射性水平進行測定，可定量確認。有關酰基-CoA合成酶活性的詳細確認方法可 參照 Black PN et al. (J· Β. C，272 (8)，4896-4903, 1997)。或也可通過本申請實施例 2 的 "ACS活性的評價"中所記載的不使用放射性標記的方法來測定酰基-CoA合成酶活性。
[0133] "在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性"是指將編碼本 發明的多核苷酸或本發明的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞內（轉化）使其在該宿主細胞 內表達時，為與所述宿主細胞來自同一菌株，且與未導入所述多核苷酸的對照細胞（對照） 相比使脂肪酸的總生產量增加的活性。
[0134] 此外，"在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸組成改變的活性"是指將本 發明的多核苷酸或編碼本發明的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞內（轉化）使其在該宿主 細胞內表達時，與和所述宿主細胞來自同一菌株且與未導入所述多核苷酸的對照細胞（對 照）相比，使由細胞產生的各種脂肪酸的量或比率改變的活性。
[0135] 本說明書中，"脂肪酸"是指通式RC00H(R為烷基）表示的脂肪族一元羧酸（具有 一個羧基，碳素原子鏈狀連接的羧酸）。脂肪酸中包含烴鏈中不具有雙鍵的飽和脂肪酸和含 有雙鍵的不飽和脂肪酸。優選脂肪酸為不飽和脂肪酸，進一步優選烴鏈中含有多個雙鍵的 多不飽和脂肪酸。且作為多不飽和脂肪酸的優選例，為碳數18以上的不飽和脂肪酸，例如 為碳數18或20的不飽和脂肪酸，作為其例子，可列舉油酸、亞油酸、亞麻酸（γ -亞麻酸及 二高Y-亞麻酸等）、花生四烯酸等，但不限于這些。特別優選多不飽和脂肪酸為亞油酸、 Y-亞麻酸、二高Y-亞麻酸及花生四烯酸，更優選為亞油酸、二高Y-亞麻酸及花生四烯 酸，最優選為二高Y-亞麻酸及花生四烯酸。
[0136] 本發明中，"宿主細胞"是指只要在導入本發明的多核苷酸時可表達該多核苷酸的 細胞，無特別限定。此種細胞中，包含來自哺乳動物（人除外）、昆蟲、植物、真菌、細菌等的 細胞，優選來自植物及真菌的細胞，特別優選來自真菌的細胞。尤其優選脂質生產菌或酵 母。
[0137] 作為脂質生產菌，例如可以使用在 MYC0TAX0N，Vol. XLIV，No. 2, PP. 257-265(1992) 中記載的脂質生產菌，但不限于此。作為具體例可以列舉屬于被孢霉屬的微生物。作為屬 于被孢霉屬的微生物的具體例，可以列舉長孢被孢霉（Mortierella elongata) IF08570、 微小被抱霉（Mortierella exigua)IF08571、喜濕被抱霉（Mortierella hygrophila) IF05941、高山被孢霉（Mortierella alpina) IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、 CBS 219. 35、CBS224. 37、CBS250. 53、CBS343. 66、CBS527. 72、CBS528. 72、CBS529. 72、 CBS608.70、CBS754.68等屬于被孢霉亞屬（subgenus Mortierella)的微生物、或深黃被孢 霉（Mortierella isabellina)CBS194. 28、IF06336、IF07824、IF07873、IF07874、IF08286、 IF08308、IF07884、矮被孢霉（Mortierella nana)IF08190、拉曼被孢霉（Mortierella ramanniana)IF05426、IF08186、CBS112. 08、CBS212.72、IF07825、IF08184、IF08185、 IF08287、葡酒色被抱霉（Mortierella vinacea)CBS236. 82 等屬于 Micromucor 亞屬 (subgenus Micromucor)的微生物等。特別優選高山被抱霉（Mortierella alpina)。
