專利名稱：一種基于串聯多內對照的檢測拷貝數變異的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及基于熒光通用引物的和單質粒串聯多內對照的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，應用于生物科學研究與臨床分子診斷。
背景技術：
拷貝數變異(copy number variations, CNVs)是近年來發現的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中lkb 3Mb的DNA片段的結構變異現象。CNVs廣泛存于基因組中，與一些遺傳性疾病的發生相關，對人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準確和低成本的CNVs分型檢測技術。隨著生物技術的發展，不同的研究小組相繼開發了許多的檢測方法，主要包括以雜交為基礎和以PCR為基礎的檢測技術。前者可以在全基因組水平上對CNVs進行檢·測，代表技術有微陣列比較基因雜交(SolinasToldo, Lampel et al Genes ChromosomesCancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因組 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. CancerRes. 2005 Aprl5; 65 (8) : 3053-8)、代表性寡核昔酸微陣列技術(Lucito, Healy etal. Genome Res. 20030ct; 13 (10) : 2291-305. Epub 2003 Sep 15.)等，其優點是通量高且易于實現自動化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期長的缺點。后者主要是針對具體的目標位點進行檢測，代表性的技術有實時熒光定量PCR、多重連接探針擴增技術(MLPA) (Schouten, McElgunn et al. NucleicAcids Res. 2002 Jun 15;30 (12):e57)和多重可擴增探針雜交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000 Jan15;28(2) :605-9.)等。實時熒光定量技術有操作簡單、重復性好、實驗周期短等優點，但是檢測通量較小；與實時熒光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測通量有了很大提高，不過PCR微環境的變化會導致不同位點不能完全同步擴增，而且PCR的平臺效應也會影響檢測結果。以PCR為基礎的檢測技術存在一個共同的缺陷就是待測樣本和對照樣本是分開檢測的，這樣兩者PCR效率的差異會引起檢測結果的偏差。競爭性PCR克服了這個缺陷，實現CNVs的快速、準確、經濟的檢測。在PCR擴增過程中，PCR產物的量可以用公式Y=A (1+R) n來表示，其Y表示PCR產物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴增效率，η表示PCR的循環數，當PCR擴增效率相同時，PCR產物的量與初始模板的量成正比。競爭性PCR利用了這一原理，在同一 PCR反應體系中涉及兩組模板，一組是待測樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內對照，兩組模板僅在目標序列長度上(存在一些堿基的插入或缺失)存在一些差異，其他反應條件一致，因此兩者擴增效率接近一致，兩種擴增產物量的比直觀的反映了初始模板(待測樣本和內對照不存在拷貝數差異)量的比，可以根據內對照的初始模板的量來計算樣本的濃度。在檢測拷貝數變異時，當兩模板具有相同的濃度或削除了濃度差異帶來的影響時，PCR產物量的比值就反映模板拷貝數的差異。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic AcidsRes. 2007; 35 (3) :el9. Epub 2006 Decl4)是基于競爭性 PCR 的一種檢測 CVNs 的一種方法，此方法的優點是待測位點和內對照共存于基因組序列中，但是缺點也是很明顯的，只能針對有限的基因位點進行檢測，而且針對不同檢測位點都要設計一對熒光引物，加大了實驗成本。內對照可以采用人工合成的方法，還有其他的一些制備方法(Zentilin and GiaccaNat Protoc. 2007; 2 (9) :2092-104.)。但如果需要同時進行十多個位點的檢測時，制備多個內對照會花費很多的時間，同時后續多個內對照的定量及其相互間的混合也是非常的繁瑣和復雜。所以本實驗提供一個方案，可非常方便制備多個內對照且省去了后續內對照混合的過程，也大大緩解了后續實驗中內對照污染的問題。
發明內容
本發明要解決的技術問題是填補現有技術的空白，提供一種成本低、通量較高、樣本需求低、檢測靈敏性高、僅制備一種質粒即能完成制備所有位點內對照操作簡單的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法。在總結現有技術中各種檢測方法的優缺點基礎上，發明人經過自主創新研發，令人驚奇地發現通過如下設計，可以成功解決上述技術問題，并且成功應用于生物科學研究與臨床分子診斷等領域。本發明的目的通過以下技術方案實現·本發明的技術方案之一是提供一種多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟(I)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測區段和一對位于參照區段的上下游嵌合特異引物組成所述通用熒光引物長度范圍為l(T25bp，5’端用熒光標記，TM值彡57°C值，且通用引物對待測基因組具有特異性；所述嵌合特異引物針對待測區段和參照區段設計，TM值>62°C，長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3，端和5，端的序列之間插入兩個喊基的固定組合；所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異；(2)提供一種全長內對照DNA，其序列特征在于所述的全長內對照含有待測區段和參照區段的引物間所有序列，每條全長內對照序列含串聯的至少I個拷貝的待測區段和至少I個拷貝的參照區段，除了在每個內對照區段序列的非引物區增加或減少1-5個任意堿基使得所述的內對照序列比待測區段和參照區段長或短1-5個堿基外，每個內對照序列與待測區段和參照區段分別完全一致；相鄰的內對照區段間和所述全長內對照的兩側均有限制性內切酶的酶切位點，且所述的酶切位點不存在于任何一個內對照序列中；使用時，將定量后的全長內對照DNA用限制性內切酶充分消化后，獲得獨立的內對照片段，定量稀釋后獲得內對照稀釋液；(3)多重競爭性PCR反應(a)將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數倍摩爾數的內對照稀釋液混合在一起，然后進行PCR，在前Γ16個循環中，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異引物引導的擴增，在后17 20個循環中，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用熒光引物引導的擴增，且兩組退火溫度的差距彡5°C ；(b)根據熒光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區段和參照區段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的熒光強度信息；(4)數據分析i.