一種快速培養含油微生物的方法

一種快速培養含油微生物的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速培養含油微生物的方法，包括：（1）培養含油酵母種子液；（2）培養自養微藻種子液；（3）將含油酵母種子液和自養微藻種子液接入具有內置膜分離裝置的封閉式光生物反應器內進行半混合培養，含油酵母在膜分離裝置內部培養，自養微藻在膜分離裝置以外的光生物反應器內生長，兩個反應器內培養基組成和培養條件一致，培養過程中補充含油酵母生長代謝所需有機碳源；所述光生物反應器還包括導流筒，膜分離裝置內置于導流筒內，出口與光生物反應器出口平齊；所述光生物反應器具有反光膜，反光膜貼在導流筒外表面。該法具有提高自養微藻和含油酵母細胞收獲量，提高無機碳源（CO2）的利用率，提高含油微生物油脂含量，簡化培養裝置等優點。
【專利說明】一種快速培養含油微生物的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種培養含油微生物的方法，具體地說涉及一種半混合培養自養微藻和含油酵母來獲取高含油微生物細胞收獲量，同時提高含油微生物細胞油脂含量的方法。
【背景技術】
[0002]隨著社會經濟發展，化石資源的供應日益緊缺、油品供需矛盾也日漸突出，相應的環境污染問題也更加突出，多渠道開發可再生資源成為必然。以微生物油脂等可再生資源為來源的生物柴油具有能量密度高、含硫量低、燃燒充分、潤滑性好等性能，還具有可再生、環境友好、易生物降解、儲運安全、抗爆性能好等特點，可作為石化能源的替代品。
[0003]文獻表明，在適宜的條件下，某些微生物生產并貯存的油脂占其生物總量的20%以上，這類微生物被稱為含油微生物，已知細菌、酵母、霉菌、藻類中都有生產油脂的微生物。微生物油脂又稱單細胞油脂，其脂肪酸組成與一般的植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等飽和與不飽和的脂肪酸為主。微生物發酵利用底物范圍較廣，可直接利用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和纖維素水解液等，不但可以提供新的油脂生產方法，而且可以利用廉價廢棄生物質，降低油脂生產成本，保護環境。因此，微生物油脂是潛在的動植物油脂替代資源，具有廣闊的應用前景。
[0004]微生物油脂的制備一般采用酵母菌為發酵菌種，經過常規的微生物培養進行生物量積累，得到含油微生物菌體，進而處理該菌體，得到微生物油脂。CN200610113582.X公開了一種利用微生物發酵油脂制備生物柴油的方法，即以酵母菌為微生物產油脂菌種，通過在產油脂菌種培養基中接入該酵母菌微生物，在一定的培養條件下進行微生物發酵制備油月旨，然后經離心、分離、提取得到微生物發酵油脂，以該微生物油脂為原料，在催化劑作用下進行轉酯化反應，得到生物柴油，副產物為甘油。該技術過程采用單一微生物發酵培養過程，其生物油脂積累在細胞內 ，細胞收獲量是制約油脂收獲量的關鍵因素。
[0005]除了含油酵母外，微藻是另外一類含油微生物，微藻富含不飽和脂肪酸、淀粉和蛋白質等營養成分(如螺旋藻等)，可用作能源、醫藥和食品等領域原料；通過條件調控，微藻細胞可以大量積累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其體內脂肪酸含量可占細胞干重的30%~60%。利用培養微藻來積累油脂資源，已經成為目前利用太陽能和固定二氧化碳開發可再生資源最熱門的研究領域，不僅具有巨大的市場潛力，而且具有突出的社會價值。