[0138] 作為酵母的具體例，可列舉酵母屬（Saccharomyces)、假絲酵母屬（Candida)、接 合酵母屬（Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、漢遜酵母屬（Hansenula)，作為酵 母屬（Saccharomyces)，可優選列舉釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。但是，釀酒 酵母等的野生株酵母在其細胞內中主要可合成碳數18以下的飽和脂肪酸或單不飽和脂肪 酸，但不能合成多不飽和脂肪酸。因此，將釀酒酵母等的酵母作為宿主細胞使用時，優選該 酵母細胞通過基因重組等被賦予合成多不飽和脂肪酸的能力。合成此種多不飽和脂肪酸的 能力可通過導入編碼如下蛋白質的基因來賦予，該蛋白質來自已具有合成多不飽和脂肪酸 能力的生物且參與脂肪酸合成。
[0139] 作為"已具有合成多不飽和脂肪酸能力的生物"的例子，可列舉脂質生產菌。脂質 生產菌的具體例如前所述。
[0140] 此外，作為編碼來自已具有合成多不飽和脂肪酸能力的生物的蛋白質，且參與脂 肪酸合成的蛋白質的基因的例子，可列舉△ 12脂肪酸去飽和酶基因、Λ6脂肪酸去飽和酶 基因、GLELO脂肪酸鏈延長酶基因及Λ5脂肪酸去飽和酶基因等，但不限定這些。Λ12脂肪 酸去飽和酶基因 、Λ 6脂肪酸去飽和酶基因、GLELO脂肪酸鏈延長酶基因及Λ 5脂肪酸去飽 和酶基因的堿基序列可通過訪問GenBank等數據庫獲取，例如可通過在GenBank中分別輸 入為 No. ΑΒ020033、No. ΑΒ020032、No. ΑΒ193123 及 No. ΑΒ188307 的注冊號獲取各序列。
[0141] 上述與脂肪酸合成有關的蛋白質的基因可在插入適當的載體（例如、 pESC(Stratagene)或 pYES(Invitrogen)等）后，通過電穿孔法、原生質球法（?1*〇〇.似1:1· Acad. Sci. USA, 75pl929 (1978))、醋酸鋰法（J. Bacteriology, 153, pl63 (1983) )、&Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75pl929(1978)> Methods in yeast genetics, 2000Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中記載的方法導入酵母中。
[0142] 脂肪酸可從由本發明的多核苷酸或編碼本發明的蛋白質的多核苷酸轉化的宿主 細胞中如下提取。關于宿主細胞，培養結束后，可以按照離心分離法、過濾等常用方法得到 培養細胞。將細胞充分水洗，優選進行干燥。干燥可以通過冷凍干燥、風干等來進行。將干 燥細胞根據需要采用Dyno Mill或超聲波等破碎后，優選在氮氣流下使用有機溶劑進行提 取處理。作為有機溶劑，可以使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，或者通過 甲醇和石油醚的交替提取或使用了氯仿-甲醇-水的單相溶劑的提取也能得到良好的結 果。通過在減壓下從提取物中餾去有機溶劑，可以得到含有脂肪酸的脂質。提取的脂肪酸 也可以采用鹽酸甲醇法等進行甲酯化。
[0143] 此外，各種脂肪酸的量或比率可將如上所述提取的脂肪酸用各種色譜法通過分析 進行測定。作為色譜法的例子，可列舉高效液相色譜法及氣相色譜法，作為特別優選的例子 可列舉氣相色譜法，但不限于此。
[0144] 3.本發明的載體及導入該載體的轉化體
[0145] 本發明還在另一實施方式中提供含有本發明的多核苷酸的表達載體。
[0146] 本發明的載體通常包含如下表達盒而構成，該表達盒包含
[0147] (i)可在宿主細胞內轉錄的啟動子；
[0148] (ii)與該啟動子連接的上述（a)?（g)中任一項所述的多核苷酸；以及
[0149] (iii)與RNA分子的轉錄終止和多聚腺苷酸化相關、在宿主細胞內起作用的信號 作為構成要素。
[0150] 如此構建的載體被導入宿主細胞。作為本發明中使用的適合的宿主細胞的例子， 如上所述。
[0151] 由本發明的載體轉化后的這些宿主細胞與未由本發明的載體轉化的宿主細胞相 比，ACS活性增加或者生產了更多的脂肪酸、或者細胞內含有的各種脂肪酸的量或比率發生 了變化。
