專利名稱：一種產牛磺酸菌株的篩選方法及用該菌株發酵法生產牛磺酸的制作方法
技術領域：
—種產牛磺酸的枯草芽孢桿菌的篩選方法及應用該菌株生產牛磺酸,屬于生物工程領域，特別是一株產牛磺酸的枯草芽孢桿菌。
背景技術：
牛磺酸(Taurine)是動物體內的一種含硫氨基酸，又稱牛膽堿、牛膽素，其化學結構式為H2N-CH2-CH2-SO3H,化學名稱為2-氨基乙磺酸。它廣泛分布于生物體內各組織、器官，主要以游離狀態存在于組織間液和細胞內液中，因最先從牛膽汁中分離出來而得名。1954年Stern和Moore首次在腦和脊髓中發現了牛磺酸。但長期以來一直被認為是含硫氨基酸的無功能代謝產物[1]。1976年Hayes等首次報道用以酪蛋白為主要蛋白來源但缺乏牛磺 酸的飼料喂貓，可引起貓的視網膜變性，若長時間缺乏，可使貓失明，從而引起了人們對牛磺酸營養作用的極大關注。研究發現，牛磺酸是調節機體正常生理活動的活性物質，具有維持正常視覺功能、維持機體滲透壓平衡，調節細胞鈣平衡，與細胞膜的流動性有關，降血糖、調節神經傳導、參與內分泌活動、調節脂類消化與吸收、增加心臟收縮能力、提高機體免疫能力、增強細胞膜抗氧化能力、保護心肌細胞等廣泛生物學作用。牛磺酸在臨床上已被廣泛應用于心血管疾病、高膽固醇血癥、眼部疾病、糖尿病、早老性癡呆和肝病等一系列疾病的治療。在食品領域，牛磺酸的已經成為多種食品營養強化劑和添加劑的主要活性成分，作為食品添加劑，其可被添加到乳制品、飲料、豆制品等食品中。目前，世界上牛磺酸的年消耗量已超過I. 5萬噸/年，其中80%以上用作食品營養添加劑。我國生產的牛磺酸主要用于出口、醫藥以及食品，其中出口量約占90%，作為食品添加劑僅占6%，而美國僅在飲料食品中作營養強化劑一項消費就近每年I萬噸。隨著國內人民生活水平和健康意識的提高，牛磺酸作為營養保健品和強化食品添加劑將越來越受到人們的重視，市場需求趨旺，具有巨大的發展潛力和空間。由于牛磺酸在天然生物中較分散、量少，從天然生物品中提取的量也很有限。所以目前牛磺酸的獲取主要還是靠化工合成。如利用2-溴乙胺氫溴酸鹽與Na2SO3，反應制備牛磺酸，雖然產率較高，但成本很高，難以實現工業化，而使用低成本的合成方法如2-氯乙胺鹽酸鹽與Na2SO3反應，則收率較低。目前，牛磺酸的生產廠家主要集中在日本、美國、歐洲等發達國家和地區，我國牛磺酸生產工藝陳舊、成本高、產量低，與歐美等發達國家還有很大差距。早在1988年日本就有專利報道，可用發酵法制取牛磺酸，并同時報道了許多種類的微生物都能生產牛磺酸或其類似物。然而近幾十年來，鮮有關于采用微生物發酵法生產牛磺酸的研究報道，僅在2009年Choi Y. J.等報道了采用代謝工程的方法在大腸桿菌中生
產牛磺酸。對采用微生物發酵法生產牛磺酸的研究尚處于初步階段，仍沒用一種可以利用微生物發酵直接生產牛磺酸的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種牛磺酸生產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產牛磺酸。本發明的技術方案I、一種產牛磺酸枯草芽孢桿菌的篩選方法I)枯草芽孢桿菌的初步分離純化稱取約O. 2g 土壤于20ml O. 85%無菌生理鹽水中，將菌懸液在沸水中振蕩加熱IOmin后，迅速冷卻至室溫。此菌懸液作為母液梯度稀釋至10_8，取10_6_10_8稀釋菌液涂布于營養肉湯平板上，30°C倒置培養24h，挑取不同菌落形態的單菌落進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察芽孢，將有芽孢菌株作為進一步篩選的枯草芽孢桿菌疑似菌株，編號保存； 2)產牛磺酸枯草芽孢桿菌的篩選將上述分離純化得到的菌種接種于種子培養基中，然后轉接到發酵培養基中，培養24h后離心收集發酵液，發酵液經高效液相方法中的內標法進行分析，使得牛磺酸標準品峰聞增聞的菌株即為廣牛橫酸的枯草芽抱桿菌。2、根據權利要求I所述一種產牛磺酸枯草芽孢桿菌的篩選方法，其篩選得到產牛磺酸的枯草芽孢桿菌的鑒定方法如下I)形態學鑒定菌落形態、細胞形態、革蘭氏染色、芽孢染色；2)生理生化鑒定接觸酶試驗，V. P.