專利名稱：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白FnbA1及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術制藥領域，涉及一種耐·甲氧西林金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白A活性片段FnBAl重組蛋白，本發明進一步涉及該重組蛋白的制備方法及其在制備疫苗和檢測試劑盒中的應用。
背景技術：
抗藥性金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus 或Multiple-resistant Staphylococcus aureus,簡稱 MRSA)是金黃色葡萄球菌的一個獨特菌株，能抵抗所有青霉素，包括甲氧西林及其他抗β內醯胺酶的青霉素。MRSA首次發現于1961年的英國，現時已廣泛散播，在醫院中它更被稱為“超級細菌”。目前MRSA已成為全球I⑶病房、燒傷、戰創傷等感染率最高的病原菌之一。2005年美國的MRSA感染監控資料顯示，美國全年的嚴重感染人數為9. 4萬多人，致死病例約為1.9萬人，這一數字甚至超過艾滋病致死人數。2010年CHINET耐藥監測結果顯示MRSA檢出率較高，在金黃色葡萄球菌中，其平均檢出率為51. 7%。因其傳播途徑廣泛，易暴發流行；又由于其致病性強，呈多重耐藥而成為臨床上治療的難點。當前，MRSA已與乙型肝炎、AIDS被列為世界三大最難解決的感染性疾病，并位居首位。目前，萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最后一道防線，但1997年以來耐萬古霉素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌相繼被分離出來，可見抗生素的發展遠遠跟不上細菌耐藥性的發展，使得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌即將面臨無抗生素可治的嚴峻挑戰。因此，加強對MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。美國研發的MRSA疫苗已進入III期臨床試驗階段，因此，研發具有自主知識產權的、高效、安全、經濟的MRSA疫苗對控制MRSA感染、耐藥性發展、生物恐怖防御和提高國際競爭力具有重要意義。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗原組分復雜，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護性抗原的難度較大，方法繁瑣，不利于疫苗的產業化制備。利用基因工程技術將菌體有效的保護性抗原進行克隆表達使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。金黃色葡萄球菌表面的粘附素是一類能夠介導細菌粘附與寄主細胞表面進而引發疾病的膜蛋白，其中纖連蛋白結合蛋白A是重要的粘附素之一，能夠介導金黃色葡萄球菌結合與細胞表面的纖連蛋白，使細菌黏附于寄主細胞表面，促進細菌對寄主組織的入侵，目前分離到的大多數金黃色葡萄球菌都能夠與細胞外基質上的纖連蛋白特異性的結合。
發明內容
針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的高耐藥性，本發明提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白A活性片段FnBAl重組蛋白，其可應用于制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。鑒于FnBA蛋白為兩次跨膜蛋白，其胞外區對應28-943的氨基酸序列，并且其粘附主要由胞外區的蛋白質發揮作用，為了在最大限度上保持FnBA的結構和功能不發生較大的變化，本發明為將FnBA (其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述，其氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示)截短后進行克隆、表達和保護性免疫的評價，將FnBA截短后的片段命名為FnBAl(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示)。本發明還提供一種用于表達FnBAl重組蛋白的重組表達載體，其包含編碼所述FnBAl重組蛋白的核苷酸序列以及載體序列。本發明優選采用PGEX-6P-2載體來構建重組表達載體，表達FnBAl重組蛋白，pGEX是由Smith和Johnson于1987年構建的表達融合蛋白的載體,其主要特點是載體上接有一個分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，所表達的融合蛋白中就含有一個GST標簽，此標簽是蛋白純化的標記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構象和免疫原 性。因此，本發明還提供一種宿主菌，其導入有上述構建的重組表達載體。本發明還提供一種表達FnBAl重組蛋白的方法，其包含以下步驟I)設計下身弓丨物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成以獲得編碼FnBA蛋白活性片段的核酸序列；2)使用步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達載體構建重組載體，然后將該重組載體轉化至宿主菌；3)誘導轉化后的宿主菌表達重組蛋白；以及4)純化重組蛋白。本發明設計的正向引物和反向引物的優選核苷酸序列分別如SEQ ID NO :5和SEQID NO 6 所示。所使用的宿主菌優選大腸桿菌XLl bule。本發明還提供一種FnBAl重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗中的應用。本發明還提供一種FnBAl重組蛋白在制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑盒中的應用。本發明采用基因工程技術克隆表達此截短的保護性抗原成分FnBAl蛋白，表達量高，便于分離純化，而且高效安全。FnBAl重組蛋白可以直接與佐劑(如Al (OH)3佐劑、MF59、A1S03、A1S04、不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑、分枝桿菌卡介苗佐劑等)配合使用，適用于注射免疫接種。本發明的基因工程重組蛋白的表達方法具有以下優點1) FnBAl重組蛋白表達質粒在原核表達系統一大腸桿菌中誘導表達；2)選擇pGEX載體系列時，FnBAl重組蛋白以融合蛋白形式表達；表達載體上接有一個分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，所表達的融合蛋白中就含有一個GST標簽，此標簽就成為蛋白純化的標記，使得純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而純化后的蛋白能最大限度保持其空間構象和免疫原性；純化出來的FnBAl重組蛋白純度大于95% ；3)FnBAl重組蛋白均能夠誘導動物產生特異性的抗體。利用本發明FnBAl重組蛋白制備的亞單位疫苗可通過皮下(肌肉)注射途徑進行免疫接種，激發機體產生高滴度IgG抗體和細胞免疫應答。并經動物實驗證實，所述基因工程重組多價疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保護效果。為進一步的聯合疫苗和多亞單位融合疫苗研究打下基礎，同時為防治疫苗和診斷試劑盒的研制及應用具有重要的作用。為了使本發明目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