[0152] 作為在脂質生產菌中導入時使用的載體，例如可以利用pDura5 (Appl. Microbiol. Biotechnol.，65, 419-425,（2004))，但不限于此。
[0153] 作為在酵母中導入時使用的載體，只要是具有在酵母細胞內表達插入片 段的活性的載體即可，無特別限定，作為例子，可以列舉pYE22m(Bi 〇Sci. Biotech. Biochem.，59, 1221-1228, 1995)。
[0154] 作為調節宿主細胞中的基因表達的啟動子/終止子，只要在宿主細胞中起作用即 可，可以是任意的組合。例如，在脂質生產菌中利用時，可以利用hist on H4.1基因的啟動 子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子等。
[0155] 作為轉化時使用的選擇性標記，可以利用營養缺陷型標記（ura5、niaD)、潮霉素 抗性基因、Zeocin抗性基因、Geneticin抗性基因（G418r)、銅抗性基因（CUPl) (Marin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，337 1984)、淺藍菌素抗性基因（fas2m, PDR4)(分別來 自豬腰淳嗣等，生化學，64, 660, 1992 ;Hussain et al. , gene, 101, 149, 1991)等。
[0156] 作為宿主細胞的轉化方法，可以利用常用的公知方法。例如為脂質生產菌時，可以 利用電穿孔法（Mackenxie D.A.et al. Appl. Environ. Microbiol. ,66, 4655-4661，2000)、 粒子轟擊（Particle Delivery)法（日本特開2005-287403 "脂質生產菌的育種方 法"（日語原名：脂質生産菌〇育種方法）中記載的方法）。另外，為酵母時，可以 采用電穿孔法、原生質球法（Proc. Natl. Acad. Sci. U SA，75pl929 (1978))、醋酸鋰法 (J. Bacteriology, 153, pl63 (1983)) > Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75pl929 (1978) > Methods in yeast genetics, 2000Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 等 中記載的方法來實施，但不限于這些。
[0157] 此外，有關通常的克隆技術，可參照 "Sambrook&Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001〃、''Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, NY)"等。
[0158] 4.本發明的脂質或脂肪酸纟目合物的制誥方法
[0159] 本發明還在另一實施方式中提供使用上述轉化體的脂質或脂肪酸組合物的制造 方法。
[0160] 本說明書中，"脂質"是指包括由脂肪酸和醇通過酯鍵形成的化合物（例如甘油 酯）或其類似物（例如膽固醇酯）等的單純脂質、在單純脂質的一部分上進一步結合磷酸、 氨基酸、糖等而得到的復合脂質以及脂質的水解產物中不溶于水的衍生脂質。
[0161] 本說明書中，"油脂"是指甘油和脂肪酸的酯（甘油酯）。
[0162] 有關"脂肪酸"如上所述。
[0163] 本發明的脂質或脂肪酸組合物的提取方法與上述的脂肪酸的提取方法相同。
[0164] 從含有脂肪酸的脂質中分離脂肪酸，可以在混合脂肪酸或混合脂肪酸酯的狀態下 采用常用方法（例如尿素附加法、冷卻分離法、柱色譜法等）濃縮分離來進行。
[0165] 通過本發明的方法制造的脂質優選含有不飽和脂肪酸，進一步優選含有多不飽和 脂肪酸。作為多不飽和脂肪酸的優選例，為碳數18以上的不飽和脂肪酸、例如碳數18或20 的不飽和脂肪酸，作為其例子可列舉油酸、亞油酸、亞麻酸（Y-亞麻酸及二高Y-亞麻酸 等）、花生四烯酸等，但不限于這些。特別優選的多不飽和脂肪酸為亞油酸、Y-亞麻酸、二 高Y-亞麻酸及花生四烯酸，更優選為亞油酸、二高Y-亞麻酸及花生四烯酸，最優選為二 高Y-亞麻酸及花生四烯酸。