計算每個待測區段和參照區段的樣本峰高和/或峰面積(S)和內對照的峰高和/或峰面積(I)，得到每個待測區段和參照區段的比值(S/I);ii.以一個參照區段的比值為標準，將所有待測區段和參照區段的比值同其作比，進行數據內部標化；iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化；
iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值，該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。上述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法的優選方案之一為，所述通用熒光引物長度范圍為18 20bp。上述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法的優選方案之二為，所述嵌合特異引物和所述參照引物長度范圍分別為38 45bp，且所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異序列段長度范圍分別為18 20bp。上述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法的優選方案之三為，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度范圍為12(T350bp，且所述的可檢出的長度差異為8 50bp。上述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法的優選方案之四為，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、或者兩對、三對或四對不同熒光標記的通用熒光引物。本領域的技術人員通過現有的四色熒光標記技術和ABI測序儀(如3130/3730)等的四色熒光檢測系統，可以非常容易地將本發明的藍色熒光標記通用熒光引物的實施例擴展至兩色、三色或者四色標記的兩對、三對或四對通用熒光引物；在多重PCR技術領域，多至幾十對的在序列上無同源性的引物對在同一 PCR反應體系中分別實現獨立的擴增反應也是常規技術。作為一種實施方式，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一對到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三對到六對針對相同或不同基因的參照引物組成。在另一種實施方式中，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到二十對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。在又一種實施方式中，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到十五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。與上述有關多重PCR技術領域的描述相同，現有技術提供了多于二十對、三十對、乃至更多對引物在同一 PCR反應體系中分別實現獨立的擴增反應的原理、方案、和具體操作指導；本發明的具體實施方式
在這樣的技術背景下，不應被視為對其他實施方式的限制，即現有技術完整地提供了實現其他實施方式的充分和必要條件。上述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法的優選方案之五為，所述的全長內對照片段用全基因合成的方法、或者同源重組法構建于質粒中。本發明的技術方案之一是提供一種基于上述技術方案之一所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異方法的試劑盒，包括至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物、至少一對參照引物、和定量的全長內對照DNA或者內對照稀釋液、和/或多重競爭性PCR的反應試劑。有益.效果本發明提供了現有技術文獻中所缺乏的成本低、通量高、適用性好、方案建立時間短的CNVs檢測方法。本發明令人驚奇地發現具有以下優點I、成本低。針對所有的檢測位點，應用了通用熒光引物，并采用同一的參照區段，這些措施都大大降低了實驗成本。2、內對照的處理時間短，由原本處理多個甚至十多個內對照片段變成處理一個內對照片段，大大降低了實驗復雜度，且降低了質粒污染的風險。
3、數據更準確。本發明中使用了通用熒光引物，而引物的3’端統一為Ct兩個堿基，保證了不同位點擴增的同步性和起始效率的一致性。實驗周期短。相對于MLPA技術(需要兩天)來講，一天內就可以得到實驗結果。可對少量樣本多個基因進行同時檢測，大大縮短了實驗周期，提高了實驗效率。
圖I為一個參照區段和三個目標區段的多重PCR的試驗結果。圖2為圖I的多重PCR的試驗的原理示意圖(分析過程中涉及兩組引物一組是多重上下游嵌合特異引物；另一組是熒光通用引物)。圖3為全長內對照序列結構示意圖。圖4為實施例I中樣本檢測結果示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I利用本發明所述的方法對3個轉基因小鼠(ZYJ-1、ZJY-2、ZJY_3)進行了拷貝數的檢測，另外還包括2只C57BL/6小鼠(其中一只為雌性B6F，一只為雄性B6M)為對照樣本。實驗步驟I、通用引物、嵌合特異引物的設計通用引物的設計設計原則保證上下游引物的TM值彡57°C，且差距不超過3°C，針對小鼠和人基因組特異，引物相互作用小，上游通用引5’端用Fam熒光標記。通用引物序列為上游5’ -TTCATCCGTTCGTCCTAC-3’ ；下游5’ -ACAGCGTCAATCTCGTTC-3’。嵌合特異引物的設計根據小鼠轉基因的區段，我們選擇了 3個目標基因和5個參基因區段(其中3個位于常染色個上，2個位于X染色體上)，共設計了 8對特異引物，并與通用引物組合成特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基，要求TM值> 62°C，擴增產物的長度在12(T350bp之間，相鄰產物長度的差至少為8bp。所有的引物均經過Blast和Oligomask軟件的分析,從而減少非特異擴增和引物二聚體。