圖1是FnBAl基因片段的PCR擴增結果，其中泳道1:核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2 目的基因片段FnBAl (1419bp)。
圖2為表達載體pGEX-6p-2-FnBAl (1419bp)的酶切鑒定結果泳道1:核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2 :重組表達質粒pGEX-6p-2_FnBAl經酶切后的鑒定結果，酶切后分離的片段4800bp 和 1419bp ；圖3表示不同溫度下誘導蛋白表達結果泳道10 :蛋白分子量標準(Marker)；泳道1、3、5 :表達載體分別在16°C、25°C、30°C下誘導表達后，在上清中獲得的蛋白；泳道2、4、6 :表達載體分別在16°C、25°C、30°C下誘導表達后，在沉淀中獲得的蛋白。圖4表示含GST標簽的融合蛋白酶切結果泳道1:蛋白分子量標準(Marker)；泳道2 :酶切前，含有GST標簽的融合蛋白；泳道3 :酶切后，在上清獲取的目的蛋白；泳道4 :酶切后，洗漆用于結合表達蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝膠柱(beads)獲取的目的蛋白；泳道5 :酶切后，非特異性結合在beads的目的蛋白和特異性結合在beads上的酶和GST標簽。圖5是利用在線生物信息軟件對FnBA蛋白跨膜區預測結果圖。圖6重組表達載體測序后與FnBAl的核酸序列對比結果。
具體實施例方式本發明所使用的菌株與各種試劑如下1.菌株金黃色葡萄球菌MRSA-252國際標準株由美國ATCC提供；2.試劑質粒pGEX-6p_2、大腸桿菌菌株XL-lblue為申請人教研室保存，prime STAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性內切酶 BamH I 和 Not1、蛋白Marker為大連TakaRa公司產品；
質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為美國Omega公司產品；細菌基因組提取試劑盒、超薄回收試劑盒以及顯色液為天根公司產品；T4 DNA Ligase 為 Fermentas 公司產品；谷胱甘妝-瓊脂糖凝膠Glutathione Sepharose 4B為美國GE Healthcare公司
女口
廣叩O實施例1 :耐甲氧西林金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白A活性片段FnBAl活性片段的克隆
1.首先根據MRSA-252 FnBA蛋白全長基因序列，應用生物信息軟件進行結構分析，確定需要擴增的FnBAl目的基因片段。2.根據分析結果，采用PCR方法自MRSA-252基因組擴增FnBAl目的基因片段，擴增步驟如下I)設計PCR引物如下，分別為SEQ ID NO :5_6 (下劃線示酶切位點堿基序列)FnBAl-F SEQ ID NO 55' -CGCGGATCCATG GGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3,BamH IFnBAl-R SEQ ID NO 65' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAT CCATTATCCCATGTTAATGTAT-3'Not I2) _80°C冷凍庫中取出保存的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252專用固體培養基上，于37 °C培養過夜，再挑取單菌落接種于MRSA-252專液體體培養基中培養8個小時，參照細菌基因組抽提試劑盒抽提MRSA基因組。3)以MRSA-252全基因組DNA為模板PCR擴增FnBAl基因片段PCR 體系
模板(239.2 ng/μ ) 2.5μ1FnBAl-F (50μΜ) Ιμ FnBA1-R (50μΜ) Ιμ Taq 酶 2·5μ1dNTP 2μ1Buffer 15μ1滅菌雙蒸水_26μ1
總體積50μ1PCR擴增反應條件98°C預變性5min，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin30s, 30個循環，72°C完全延伸6min。反應完畢后使用1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結果，PCR擴增結果示于圖1中。
4)使用凝膠回收試劑盒回收FnBAl PCR產物。3. PCR產物的鑒定與克隆，步驟如下I) BamH I和Not I酶切pGEX_6P_2質粒和FnBAl PCR產物酶切反應體系
權利要求
1.一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌FnBA蛋白活性片段的重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.如權利要求1所述的重組蛋白，其特征在于，編碼該重組蛋白的核酸序列如SEQID NO:1所示。
3.—種如權利要求1或2所述重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)設計正向引物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成以獲得編碼FnBA蛋白活性片段的核酸序列；2)將步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達載體構建重組載體，然后將該重組載體轉化至宿主菌；3)誘導轉化后的宿主菌表達重組蛋白；4)純化重組蛋白。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟I)所述正向引物和反向引物分別如SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示。
5.一種表達載體，其特征在于，包含編碼權利要求1所述重組蛋白的核酸序列。
6.如權利要求5所述的表達載體,其特征在于，所述表達載體為pGex系列載體、pET系列載體或PQE系列載體，優選為pGeX-6P-2。
7.—種表達如權利要求5或6所述表達載體的宿主菌。
8.如權利要求7所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，優選為大腸桿菌XLl-blue。
9.權利要求1所述的重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗中的應用。
10.權利要求1所述的重組蛋白在制備耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbA1及制備方法和應用。本發明還公開了構建所述重組蛋白的表達載體、轉化宿主菌而制備該重組蛋白的方法以及所述重組蛋白在制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的亞單位疫苗以及相關檢測試劑盒中的用途。本發明采用上述方法制備的重組蛋白，便于分離純化而且高效安全，表達量高。動物試驗證明制備的重組蛋白可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。
文檔編號C12N1/21GK103012568SQ20121037884
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者鄒全明, 樊紹文, 盧陸, 曾浩, 馮強, 吳翼, 蔡昌芝, 董衍東, 魯東水 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫大學