[0166] 且通過本發明的方法生產的脂質及該脂質中所含有的脂肪酸的組成可通過上述 脂質的提取方法、脂肪酸的分離方法或這些的組合確認。
[0167] 使用本發明的制造方法得到的脂質或脂肪酸組合物，可以按照常用方法用于例如 含有油脂的食品、醫藥品、工業原料（化妝品、肥皂等的原料）的制造等用途。
[0168] 本發明還在另一實施方式中提供使用本發明的轉化體的食品、化妝品、醫藥、肥皂 等的制造方法。該方法包含使用本發明的轉化體來生成脂質或脂肪酸的工序。含有生成的 脂質或脂肪酸的食品、化妝品、醫藥、肥皂等的制備采用常用方法。如上所述，使用本發明的 制造方法制造的食品、化妝品、醫藥、肥皂等，含有使用本發明的轉化體所生成的脂質或脂 肪酸。本發明還提供使用上述方法制造的食品、化妝品、醫藥、肥皂等。
[0169] 本發明的化妝品（組合物）或醫藥品（組合物）的劑型無特別限定，可以采用溶 液狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀等任意的劑型。另外，本發明的化妝品組合物或醫藥組 合物不僅可以用于油、化妝水、乳霜、乳液、凝膠、洗發液、潤絲、護發素、指甲油、粉底、口紅、 香粉、面膜、軟膏、香水、粉餅、花露水、牙膏、肥皂、氣霧劑、潔面膏等化妝品或皮膚外用藥， 還可以用于皮膚老化防止改善劑、皮膚炎癥防止改善劑、沐浴用劑、生發劑、皮膚美容液、防 曬劑或因外傷、皸裂、龜裂等引起的皮膚粗糙的防止改善劑等。
[0170] 本發明的化妝品組合物還可以根據需要進一步適當配合其他油脂及/或色素、香 料、防腐劑、表面活性劑、顏料、抗氧化劑等。關于它們的配合比例，本領域技術人員可以根 據目的適當決定（例如，油脂在組合物中可以含有1?99. 99重量％，優選為5?99. 99重 量％，進一步優選為10?99. 95重量％ )。此外，本發明的醫藥組合物也可以根據需要進一 步含有其他醫藥活性成分（例如消炎成分）或輔助成分（例如潤滑成分、載體成分）。例 如，作為化妝品或皮膚外用藥中的其他常用成分，可以列舉粉刺用藥、頭屑?瘙癢防止劑、止 汗防臭劑、燙傷用藥、防螨?虱劑、角質軟化劑、干皮癥用藥、抗病毒劑、經皮吸收促進劑等。
[0171] 作為本發明的食品的例子，可以列舉營養輔助食品、保健食品、功能性食品、幼兒 用食品、嬰兒用配方奶、早產兒用配方奶、老人用食品等。在本說明書中，食品是固體、流體、 液體以及它們的混合物，是可攝取食用的物質的總稱。
[0172] 營養輔助食品是指強化了特定營養成分的食品。保健食品是指被認為是健康的或 對健康有益的食品，包括營養輔助食品、天然食品、減肥食品等。功能性食品是指用來補充 具有身體調節功能的營養成分的食品，與特定保健用食品同義。幼兒用食品是指供給約6 歲以下的兒童用的食品。老人用食品是指處理成比未處理食品易消化和吸收的食品。嬰兒 用配方奶是指供給約1歲以下的兒童用的配方奶。早產兒用配方奶是指供給早產兒出生后 到約6個月為止所用的配方奶。
[0173] 作為這些食品的形態的例子，可以列舉肉、魚、堅果等天然食品（用油脂處理過的 食品）、中國菜、拉面、湯等在制作時加入油脂的食品、天婦羅、油炸食品、油炸豆腐、炒飯、 甜甜圈、花林糖等用油脂作為熱介質的食品、黃油、人造黃油、蛋黃醬、調味汁、巧克力、方便 面、奶糖、餅干、曲奇、蛋糕、冰淇凌等油脂食品或在加工時添加了油脂的加工食品、（烤）年 糕片、硬餅干、豆沙面包等在加工完成時用油脂噴霧或涂布的食品等。但是，并不限于含有 油脂的食品，例如還可以是面包、面條類、米飯、點心類（糖果、口香糖、橡皮糖、壓片糖、日 式點心）、豆腐及其加工品等農產品、清酒、藥酒、甜料酒、食醋、醬油、黃醬等發酵食品、酸 奶、火腿、培根、香腸等畜產食品、魚糕、炸魚糕、魚肉山芋餅等水產食品、果汁飲料、清涼飲 料、運動飲料、酒精飲料、茶等。
[0174] 本發明的食品還可以是膠囊等醫藥制劑的形態，或是在蛋白質、糖類、脂肪、微量 元素、維生素類、乳化劑、香料等中配合了本發明的油脂得到的自然流食、半消化態營養食 品以及成分營養食品、保健飲料、經腸營養劑等加工形態。
[0175] 如上所述，通過使本發明的ACS同源物的基因在宿主細胞內表達，能高效地生成 脂肪酸。
[0176] 而且，還可以將該基因的表達量作為指標，應用于高效地進行脂肪酸生產的培養 條件的探討、培養管理等。
[0177] 實施例
[0178] 以下用實施例更具體地說明本發明，但本發明的范圍并不限于這些實施例。
