禽博爾納病毒檢測用引物組、試劑盒及其使用方法

專利名稱：禽博爾納病毒檢測用引物組、試劑盒及其使用方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種禽博爾納病毒檢測用的引物、試劑盒及其使用方法。
背景技術：
禽博爾納病毒(AvianBornavirus, ABV)是從腺胃擴張癥(ProventricularDilatation Disease，H)D)患病鸚鵡體內分離的一種新的博爾納病毒(BDV)。BDV可在宿主中樞神經系統內持續感染，其全部生活史在神經元細胞核內完成，病毒感染后基因與宿主細胞染色體融合，可在宿主基因組內檢出病毒DNA序列。禽類是BDV重要自然疫源地，曾在鳥類活動池塘中收集的糞便樣品中檢出病毒株。據記載，1970年代首次報道發生TOD，最初主要在北美洲籠養鸚鵡中發生。由于廣泛的商貿活動，使得PDD在寵物鳥中持續傳播，世界各地均有報道，出現50余種鸚鵡感染發病。此外，巨嘴鳥、加拿大鵝、鴕鳥、番鴨、鴿、鷯哥、貓頭鷹、游隼、鷲、密雀、織雀及其它雀形目鳥類已經檢出病毒。研究顯示ABV可侵入禽類神經系統，導致PDD類非化膿性炎癥，主要影響胃腸道上部自主神經系統功能，包括食道、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指腸等。其中腺胃擴張受到影響，不能正常蠕動，微生物在其中過度繁殖，導致動物出現敗血癥和死亡。患病禽鳥常見消瘦、食欲減退、異嗜、食物返流、糞內出現未消化食物、腹瀉、腹部腫大、肌肉萎縮、多尿等。也可見中樞神經癥狀，如共濟失調、頭部運動失常、本體感受不足、運動無力等。總之，目前PDD在世界各國廣泛分布，致死率很高，使鸚鵡等各種珍稀禽鳥受到極大威脅。因此，如果能夠有效地對PDD病毒分離鑒定，不僅能夠廣泛地運用于此類病源的檢驗檢疫，也為研究這種RNA病毒在宿主體內致病機制的動物模型打下基礎
發明內容
本發明的所解決的技術問題在于提供一種用于環介導等溫擴增技術檢測禽博爾納病毒，且對禽博爾納病毒基質蛋白基因具有高特異性的檢測用引物組。本發明的所解決的技術問題還在于提供一種利用環介導等溫擴增技術檢測禽博爾納病毒的試劑盒，其檢測效果良好、特異性高、漏檢率低；同時本發明還提供了所述試劑盒的使用方法。本發明的目的可以通過以下技術措施實現:一種禽博爾納病毒檢測試劑盒，所述引物組是以禽博爾納病毒基質蛋白基因為靶基因，基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物:內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。優選地，所述引物組為如下引物組合的其中之一:外引物F3 (ID19):GCCGACATTAATGCTTGA,外引物B3(ID19): CCAAGAAGTCATCAATCTGAA,
內引物FIP(ID19):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，內引物BIP(ID19):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT ；或外引物F3(ID30): CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT,外引物B3(ID30):GGATCCTTGTAGACAGCTAT,內引物FIP(ID30):TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，內引物BIP (ID30):GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC ；或外引物F3(ID37):TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC,外引物B3(ID37):CCTTATCGGATCCTTGTAGAC,內引物FIP(ID37):CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG,內引物BIP(ID37):GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。本發明的提供的一種禽博爾納病毒檢測試劑盒，所述禽博爾納病毒檢測試劑盒包括以禽博爾納病毒基質蛋白基因為靶基因，基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物:內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。優選地，所述引物組為如下引物組合的其中之一:外引物F3(ID19):GCCGACATTAATGCTTGA,外引物B3(ID19):CCAAGAAGTCATCAATCTGAA,內引物FIP (IDl9):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，內引物BIP (ID19):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT ；或外引物F3(ID30):CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT,外引物B3(ID30):GGATCCTTGTAGACAGCTAT,
內引物 FIP(ID30):TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，內引物BIP(ID30):GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC ；或外引物F3(ID37):TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC,外引物B3(ID37):CCTTATCGGATCCTTGTAGAC,內引物FIP(ID37):CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，內引物BIP(ID37):GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。