表一目標區段和參照區段的嵌合特異引物序列
權利要求
1.一種多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟 (1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測區段和一對 位于參照區段的上下游嵌合特異引物組成 所述通用熒光引物長度范圍為l(T25bp，5’端用熒光標記，TM值彡57°C值，且通用引物對待測基因組具有特異性； 所述嵌合特異引物針對待測區段和參照區段設計，TM值彡62°C，長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之間插入兩個堿基的固定組合；所有嵌合特異引物之間的TM值的差異不超過:TC ； (2)所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異； (3)提供一種全長內對照DNA，其序列特征在于所述的全長內對照含有待測區段和參照區段的引物間所有序列，每條全長內對照序列含串聯的至少I個拷貝的待測區段和至少I個拷貝的參照區段，除了在每個內對照區段序列的非引物區增加或減少1-5個任意堿基使得所述的內對照序列比待測區段和參照區段長或短1-5個堿基外，每個內對照序列與待測區段和參照區段分別完全一致；相鄰的內對照區段間和所述全長內對照的兩側均有限制性內切酶的酶切位點，且所述的酶切位點不存在于任何一個內對照序列中；使用時，將定量后的全長內對照DNA用限制性內切酶充分消化后，獲得獨立的內對照片段，定量稀釋后獲得內對照稀釋液； (4)多重競爭性PCR反應 (a)將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數倍摩爾數的內對照稀釋液混合在一起，然后進行PCR，在前3 16個循環中，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異弓I物引導的擴增，在后17 20個循環中，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用熒光引物引導的擴增，且兩組退火溫度的差距^ 5 0C ； (b)根據熒光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區段和參照區段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的熒光強度信息； (5)數據分析 1.計算每個待測區段和參照區段的樣本峰高和/或峰面積(S)和內對照的峰高和/或峰面積(I)，得到每個待測區段和參照區段的比值(S/I); ii.以一個參照區段的比值為標準，將所有待測區段和參照區段的比值同其作比，進行數據內部標化； iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化； iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比,獲得待測樣本與對照樣本的比值,該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。
2.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述通用熒光引物長度范圍為18 20bp。
3.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物長度范圍分別為38 45bp，且所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異序列段長度范圍分別為18 20bp。
4.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度范圍為12(T350bp，且所述的可檢出的長度差異為8 50bpo
5.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物含一對通用熒光引物、或者兩對、三對或四對不同熒光標記的通用熒光引物。
6.根據權利要求5所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一對到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三對到六對針對相同或不同基因的參照引物組成。
7.根據權利要求6所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到二十對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。
8.根據權利要求7所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到十五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。
9.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的全長內對照片段用全基因合成的方法、或者同源重組法構建于質粒中。
10.一種基于權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異方法的試劑盒，包括至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物、至少一對參照引物、和定量的全長內對照DNA或者內對照稀釋液、和/或多重競爭性PCR的反應試劑。
全文摘要
本發明涉及基于通用熒光引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括下列步驟(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測區段和至少一對位于參照區段的嵌合特異引物組成；(2)構建一個全長內對照序列，通過限制性內切酶消化獲得所有內對照片段；(3)多重競爭性PCR反應過程；和(4)數據分析。本發明還提供基于以上分析方法的試劑盒，適用于5~28個基因/反應的拷貝數變異的檢測，是一種快速、中通量、經濟的拷貝數變異檢測方案。
文檔編號C12Q1/68GK102943109SQ20121037885
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月8日 優先權日2012年10月8日
發明者陸炯, 陳軼群, 肖君華 申請人:上海翼和應用生物技術有限公司