[0006]微藻細胞的生長方式一般為光自養和碳源異養兩種，光自養過程要消耗CO2, CO2的有效利用吸收，是實現理想培養效果的關鍵，同時存在補充CO2與光合作用產生O2的解吸、排出的問題。CN200410020978.0和CN03128138.9均采用在光生物反應器系統中加入一種裝置方法，來實現CO2的補給，同時也能實現一定的氧的解析效果。碳源異養過程是利用有機碳源為底物替代自養過程中的CO2來進行微藻生物質的積累，細胞生長速度較快，但細胞內油脂積累水平卻比較低下。
[0007]現有技術雖然對含油酵母和自養微藻生產微生物油脂都有所涉及，但都是含油微生物各自進行單獨培養，對于不同類型的含油微生物之間的混合協同培養方式來實現高效油脂收獲等方面的研究較少。在培養過程中普遍存在著成本高、微生物細胞累積慢、油脂含量低等不足。CN200910237936.5公開了一種混合培養酵母和藻類生產油脂的方法，該方法利用工業廢水為培養基，混合培養酵母和藻類，生產微生物油脂。但是，由于酵母和藻類的混合培養均是異養培養，細胞內油脂積累水平較低；并且兩種細胞一起收獲和提取油脂，由于油脂提取的方法不同，破壁要求不同，混在一塊效果不佳。

【發明內容】

[0008]針對現有技術的不足，本發明提供一種快速培養含油微生物的方法。該法將自養微藻與含油酵母在封閉式光生物反應器中進行半混合快速培養，具有提高自養微藻和含油酵母細胞收獲量，提高無機碳源(CO2)的利用率，提高含油微生物油脂含量，簡化培養裝置等優點。
[0009]本發明快速培養含油微生物的方法，包括如下內容:
(1)培養含油酵母種子液；
(2)培養自養微藻種子液；
(3)將含油酵母種子液和自養微藻種子液接入具有內置膜分離裝置的封閉式光生物反應器內進行半混合培養，含油酵母在膜分離裝置內部培養，自養微藻在膜分離裝置以外的光生物反應器內進行光合作用生長，兩個反應器內培養基組成和培養條件一致，培養過程中補充含油酵母生長代謝所需的有機碳源；所述的光生物反應器還包括導流筒，膜分離裝置內置于導流筒內，出口與光生物反應器出口平齊；所述的光生物反應器具有反光膜，反光膜貼在導流筒外表 面。
[0010]本發明中，膜分離裝置可以采用各種具有膜分離功能的膜裝置，優選采用陶瓷膜分離裝置，膜孔直徑為0.05 μ m~0.5 μ m，將含油酵母細胞與自養微藻細胞分隔開來。
[0011]本發明中，反光膜可以采用各種具有反光性能的反光膜，優選采用3M反光膜，部分或全部覆蓋導流筒的外表面。3M反光膜是一種玻璃珠封入式反光膜，背面涂有壓敏膠和易剝離背紙，即使在完全濕潤狀態下或者在大角度下，也可以保持它良好的反光性能。外置光源的光線射入光生物反應器到達導流筒處經反光膜實現反光，光線返回到光源處，從而實現雙光程環境。
[0012]本發明中，含油酵母包括釀酒酵母(5: cererisiae)、粘紅酵母(TP.glutinis、、故狀絲孢酵母(rricAospoma cu taneum)等,有機碳源為葡萄糖、果糖、淀粉、纖維素水解液等。含油酵母種子液培養是本領域技術人員熟知的方法，如采用攪拌式生物反應器，加入培養基和含油酵母，在適宜的條件下進行培養。
[0013]本發明中，自養微藻包括小球藻、葡萄藻、小環藻、娃藻等，自養微藻種子液培養是本領域技術人員熟知的方法，如采用常規的氣升式光生物反應器進行種子液培養。
[0014]本發明中，半混合培養過程中，含油酵母種子液與自養微藻種子液的初始接入體積比為1:1~1:10。半混合培養的初始培養基采用含油酵母所需的培養基，同時添加自養微藻生長所需的無機鹽和微量元素(如按SE培養基的組成添加相關物質)等。半混合培養過程中，以批次或連續等方式補充含油酵母生長過程所需有機碳源。
[0015]本發明中，半混合培養條件一般采用與含油酵母生長過程的條件相似的條件，如溫度一般為20°C~37°C，pH值一般為6~9，優選為6.5~7.5等。