及M. R.試驗，明膠液化及淀粉水解，耐鹽耐酸試驗，硝酸鹽還原試驗；3) 16sRNA分子生物學鑒定用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組RNA，采用枯草芽孢桿菌16sRNA通用引物進行PCR擴增，擴增產物用膠回收試劑盒回收純化，連接至克隆載體PMD18T Vector,轉化大腸桿菌JM109菌株，利用克隆載體的青霉素抗性篩選獲得陽性轉化子，并用通用引物對轉化子進行質粒PCR鑒定。陽性克隆測序所得16sRNA序列與GenBank數據庫中枯草芽孢桿菌的核苷酸序列進行同源性分析，其與枯草芽孢桿菌的同源性高達99%，結合形態學、生理生化等實驗結果將該陽性克隆鑒定為枯草芽孢桿菌，并命名為B. subtilis FMME059。3、本發明公開的一種牛磺酸的生產方法，其特征是采用B. subtilis FMME059為出發菌株，以種子培養和液體發酵生產牛磺酸；I)種子培養種子培養基以g/L計葡萄糖40，胰蛋白胨20，KH2PO4L 5，K2HPO4,0. 5，MgSO4 · 7Η200· 5，生物素50，酵母膏5，尿素3，鹽酸硫胺素10，初始PH 7. 2-7. 4 ；培養條件溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，培養18_20h ；2)液體發酵培養發酵培養基以g/L計葡萄糖20，酵母粉15，尿素15，KH2PO4L 5，K2HPO4L 5，MgSO4 · 7Η200· 4，MnCl2 · 4H20 MgSO4 · 7Η200· 2，硫酸銨 20，初始 PH 7. 2-7. 4 ；
發酵條件接種量10%，溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，發酵72h。4、牛磺酸產量的測定根據牛磺酸和2，4- 二硝基氟苯(DNFB)進行衍生后在紫外360nm處有吸收峰，采用高效液相測定發酵液中的牛磺酸含量。發酵液的預處理取發酵液8000rpm離心IOmin,收集上清液,并加入15%的三氯乙酸沉淀發酵液中的蛋白(體積比I : 4)，靜置lh，8000rpm離心lOmin，取上清液。標準曲線的制作以商品牛磺酸(Sigma公司)作為標準品，配制1000、800、600、400、200mg/L的標準溶液。柱前衍生精密量取上述不同濃度的標準品和處理過的發酵液各lmL，分別置于 IOmL棕色量瓶中，依次加入O. 5mol/L的碳酸氫鈉溶液ImL (取碳酸氫鈉12g，用水溶解并稀釋至250mL,用O. lmol/L氫氧化鈉調節pH 9. O)，I %的2，4 二硝基氟苯乙腈溶液O. 5mL,搖勻，置60°C水浴中避光加熱Ih后取出，放冷至室溫，加磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0，取磷酸二氫鉀O. 68g，加O. lmol/L氫氧化鈉溶液29. lmL，用水稀釋至IOOmL,搖勻，即得)稀釋至刻度，搖勻。用0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定牛磺酸的含量。經過柱前衍生處理，標準品都稀釋到原來的10倍，所以標準曲線的最終梯度為100、80、60、40、20mg/L。發酵液經過除蛋白和柱前衍生處理，相當于稀釋了 50倍。色譜條件色譜柱反相C18 柱 250mm X 4. 6mm,直徑 5 μ m流動相磷酸鹽緩沖液(pH8)乙腈(色譜純)水=70 20 10柱溫35°C；檢測波長360nm；進樣量20μ L流速lmL/min。標準曲線在20_100mg/L之間呈現良好的線性關系(圖1)，回歸方程y =2. 875x-2. 976，R2 = 0. 9990。據此得到72h稀釋后牛磺酸產量的值，此值乘以稀釋倍數得最終產量為lg/L，如圖2。
圖I牛磺酸標準曲線圖2色譜檢測結果，A 60mg/L牛磺酸，B 72h發酵液