作為本發明禽博爾納病毒檢測試劑盒的優選實施方式，所述的禽博爾納病毒檢測試劑盒還包括Bst DNA聚合酶、逆轉錄酶、反應液、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液。作為本發明禽博爾納病毒檢測試劑盒更優選的實施方式，所述引物組中引物與反應體系混合后的濃度為:所述的內引物FIP/BIP各為0.016 0.032 μ mol/L,外引物F3/B3的濃度各為0.004 0.008 μ mol/L。本發明還提供一種禽博爾納病毒檢測試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟:(I)制備待測樣品RNA ；(2)在反應容器中加入Bst DNA聚合酶、逆轉錄酶、反應液、穩定液、待測樣品RNA、內引物FIP/BIP、外引物F3/B3，恒溫反應；(3)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；所述步驟(2)中的內引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以禽博爾納病毒的基質蛋白基因為靶基因、基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物。優選地，其特征在于，所述引物組中引物與反應體系混合后的濃度為:所述的內引物 FIP/BIP 各為 0.016 0.032 μ mol/L,外引物 F3/B3 的濃度各為 0.004 0.008 μ mol/L0作為本發明使用禽博爾納病毒檢測試劑盒的方法的優選實施方式，所述的兩對引物為所述的兩對引物為如下引物組合中的一組:外引物F3(ID19):GCCGACATTAATGCTTGA,外引物B3(ID19):CCAAGAAGTCATCAATCTGAA,內引物FIP(ID19):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT,
內引物BIP(ID19):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT ；或外引物F3(ID30):CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT,外引物B3(ID30):GGATCCTTGTAGACAGCTAT,內引物FIP(ID30):TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC,內引物BIP (ID30):GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC ；或外引物F3(ID37):TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，外引物B3(ID37):CCTTATCGGATCCTTGTAGAC,內引物FIP(ID37):CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，內引物BIP(ID37):GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。作為本發明使用禽博爾納病毒檢測試劑盒的方法的優選實施方式，步驟(3)中，步驟(2)中，恒溫反應的反應條件為溫度62 64°C，反應時間80 100min。本發明所說的基于環介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermalamplication of DNA,簡稱LAMP)快速檢測禽博爾納病毒的方法，是利用BstDNA聚合酶和根據靶基因序列設計的兩對特殊的內、外引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結果。LAMP反應是在恒溫(63 65°C)條件下45 90分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恒溫基因擴增技術與PCR技術(包括熒光實時定量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學指標上相當于或優于PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術。目前國家標準中以微生物分離培養和形態學鑒定為主、結合生化分析和血清學分型鑒定的通行方法，初步鑒定需2 3天，完成鑒定報告需10 15天；采用本發明的檢測試劑盒僅需2小時。并且，本發明的反應體系中加入了顯色液，鑒定結果更為直觀清晰。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:1.本發明的檢測試劑盒只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備，檢測成本低；2.本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性；3.本發明的檢測試劑盒擴增快速且高效，在不到I小時即可完成擴增，且產率高；