[0016]本發明方法將含油酵母和自養微藻進行半混合培養，含油酵母與自養微藻生長條件和所需碳源的不同，互相補充和促進。自養微藻利用含油酵母發酵后廢棄碳源(0)2)為自身生長碳源，同時維持系統較平穩的滲透壓條件(pH值)，通過補充有機碳源保證含油酵母不斷生長。含油酵母與自養微藻通過膜分離裝置實現各自單獨的生長空間，培養基組成則是實現共混與互通，微藻對發酵過程使用的碳源具有耐受性，不影響微藻的生長和油脂的積累，并對含油酵母的發酵過程不存在影響，可以同時獲得所需的含油酵母細胞，從而實現含油酵母與自養微藻的半混合培養過程。同時，光生物反應器具有反光膜，即在光生物反應器導流筒外表面貼有反光膜，使外置光源實現返程，增加光合作用強度，培養體系處在雙光程環境下使自養微藻快速生長。
[0017]本發明方法選擇適宜種類的含油酵母和適宜種類的自養微藻，通過控制含油酵母和自養微藻的培養過程，使兩者形成穩定的半混合培養體系，并建立起不同細胞間共同利用環境營養條件而細胞間不互相干擾的生長關系，提高了油脂的累積效果，并提高了單一含油微生物培養過程中單位發酵體系內的油脂收獲量。同時，自養微藻細胞處在雙光程環境下，實現了自養微藻的快速生長過程，從而為微生物油脂的制備奠定了基礎。并且，由于油脂提取的方法不同，破壁要求不同，兩種細胞分別收獲和提取油脂，效果更佳。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發明一種具體工藝流程示意圖。
[0019]其中:1_含油酵母種子，2-自養微藻種子，3-含油酵母種子液培養反應器，4-自養微藻種子液培養反應器，5-含油酵母種子液接種管線，6-自養微藻種子液接種管線，7-膜分離裝置，8-封閉式光生物反應器，9-混合培養基及酸堿中和劑進入管線，10-導流筒，11-反光膜，12-進氣口，13-尾氣出口。
【具體實施方式】
[0020]本發明快速培養含油微生物的方法，具體包括如下內容:半混合培養之前，兩種含油微生物分別單獨進行種子液培養，采用攪拌式生物反應器進行含油酵母種子液培養，采用光生物反應器進行自養微藻種子液培養，攪拌式生物反應器內包括含油酵母和含油酵母發酵培養基，光生物反應器內包括自養微藻和自養SE培養基。種子液培養合格后，分別經過各自的接種管線轉移到培養兼性厭氧細菌的內置的膜分離裝置中和培養自養微藻的具有反光膜的封閉式光生物反應器中，并加入經過無菌處理的混合培養基營養成分和酸堿中和劑調節至半混合培養所需生長條件。其中混合培養基中的有機碳源用于含油酵母生長，而含油酵母生長所產生的CO2用于自養微藻生長。含油酵母種子液與自養微藻種子液接種體積比例為1:1~1:10。接種后半混合培養體系通過正常pH控制、溫度控制和通氣量等控制培養過程。其中半混合培養時有機碳源優選采用流加方式進行，其被含油酵母利用生長，含油酵母生長后產生較多的CO2，排出細胞外進入培養系統中。由于含油酵母排出的CO2處于溶解狀態，因此可以立即通過膜孔隙傳遞到光生物反應器內被混合培養基系統中的自養微藻利用，作為微藻生長的碳源供應。
[0021]下面通過附圖進一步說明本發明的詳細工藝過程。如圖1所示，含油酵母種子I經含油酵母種子液培養反應器3培養生長達生物量OD值為5.0~15.0 ；自養微藻種子2經自養微藻種子液培養反應器4培養生長達生物量OD值為2.0~10.0。將培養好的含油酵母種子液由接種管線5、自養微藻種子液由接種管線6分別轉接到內置的膜分離裝置7和封閉式光生物反應器8中進行半混合培養，并將混合培養基及酸堿中和劑9加入膜分離裝置和光生物反應器中進行混合，同時經過檢測分析混合后培養系統中PH值來調節混合培養液的pH至6.5~7.5。反光膜11貼在光生物反應器內導流筒10的外表面,實現外置光源的雙光程效應。氣體由進氣口 12進入反應體系內，利用三通分別通入膜分離裝置7和導流筒10內側，從而實現向膜分離裝置內含油酵母和光生物反應器內的供氣需要，通入的氣體統一由尾氣出口 12排出整個反應體系。
