專利名稱：環介導等溫擴增技術檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種改進的環介導等溫擴增新方法及其在檢測貝氏柯克斯體中的應用。
背景技術：
貝氏柯克斯體又稱伯納特柯克斯體(Coxiella burnetti),俗稱Q熱立克次體,是引起Q熱的病原體，屬于立克次體科、立克次體族、柯克斯體屬，為革蘭陰性小桿菌或球桿菌，能通過細菌濾器。電鏡觀察，伯納特柯克斯體整個細胞可分為三部分由微莢膜、細胞壁和胞質膜構成的外表層；胞質膜內的含核糖體顆粒的致密外周層；由染色體細絲纏繞而成的中央致密體。系統發育研究表明，貝氏柯克斯體與其他立克次體親緣關系相距甚遠，它屬變形菌綱的Y亞群，與肺炎軍團菌關系密切。 貝氏柯克斯體的實驗室檢測常用血清學診斷和病原體分離，但耗時長、檢出率不高。因此，國內外都相繼將聚合酶鏈反應(PCR)技術用于其實驗室檢測的研究，其方式各有差異。
發明內容
針對現有技術存在必須經電泳凝膠成像才可以觀察結果，或濁度儀顯示的結果信噪比低的問題，本發明的目的在于提供一種具有操作簡單、反應快速、耗時短等優點的環介導等溫擴增技術檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法。為實現上述目的，本發明環介導等溫擴增技術檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法，包括根據貝氏柯克斯體coml基因序列作為靶序列，比對后選取保守區域，引物設計和合成過程中包括兩個外引物和兩個內引物的設計和合成，內引物FIP(上端內引物)包含Flc序列和F2(F2c區域的互補序列)，即5' -Flc-F2;內引物BIP (下端內引物)包含Blc (BI區域的互補序列)和B2序列，即5，-B1C-B2。外引物為F3和B3序列，能特異結合靶序列上的6個特異區域。第一組靶基因序列及設計引物位置5 ' -TCCACCATTATTTAGTCAACCACCCAGAAGTTTTAGTAGAAGTATCCCA
GCATTGCAAAAAAAGACAGA^GCGCAACAAGAAGAACAf F3F2
gctcmcmgcmttamgaamtgcamG^TTATT^^^^
Flc
GGCAATGTTACATTGGTTGAATTTT TTCGATTATCAATGBlcB2
TGGCCA TTGCAAA G￡CMGMEI^rMncAAGC. TATCGTGAAACAAAATAAAAACCTCCGCGTTGTCTTCAAAGAACTGCCCATTTTTGGCGGCCAA-3，。
第二組靶基因序列及設計引物位置
5’ -AATACGCTGCCAAA GTATCATTAGCAGCCGCT^AACAAGGAAAATATTA
F3F "I
τγγλγγλγγγγγτγγτγλγτ QJCGACGGCCAATTATCAGATGCTT TCCACGACGCGCTGCTCAGT
__-- Γ I C
ACAAATCACCC τ「C AA ACCGC AG A A A A AGTAGG ,AJ TAAATGTTGCTCAGCTCAAB Ic
AAAAGACATGGATAATCCTGCT 從[[AM·叢AXAACX TTCCAAT
B 2<-
τα「丫1Tf，λ w'm
η -, ‘■ACAGCTAGCAGGCACCCCGACGTTCGTCATTGGTAATAAAGCGTTA-3’。
B j設計外引物和內引物為下面序列或其全部對應的互補序列第一組
F3 S--Gcattgcaaaaaaagacagaaj
B75 -GCTTGAATAACAGAATTCATGG-3 ■
FIP5 -GTGATGCAGGGTCGTTAAATAATTTGCGCAACAAGAAGAACAC-3 ’
BlP5 -C AGTGGCAGGCAATCCTCATTGGCCACATTGATAATCGA-3’_
LUUl 4」 第二組
Γ35GTATCATTAGCAGCCGCTA -3 ’
B'35 : GTAACGATTGAGCTAATTGGA -3
FIPr 5 '-TTGTTCTGATAATTGGCCGTCGA-CAAGGAAAATATTATGCTTTCCAC-3 -BIP_5,- TCAAACCGCAGAAAAAGTAGGAT-CACGCAGTTGTTTTTGGA-/進一步，所述外引物、內引物優選第一組。進一步，所述外引物內引物=比例范圍為I :Γ 12ο進一步,所述外引物:內引物=I 8ο進一步，所述環介導等溫擴增溫度為58°C 66°C。進一步，所述環介導等溫擴增溫度為63°C。進一步，所述環介導等溫擴增時間為15分鐘飛O分鐘。進一步，所述環介導等溫擴增時間為4(Γ60分鐘。進一步，所述非診斷性方法包括步驟①提取基因組DNA :取培養后菌液于EP管，離心，收集后，棄上清，用dH20重懸洗滌細菌，離心，棄上清，重復一次，最后用dH20重懸，沸水浴處理裂解細菌，離心，使細菌蛋白質等雜質沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，_20°C冰箱放置備用或采用基因組DNA提取試劑盒進行提取；②利用所述外引物F3、B3和內引物FIP、BIP、樣品基因組NDA、酶、緩沖液配制25 μ L反應體系；③環介導等溫擴增。進一步，所述25 μ L反應體系組分如下
權利要求
1.環介導等溫擴增技術檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法，其特征在干，該非診斷性方法包括 以貝氏柯克斯體coml基因序列作為靶序列，比對后選取保守區域，設計外引物F3、B3和內引物FIP、BIP為下面序列或其全部對應的互補序列
2.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內引物=比例范圍為I :4 I 12o
3.如權利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內引物=I:8。
4.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增溫度為58 0C "65 0C ο
5.如權利要求4所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增溫度為63°C。
6.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增時間為15分鐘 60分鐘。
7.如權利要求6所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增時間為60分鐘。
8.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述非診斷性方法包括步驟 ①提取樣品基因組DNA:取培養后菌液于EP管，離心，收集后，棄上清，用dH20重懸洗滌細菌，離心，棄上清，重復一次，最后用dH20重懸沸水浴處理裂解細菌，離心，使細菌蛋白質等雜質沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，_20°C冰箱放置備用或使用基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取； ②利用所述外引物F3、B3和內引物FIP、BIP、提取的基因組DNA、酶、緩沖液配制25μ L反應體系； ③環介導等溫擴增。
9.如權利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述25μ L反應體系組分如下
10.如權利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述等溫擴增采用恒溫水浴、PCR、Real-time PCR、LC320濁度儀、Geniell，使用儀器GenieII進行擴增時，試劑中加入SYBR Green I染料再進行擴增；使用所述熒光定量PCR儀進行擴增時，試劑中加入SYBRGreen I染料，進行擴增時選用SYBR通道進行熒光信號收集；試劑中加入鈣黃綠素進行擴增時選用FAM通道進行熒光信號收集。
全文摘要
本發明公開了一種環介導等溫擴增技術檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法，LAMP方法操作簡單，反應快速，在恒溫條件下進行1小時完成，耗時短實現反應及產物檢測一步完成，操作簡便，檢測成本低。本發明為貝氏柯克斯體的檢測提供了新的發展方向，有望成為簡易的常規檢測手段，尤其適用于基層檢驗檢疫機構，對于提高衛生水平、保證人類生命安全和推動衛生檢驗事業的發展具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102851386SQ20121036774
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者王靜, 楊宇, 楊永莉, 劉麗娟, 趙婷婷, 王旺, 王莎莎 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院