[0179] 「實施侈il Il高山被?包霉（Mortierella alpina)的基因組分析
[0180] 將Ealpina 1S-4株接種到IOOml的GY2 :1培養基（2%葡萄糖、1%酵母膏ρΗ6·0) 中，在28°C下振蕩培養2天。通過過濾收集菌體，使用DNeasy(Q IAGEN)制備基因組DNA。 使用Roche 454GS FLX Standard來確定上述基因組DNA的堿基序列。此時，片段文庫的堿 基序列的確定進行2個run,末端配對文庫的堿基序列的確定進行3個run。通過將得到的 堿基序列拼接，得到300個超級重疊群（supercontig)。
[0181] cDNA的合成和cDNA f庫的構律
[0182] 將Malpina 1S-4株接種到IOOml的培養基（1.8%葡萄糖、1 %酵母膏、p H6.0) 中，在28°C下預培養3天。在IOL培養槽（Able Co.，東京）中加入5L培養基（1.8%葡 萄糖、l%大豆粉、0.1%橄欖油、0.01%增稠劑（ADEKAN0L)、0.3%KH 2P04、0.1%Na2S04、 0· 05% CaCl2 · 2Η20、0· 05% MgCl2. 6Η20、ρΗ6· 0)，接種全部預培養物，在 300rpm、lvvm、26°C 的條件下通氣攪拌培養8天。培養第1、2及3天后，分別添加相當于2%、2%及1. 5%的葡 萄糖。回收培養第1、2、3、6及8天的各階段的菌體，用鹽酸胍/CsCl法制備total RNA。使 用 01igotex-dT30〈Super>mRNA Purification Kit (TaKaRa Bio In c.)從 total RNA 中進 行 poly(A)+RNA 的純化。使用 ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(STRATAGENE)構 建各階段的cDNA文庫。
[0183] ACS同源物的榑索
[0184] 將作為酵母的 ACS 的 ScFAAl (Y0R317W)、ScFAA2 (YER015W)、S cFAA3 (YIL009W)、 ScFAA4(YMR246W)、ScFATl (YBR041W)、ScF AT2(YBR222C)的氨基酸序列作為查詢（query) 序列，相對于M. alpina 1S-4的基因組堿基序列進行tblastn搜索。其結果，12種序列匹 配。即包含序列號5、序列號10、序列號15、序列號20、序列號25、序列號30、序列號35、序 列號40、序列號45、序列號50、序列號55、序列號60的序列的超級重疊群（supercontig) 匹配。將序列號5所涉及的基因作為MaACS-I，將序列號10所涉及的基因作為MaACSUf 序列號15所涉及的基因作為MaACS-3,將序列號20所涉及的基因作為MaACS-4,將序列號 25所涉及的基因作為Ma ACS-5,將序列號30所涉及的基因作為MaACS-6,將序列號35所涉 及的基因作為MaACS-7,將序列號40所涉及的基因作為MaACS-8,將序列號45所涉及的基 因作為MaACS-9,將序列號50所涉及的基因作為MaACS-ΙΟ,將序列號55所涉及的基因作為 MaACS-ΙΙ，將序列號60所涉及的基因作為MaACS-12。
[0185] ACS同源物的克降
[0186] 為克隆與MaACS-I?12的基因對應的cDNA，進行上述cDNA文庫的篩選。另外，探 針的標記通過使用ExTaq(TaKaRa Bio Inc.)的PCR進行。即替換ExTaq中附帶的dNTP混 合物，使用PCR標記混合物（Roche Diagnostics)，制備將經過擴增的DNA進行地高辛（DIG) 標記的探針。
[0187] 雜交條件如下。
[0188] 緩沖液：5xSSC、l% SDS、50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)、50% 甲酰胺；
[0189] 溫度：42°C ( -夜）；
[0190] 洗滌條件：在 0· 2x SSC、0. 1% SDS 溶液中（65°C )、20 分鐘 X3 次；
[0191] 使用DIG核酸檢測試劑盒（Roche Diagnostics)進行檢測。從通過篩選得到的噬 菌體克隆中，使用體內切割技術切割質粒，得到各質粒DNA。