[0022]本發明中，含油酵母在有機碳源條件下實現快速生長，含油酵母消耗有機碳源，生成細胞生物質和各種代謝產物，細胞生物質由于體形較大而被膜截留在膜分離裝置內部，同時發酵產生CO2氣體排出細胞外后經過膜孔隙傳遞到整個混合培養基系統中，使培養體系內無機碳源含量增加，自養微藻利用這些無機碳源及反光膜形成的雙光程環境下進行光合作用，獲得自身的快速生長。同時，含油酵母發酵使系統的PH值下降，而隨著自養微藻的生長，利用溶解的CO2,使系統的pH值上升，兩者互為作用，調節系統的pH處于適宜范圍。 [0023]本發明中，光生物反應器可以是板式、管式、氣升攪拌式等封閉式反應器，可以通入的氮氣或含二氧化碳氣體和導流筒作用形成返混狀態，在導流筒外表面貼3M反光膜實現雙光程環境。光生物反應器的其它操作條件按常規的酵母和微藻培養條件控制。可以設置培養體系二氧化碳和溶解氧量的測定裝置，根據需要調整通氣量，以獲得良好的效果。同時提供PH電極檢測，以便通過外源加入酸、堿來實現系統pH的控制。
[0024]本發明中，pH控制酸中和劑為此1為504、順03等常用的無機酸，堿中和劑為NaOH、NaHC03、KOH、Ca (OH) 2、氨水等常用的無機堿。
[0025]本發明中，半混合培養過程溫度控制為內部盤管加熱方式。
[0026]本發明中，半混合培養中，向膜分離裝置和光生物反應器內可以通入氮氣或含二氧化碳的氣體。通氣管線進入光生物反應器后以三通形式存在，其中一條支路通入膜分離裝置中，出口引出整個反應器；其余兩條支路分別通入兩側的導流筒內側區域，實現通氣導流作用，使膜分離裝置之外的光生物反應器內反應液可以進行混合均勻。通入氣體量隨培養液體積變化而變化，通入氣體體積速率與培養系統裝液體積比例為0.1vvm~1.0vvm(單位液體體積每分鐘通入的單位氣體量)。
[0027]本發明中，光生物反應器內培養基為含油酵母和自養微藻所需的混合培養基，可以提供含油酵母生長所需營養物質，也提供自養微藻光合生長所需營養成份，兩種細胞通過膜分離裝置被分隔開來，實現各自單獨的生長空間，減弱不同細胞間生態影響，同時也為各自細胞的收獲提供了方便。含油酵母利用其適宜的培養基，其中碳源為有機碳源，進行生長，獲得生物量的增長，部分有機碳源通過發酵過程呼吸生成CO2，含油酵母所生成的CO2在培養體系中作為自養微藻進行光合作用的碳源，從而獲得微藻細胞的生長。
[0028]本發明中，含油酵母所需的有機碳源可以葡萄糖、果糖、淀粉、纖維素水解液等，該有機碳源的加入采用流加補充方式進行，根據培養液樣品成份分析，隨時檢測系統的有機碳源濃度水平，將配制好的有機碳源母液按消耗速度進行流加。
[0029]本發明中，半混合培養過程培養基的初始有機碳源濃度(以有機物質量濃度計，下同)為1.0%~5.0%，培養過程中通過含油酵母生長消耗，有機碳源經過補加泵進行不斷補加，維持有機碳源濃度在1.0%~2.0%。
[0030]本發明中，含油酵母種子液的培養基采用其適用的含油酵母培養基，自養微藻種子液的培養基采用微藻SE培養基。半混合培養過程采用含油酵母培養基和微藻SE培養基相結合，包括有機碳源、無機鹽和微量元素等成份，成為混合培養基。優選的培養條件為:種子液接種量(占光生物反應器的體積):5%~20%，溫度:25°C~30°C，通氣量:0.1vvm~
1.0vvm,攬拌轉速:IOOrpm ~400rpm,時間:24h ~120h。
[0031]方案I (比較例)