4.本發明的檢測試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了禽博爾納病毒基質蛋白基因作為靶基因設計引物，使得本發明的檢測試劑盒檢測禽博爾納病毒的準確率更高在本發明檢測試劑盒中采用特制的反應管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時方便操作。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。在本發明的各實施例中采用下列實驗材料進行實驗:儀器:·等溫擴增熒光檢測系統ESEQuant TS95 (德國QIAGEN公司)、Loopamp濁度儀LA-100和LA-320 (日本榮研化學株式會社)、倒置顯微鏡Axio Observer Zl (德國卡爾.蔡司公司)、PCR儀St印OnePlus (美國應用生物系統公司)、核酸自動純化儀Maxwell 16 MDX(美國Promega公司)、凝膠成像系統Bio-Vision++1000 (法國VILBER L0URMAT公司)、電泳儀DYY-TC (北京六一儀器廠)。試劑:RNA提取試劑盒D9108A (日本TaKaRa公司)、病毒總核酸純化試劑盒Maxwell 16AS1150 (美國 Promega 公司)、RT-PCR 試劑盒 DRR055A (日本 TaKaRa 公司)、PCR 產物 DNA 回收試劑盒D823A (日本TaKaRa公司)、RNA擴增(恒溫擴增法)試劑盒(廣州迪澳生物科技有限公司)、鈣黃綠素(日本EIKEN公司)、電泳緩沖液TAE IOx (美國Promega公司)。病毒樣品:患病金剛鸚鵡“色彩”和“琉璃363”大腸、小腸、十二指腸、心、肝、脾、肺、腎、肌胃、腺胃、腺胃內容物、胰腺、素囊、腦、肌肉等各一份，由廣東出入境檢驗檢疫檢局檢驗檢疫技術中心(IQTC)動檢實驗室保存和無害化處理。新城疫病毒I系、禽流感病毒H5Re-5株、法氏囊病病毒B87株、白血病病毒J亞群和腦脊髓炎病毒Van Roekel株樣品均由本室保存。實施例1樣品的制備及引物的選擇1、樣品的制備1.1、樣品的制備細胞培養對生長良好的單層豬睪丸(ST)細胞接種禽博爾納病毒檢測陽性樣品，37°C培養傳代，觀察細胞病變。胞培養傳代和病毒檢測利用鸚鵡“琉璃363”和“色彩”腺胃病料(其中，鸚鵡“琉璃363”和“色彩”為取樣禽類的名稱)無菌處理后接種ST細胞單層，置37°C培養5 7天，連續傳5代，出現細胞圓縮、脫落(

圖1 )，經RT-PCR檢測為陽性(圖3B)。
1.2、總 RNA 抽提:各種ABV檢測樣品按照總RNA抽提試劑盒RNAiso Plus/MiniBEST (Takara)和病毒總核酸純化試劑盒Maxwell 16AS1150說明書進行，制備的總RNA置_80°C保存備用。2、引物的選擇2.1、按照文獻方法進行ABV基質蛋白(M)基因RT-PCR擴增，引物序列如下:上游引物為5’ -CAAGGTAATYGTYCCTGGATGG-3，。下游引物為5 ’ -ACCAATGTTCCGAAGMCGAWAY-3 ’。2.2、利用DNAStar和PrimerExplorer V5.0 (網絡版)軟件進行禽博爾納病毒M基因序列分析和LAMP擴增的引物設計，共獲得IDI，6，19，30和37共5組引物，序列(5 ’ 一 3 ’)如下:引物組I外引物F3 (IDl):TAATCGTCCCTGGATGGC，外引物B3 (IDl):GAGTTCAGTGTTGAGGCC,內引物FIP(IDl):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACGACATTAATGCTTGAAATAGACTT，內引物BIP(IDl):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT。引物組2外引物F3(ID6):TAATCGTCCCTGGATGGC，外引物B3(ID6):CCAAGAAGTCATCAATCTGAA,內引物FIP(ID6):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTGAAATAGACTTTGTTGGCG,內引物BIP(ID6):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT。引物組3外引物F3(ID19):GCCGACATTAATGCTTGA,外引物B3(ID19):CCAAGAAGTCATCAATCTGAA,內引物FIP(ID19):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，內引物BIP(ID19):`CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT ；引物組4外引物F3(ID30):
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT,外引物B3(ID30):GGATCCTTGTAGACAGCTAT，內引物FIP(ID30):TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC,內引物BIP(ID30):GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC ；引物組5外引物F3(ID37):TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC,外引物B3(ID37):CCTTATCGGATCCTTGTAGAC,內引物FIP(ID37):CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，

內引物BIP(ID37):GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。實施例2樣品檢測試驗URT-LAMP (逆轉錄-環介導恒溫擴增)實驗制備RT-LAMP反應體系，含反應緩沖液(2X )12.5 μ1、內引物(FIP/BIP)(終濃度