[0192] 以下，通過各基因篩選中使用的探針制備用的引物、所得到的各基因 CDS的堿基 數、由CDS的堿基序列導出的氨基酸序列的氨基酸數及基因組DNA序列和CDS序列的比較， 記載外顯子、內含子的數量。
[0193] (I)MaACS-I 引物 ACS-1-1F :5' -gtcggctccaagcttgcaatcc-3'（序列號 61)
[0194] 引物 ACS-1-2R :5, -ggacagctccagcactgtggtaaag-3，（序列號 62)
[0195] cDNA (序列號 4)
[0196] CDS (序列號 3) : 1857bp
[0197] 0RF(序列號 I) :1854bp
[0198] 氨基酸序列（序列號2) :618氨基酸（參照圖I)
[0199] 外顯子數：5、內含子數：4(參照圖2)
[0200] (2)MaACS-2
[0201] 引物 ACS-2-1F :5'-gaccacgggattccccaaggctgc-3'（序列號 63)
[0202] 引物 ACS-2-2R :5' -cttggtcgcgcttgttcctggccac-3'（序列號 64)
[0203] cDNA (序列號 9)
[0204] CDS (序列號 8) : 1929bp
[0205] ORF (序列號 6) : l926bp
[0206] 氨基酸序列（序列號7) :642氨基酸（參照圖3)
[0207] 外顯子數：8、內含子數：7(參照圖4)
[0208] (3)MaACS-3
[0209] 引物 ACS-3-1F :5'-tacagctttgttgctgtccccatc-3'（序列號 65)
[0210] 引物 ACS_3_2R :5, -gatgatgggtgtgcttgcaaagatc-3，（序列號冊）
[0211] cDNA(序列號 14)
[0212] CDS (序列號 13) : 1653bp
[0213] ORF (序列號 11) : 1650bp
[0214] 氨基酸序列（序列號12) :550氨基酸（參照圖5)
[0215] 外顯子數：9、內含子數：8(參照圖6)
[0216] (4) MaACS-4
[0217] 引物 ACS-4-1F :5,-aacccaaagctgcgccaggctgtcc-3，（序列號 67)
[0218] 引物 ACS-4-2R :5' -ttacagcttggattccttttgatgg-3'（序列號 68)
[0219] cDNA(序列號 19)
[0220] CDS(序列號 18) :2067bp
[0221] 0RF(序列號 16) :2064bp
[0222] 氨基酸序列（序列號17) :688氨基酸（參照圖7)
[0223] 外顯子數：7、內含子數：6(參照圖8)
[0224] (5)MaACS-5
[0225] 引物 ACS_5_1F :5'-gtcgtgcccgatgcggagacgc-3'（序列號的）
[0226] 引物 ACS-5-2R :5, -tcagtggatcccgttatacatcag-3，（序列號 70)
[0227] cDNA(序列號 24)
[0228] CDS(序列號 23) :1980bp
[0229] 0RF(序列號 21) :1977bp
[0230] 氨基酸序列（序列號22) :659氨基酸（參照圖9)
[0231] 外顯子數：6、內含子數：5(參照圖10)
[0232] (6)MaACS-6
[0233] 引物 ACS-6-1F :5'-gcgtccccctctatgatacattg-3'（序列號 71)
[0234] 引物 ACSHR :5, -gtgggatgcaggacggcaacatcg-3，（序列號 72)
[0235] cDNA(序列號 29)
[0236] CDS(序列號 28) :1980bp
[0237] 0RF(序列號 26) :1977bp
[0238] 氨基酸序列（序列號27) :659氨基酸（參照圖11)
[0239] 內含子數：至少為5 (參照圖12)
[0240] (7)MaACS-7
[0241] 引物 ACS-T7-IF :5,-ggatgccgaacaacagcgcgtgg-3，（序列號 73)
[0242] 引物 ACS-7-2R :5' -gcaccctcctcagaaacagccctc-3'（序列號 74)