將粘紅酵母(中國微生物菌種保藏中心提供)在300mL搖瓶中進行培養，所用培養基為粘紅酵母PDA培養基，培養20h后得到所需種子液，OD值為12.0左右。將培養的含油酵母種子液接入含混合培養基的20L封閉式光生物反應器中內置的IOL陶瓷膜分離裝置內，膜孔直徑為0.1 μ m。光生物反應器為氣升攪拌式，可以實現培養液的返混；反應器為玻璃體，反應器內有溫度控制盤管，以及pH、O2和CO2傳感器。
[0032]PDA培養基配方(以每升計):葡萄糖20.0g，馬鈴薯液lOOOmL，pH自然。其中馬鈴薯營養液的制作:將200g馬鈴薯切成小塊后煮沸20~40分鐘，多層紗布過濾，定容至1000mLo
[0033]SE培養基配方(以每升計):
【權利要求】
1.一種快速培養含油微生物的方法，包括如下內容: (1)培養含油酵母種子液； (2)培養自養微藻種子液； (3)將含油酵母種子液和自養微藻種子液接入具有內置膜分離裝置的封閉式光生物反應器內進行半混合培養，含油酵母在膜分離裝置內部培養，自養微藻在膜分離裝置以外的光生物反應器內進行光合作用生長，兩個反應器內培養基組成和培養條件一致，培養過程中補充含油酵母生長代謝所需的有機碳源；所述光生物反應器還包括導流筒，膜分離裝置內置于導流筒內，出口與光生物反應器出口平齊；所述光生物反應器具有反光膜，反光膜貼在導流筒外表面。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:膜分離裝置采用陶瓷膜分離裝置，膜孔直徑為 0.05 μ m ~0.5 μ m。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:反光膜采用3M反光膜，部分或全部覆蓋導流筒的外表面。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:含油酵母包括釀酒酵母(5:cerevisiae),粘紅酵母iR.glutinis )或皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum ),有機碳源為葡萄糖、果糖、淀粉或纖維素水解液。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:自養微藻包括小球藻、葡萄藻、小環藻或娃藻。
6.按照權利要求1、4或5所述的方法，其特征在于:半混合培養過程中，含油酵母種子液與自養微藻種子液的初始接入體積比為1:1~1:10。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培養的初始培養基采用含油酵母所需的培養基，同時添加自養微藻生長所需的無機鹽和微量元素。
8.按照權利要求1、4或7所述的方法，其特征在于:半混合培養過程中，以批次或連續等方式補充含油酵母生長過程所需有機碳源。
9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培養條件為:溫度為20°C~37°C，pH值為6~9。
10.按照權利要求8所述的方法，其特征在于:培養基的初始有機碳源濃度(以有機物質量濃度計，下同)為1.0%~5.0%，培養過程中維持有機碳源濃度在1.0%~2.0%。
【文檔編號】C12R1/89GK103773688SQ201210404115
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月23日 優先權日:2012年10月23日
【發明者】王領民, 金平, 廖莎, 吳丹, 李曉姝, 師文靜, 張霖, 高大成, 喬凱, 程國香 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院