0.4 0.8 μ Μ) I μ1、外引物(F3/B3)(終濃度 0.1 0.2 μ Μ) I μ l、Bst 聚合酶 0.8μ1、逆轉錄酶0.2 μ 1.RNA模板(I IOOng) 2.0 μ1、DEPC水7.5 μ I，總體積25 μ I。將上述試劑混勻，加入20 μ I密封液，點I μ I顯色液在反應管蓋中間，蓋緊，注意顯色液不能掉入反應液中。然后，將反應管放入Loopamp濁度儀LA-100內取出反應管將染料彈入反應液中，混勻后觀察顏色變化。呈現綠色為有核酸擴增(陽性+)，橙色為無核酸擴增(陰性_)。首先采用選擇RT-LAMP弓丨物利用實施例1中五組引物ID37、ID30、ID19、ID6和IDl建立RT-LAMP反應體系，前三種引物呈現陽性顯色反應(圖2)，反應產物電泳出現特異條帶(圖3Α)。后兩種未見顏色反應和條帶。ID37、ID30、ID19為本發明方案中的有效引物。2、RT-PCR及產物分析RT-PCR反應體系為PrimeScript —步法酶混合液2 μ 1、2Χ —步法緩沖液25 μ1、上游引物(20μ Μ) I μ1、下游引物(20μ Μ) I μ1、待檢總RNA 10 μ1、無RNase蒸餾水11 μ 1，總體積 50 μ I。RT-PCR 反應條件為 5(TC 30min,95°C 2min ；94°C 30sec、5(TC 30sec、72°C lmin，45個循環；72°C IOmin0按照pMD18_T Vector試劑盒說明書進行PCR產物克隆并測序，利用NCBI在線進行BLAST序列比對和樹視圖(Tree View)分析。3、電泳檢測LAMP和PCR反應產物使用10 X TAE緩沖液配制1.5 3.0%瓊脂膠，添加核酸染料GoldView (5μ L/100mL)，電泳(37V/25mA)觀察，拍照記錄結果。M基因擴增、序列分析和基因分型結果鸚鵡“琉璃363”和“色彩”腺胃均擴增出預計大小35Ibp的PCR產物(圖3B)。結合步驟二中RT-PCR及產物分析，產物序列(NCBI Bankltl518174)進行進化樹分析(NCBIBlast Tree View)(圖 4)，顯示為 ABV5 基因型。4、實時RT-LAMP將上述RT-LAMP反應體系置Loopamp濁度儀LA-320，63 °C反應90min，記錄實時濁度數據。在反應體系中添加鈣黃綠素I μ 1，置等溫擴增熒光檢測系統ESEQuant TS95儀器中，63°C反應90min，記錄熒光(FAM)數據。熒光和濁度檢測比較結果以鈣黃綠素為熒光指示劑，實時RT-LAMP分別在36min (ID30)、38min (ID37)和49min (ID19)出現擴增反應曲線，60min內擴增達到峰值(圖5);濁度測定時三者出現擴增曲線的時間分別為56min、58min和65min (圖6)。引物ID6和IDl進行熒光和濁度測定時均未出現擴增反應曲線。臨床及有關樣品檢測經RT-LAMP和RT-PCR檢測腺胃禽博爾納病毒呈陽性(見表一)，病毒ST細胞培養物RT-LAMP檢測10—1 10_5為陽 性，RT-PCR檢測10_3以后為陰性。新城疫病毒等有關病毒未見陽性反應。表一 30個樣品禽博爾納病毒RT-LAMP和RT-PCR檢測結果
權利要求
1.一種禽博爾納病毒檢測用引物組，其特征在于，所述引物組是以禽博爾納病毒基質蛋白基因為靶基因，基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物:內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根據權利要求1所述的禽博爾納病毒用引物組，其特征在于，所述引物組為如下引物組合的其中之一: 外引物F3 (ID19):GCCGACATTAATGCTTGA, 外引物B3 (ID19):CCAAGAAGTCATCAATCTGAA, 內引物 FIP (ID19):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT, 內引物 BIP (ID19):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT ； 或 外引物F3 (ID30):CTAAACATACCT TTCCTTTCAGT, 外引物B3 (ID30):GGATCCTTGTAGACAGCTAT， 內引物 FIP (ID30):TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC, 內引物 BIP (ID30):GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC ； 或 外引物F3 (ID37):TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC， 外引物B3 (ID37):CCTTATCGGATCCTTGTAGAC, 內引物 FIP (ID37):CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG, 內引物 BIP (ID37):GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
3.一種禽博爾納病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述禽博爾納病毒檢測試劑盒包括以禽博爾納病毒基質蛋白基因為靶基因，基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物:內引物FIP/BIP 和外引物 F3/B3。