[0243] cDNA(序列號 34)
[0244] CDS(序列號 33) :1827bp
[0245] 0RF(序列號 31) :1824bp
[0246] 氨基酸序列（序列號32) :608氨基酸（參照圖13)
[0247] 外顯子數：5、內含子數：4(參照圖14)
[0248] (8)MaACS-8
[0249] 引物 ACS_8_1F :5,-cagtcgagtacattgtcaaccacg-3，（序列號 75)
[0250] 引物 ACSHR :5, -gcggttcaagaggcgaggcacagc-3，（序列號 76)
[0251] cDNA(序列號 39)
[0252] CDS(序列號 38) :2079bp
[0253] 0RF(序列號 36) :2076bp
[0254] 氨基酸序列（序列號37) :692氨基酸（參照圖15)
[0255] 外顯子數：8、內含子數：7(參照圖16)
[0256] (9)MaACS-9
[0257] 引物 ACS-9-1F :5'-gttcatcttctgctggctgggtctc-3'（序列號 77)
[0258] 引物 ACS_9_2R :5' -gttgcgttgttcacgcggcaatcc-3'（序列號 78)
[0259] cDNA(序列號 44)
[0260] CDS (序列號 43) : 1851bp
[0261] 0RF(序列號 41) :1848bp
[0262] 氨基酸序列（序列號42) :616氨基酸（參照圖17)
[0263] 外顯子數：5、內含子數：4(參照圖18)
[0264] (IO)MaACS-IO
[0265] 引物 ACS-10-1F :5,-atggaaaccttggttaacggaaag-3，（序列號 79)
[0266] 引物 ACS-10_2R :5' -tcagcaaagatggccttgggctgg-3'（序列號 8〇)
[0267] cDNA(序列號 49)
[0268] CDS (序列號 48) :2076bp
[0269] ORF (序列號 46) :2073bp
[0270] 氨基酸序列（序列號47) :691氨基酸（參照圖19)
[0271] 外顯子數：8、內含子數：7(參照圖20)
[0272] (Il)MaACS-Il
[0273] 引物 ACS-11-1F :5'-gtcaagggcgagactcgcatcc-3'（序列號 8I)
[0274] 引物 ACS_11_2R :5' -cggtgacgatggtcatggactgc-3'（序列號 82)
[0275] cDNA(序列號 54)
[0276] CDS(序列號 53) :2043bp
[0277] 0RF(序列號 51) :2040bp
[0278] 氨基酸序列（序列號52) :680氨基酸（參照圖21)
[0279] 外顯子數：3、內含子數：2(參照圖22)
[0280] (12) MaACS-12
[0281] 引物 ACS-12-1F :5,-gcgagacccgcatccgccgctcc-3，（序列號 83)
[0282] 引物 ACS-12-2R :5' -gaccgtcctcgcccagggtgtcg-3'（序列號 84)
[0283] cDNA(序列號 59)
[0284] CDS(序列號 58) :2043bp
[0285] 0RF(序列號 56) :2040bp
[0286] 氨基酸序列（序列號57) :680氨基酸（參照圖23)
[0287] 外顯子數：3、內含子數：2(參照圖24)
[0288] 序列分析
[0289] 來自高山被孢霉（M. alpina)的12種ACS同源物的⑶S堿基序列間的同一性如 表1所不，氨基酸序列間的同一性如表2所不。MaACS-Il和MaACS-12顯不出堿基序列為 80. 2%、氨基酸序列為84. 3%的高的同一性。
[0290] [表 1]
[0291] 來自M. alpina的ACS同源物的⑶S堿基序列間的同一性

【權利要求】
1. 一種多核苷酸，其特征在于，為選自以下（a)?（e)中任一項所述的多核苷酸： (a) 多核苷酸，其含有選自序列號56所示的堿基序列中的任一個堿基序列； (b) 多核苷酸，編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自序列號57所示的氨基酸序列中的任 一個氨基酸序列組成； (c) 多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自序列號57所示的氨基酸序列中的 任一個氨基酸序列中1?1〇〇個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組 成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加 的活性或使組成改變的活性； (d) 多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質具有與選自序列號57所示的氨基酸序列 中的任一個氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在 宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸量增加的活性或使組成改變的活性；及 (e) 多核苷酸，其與由選自序列號56所示的堿基序列中的任一個堿基序列的互補堿基 序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表 達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性或使組成改變的活性的蛋白質。
2. 根據權利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，為以下（f)或（g)中任一項所述的 多核苷酸： (f) 多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質由選自序列號57所示的氨基酸序列中的 任一個氨基酸序列中1?10個氨基酸發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成， 且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的 活性或使組成改變的活性；及 (g) 多核苷酸，其編碼如下蛋白質，該蛋白質具有與選自序列號57所示的氨基酸序列 中的任一個氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在 宿主細胞表達時使該宿主細胞產生的脂肪酸的量增加的活性或使組成改變的活性。
3. 根據權利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，含有選自序列號56所不的堿基序 列中的任一個堿基序列。
4. 根據權利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，編碼由選自序列號57所示的氨基 酸序列中的任一個氨基酸序列組成的蛋白質。
5. 根據權利要求1?4中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，為DNA。
6. -種蛋白質，其特征在于，由權利要求1?5中任一項所述的多核苷酸編碼。
7. -種載體，其特征在于，含有權利要求1?5中任一項所述的多核苷酸。
8. -種非人轉化體，其特征在于，導入了權利要求1?5中任一項所述的多核苷酸或導 入了權利要求7中所述的載體。
9. 一種脂質或脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，從權利要求8中所述的轉化體 的培養物中提取脂質或脂肪酸組合物。
10. 根據權利要求9中所述的方法，其特征在于，所述脂質為三酰甘油。
11. 根據權利要求9中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸為碳數18以上的多不飽和 脂肪酸。
12. -種食品、醫藥品、化妝品或肥皂，其特征在于，含有通過權利要求9中所述的制造 方法提取的脂質或脂肪酸組合物。
【文檔編號】A61Q5/02GK104388439SQ201410513061
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2011年2月1日 優先權日:2010年2月1日
【發明者】落合美佐 申請人:三得利控股株式會社