4.根據權利要求3所述的禽博爾納病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述引物組為如下引物組合的其中之一: 外引物F3 (ID19):GCCGACATTAATGCTTGA, 外引物B3 (ID19):CCAAGAAGTCATCAATCTGAA, 內引物 FIP (ID19):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT, 內引物 BIP (ID19):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT ； 或 外引物F3 (ID30):CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT, 外引物B3 (ID30):GGATCCTTGTAGACAGCTAT， 內引物 FIP (ID30):TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC, 內引物 BIP (ID30):GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC ； 或 外引物F3 (ID37):TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC， 外引物B3 (ID37):CCTTATCGGATCCTTGTAGAC, 內引物 FIP (ID37):CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG, 內引物 BIP (ID37):GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
5.根據權利要求1所述的禽博爾納病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的禽博爾納病毒檢測試劑盒還包括Bst DNA聚合酶、逆轉錄酶、反應液、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液。
6.根據權利要求5所述的禽博爾納病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述引物組中引物與反應體系混合后的濃度為:所述的內引物FIP/BIP各為0.016 0.032 μ mol/L，外引物F3/B3 的濃度各為 0.004 0.008 μ mol/L。
7.一種使用如權利要求5所述的禽博爾納病毒檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)制備待測樣品RNA； (2)在反應容器中加入BstDNA聚合酶、逆轉錄酶、反應液、穩定液、待測樣品RNA、內引物FIP/BIP、外引物F3/B3，恒溫反應； (3)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性； 所述步驟(2)中的內引物FIP/BIP和外弓I物F3/B3為以禽博爾納病毒的基質蛋白基因為靶基因、基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物。
8.根據權利要求7所述的使用禽博爾納病毒檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述引物組中引物與反應體系混合后的濃度為:所述的內引物FIP/BIP各為0.016 0.032ymol/L，外引物 F3/B3 的濃度各為 0.004 0.008 μ mol/L。
9.根據權利要求7所述的使用禽博爾納病毒檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述的兩對引物為如下引物組合中的一組: 外引物F3 (ID19):GCCGACATTAATGCTTGA, 外引物B3 (ID19):CCAAGAAGTCATCAATCTGAA, 內引物 FIP (ID19):GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT, 內引物 BIP (ID19):CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT ； 或 外引物F3 (ID30):CTAAACATACCTTTCCT TTCAGT,外引物B3 (ID30):GGATCCTTGTAGACAGCTAT， 內引物 FIP (ID30):TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC, 內引物 BIP (ID30):GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC ； 或 外引物F3 (ID37):TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC， 外引物B3 (ID37):CCTTATCGGATCCTTGTAGAC, 內引物 FIP (ID37):CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG, 內引物 BIP (ID37):GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
10.根據權利要求7、8、或9所述的使用禽博爾納病毒檢測試劑盒的方法，其特征在于， 步驟(2)中，恒溫反應的反應條件為溫度62 64°C，反應時間80 lOOmin。
全文摘要
本發明提供一種禽博爾納病毒檢測用引物，所述引物組是以禽博爾納病毒基質蛋白基因為靶基因，基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發明還公開了一種禽博爾納病毒檢測試劑盒及其使用方法，采用本發明的技術方案能夠高效、準確地對禽博爾納病毒進行檢測，從而廣泛地運用于此類病源的檢驗檢疫，也為研究這種RNA病毒在宿主體內致病機制的動物模型打下基礎。
文檔編號C12Q1/68GK103074445SQ20121039279
公開日2013年5月1日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者林志雄, 田純見, 王宏, 羅瓊, 趙吟, 羅長保, 魚海瓊, 劉志玲, 陳茹, 吳曉薇, 朱道中 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心