具體實施例方式以下是枯草芽孢桿菌(B. subtilis FMME059)篩選、鑒定及發酵生產牛磺酸的實施例。實施例I稱取約0. 2g 土壤于20mL 0. 85%無菌生理鹽水中，將菌懸液在沸水中振蕩加熱IOmin后，迅速冷卻至室溫。此菌懸液作為母液梯度稀釋至10_8，取10_6_10_8稀釋菌液涂布于營養肉湯平板上，30°C倒置培養24h，挑取不同菌落形態的單菌落進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察芽孢，挑選芽孢桿菌進一步發酵復篩。發酵培養基30°C培養72h后離心收集發酵液，發酵液經高效液相色譜法分析，以牛磺酸作內標，使牛磺酸標準品峰高增高的菌株即為產牛磺酸菌株。實施例2對篩選的FMME 59菌株按《微生物分類學》進行生理生化特性鑒定(見表I、2)，并按細菌基因組提取試劑盒提取方法提取基因組DNA，以Pl和P2為正向和反向引物Pl 5/ -CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3'，P2 5/ -CGACTTCACCCCAATCATCTG-3'。用PCR擴增16S rDNA基因，委托華大基因研究中心進行16S rDNA測序，得到本菌株部分16S rDNA序列(GenBank登錄號JX501915)后，在NCBI網站上用BLAST檢素工具進行同源性比對分析。基于16S rDNA序列分析和生理生化特性鑒定，結合對該菌的生長和 發酵特性研究，認為是枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus, subtilis FMME059。表I菌株(BN)與枯草芽孢桿菌菌落形態特征對比
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—一―59......................................................—— 一實施例3菌株保藏于終濃度為15%的甘油管中，取200 μ L保藏菌液接入50mL種子培養基中進行種子培養，30°C，200rpm培養20h后，以10%的接種量接入50mL發酵培養基進行發酵培養。種子培養基以g/L計葡萄糖40L，胰蛋白胨20，KH2PO4L 5，K2HPO4,05,MgSO4 ·7Η200. 5，生物素50，酵母膏5，尿素3，鹽酸硫胺素10，初始pH 7. 2-7. 4 ;發酵培養基以 g/L 計葡萄糖 20，酵母粉 15，尿素 15,KH2PO4L 5,K2HPO4L 5,MgSO4 ·7Η200· 4,MnCl2 ·4Η20MgS047H200. 2，硫酸銨 20，初始 pH 7. 2-7. 4。在 30°C,200rpm 條件下發酵 72h，用 HPLC 測定發酵液中的牛磺酸的含量產量為lg/L。
權利要求
1.一種產牛磺酸枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征為 1)枯草芽孢桿菌的初步分離純化 稱取約O. 2g 土壤于20ml O. 85%無菌生理鹽水中，將菌懸液在沸水中振蕩加熱IOmin后，迅速冷卻至室溫，稀釋菌懸液涂布于營養肉湯平板上，30°C倒置培養24h，挑取不同菌落形態的單菌落進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察芽孢，將有芽孢菌株作為進一步篩選的枯草芽孢桿菌疑似菌株，編號保存； 2)產牛磺酸枯草芽孢桿菌的篩選 將上述分離純化得到的菌種接種于種子培養基中，然后轉接到發酵培養基中，培養72h后離心收集發酵液，發酵液經過預處理后采用內標法經高效液相色譜進行定性分析，使得牛磺酸標準品峰高增高的菌株即為產牛磺酸的枯草芽孢桿菌。
2.根據權利要求I所述一種產牛磺酸枯草芽孢桿菌的篩選方法，其篩選得到產牛磺酸的枯草芽孢桿菌經形態學、生理生化及16sRNA分子生物學鑒定為枯草芽孢桿菌，并命名為Bacillus, subtilis FMME059。
3.一種牛磺酸的生產方法，其特征是采用B. subtilis FMME059為出發菌株，以種子培養和液體發酵生產牛磺酸； 1)種子培養基以g/L 計葡萄糖 40，胰蛋白胨 20，KH2P041. 5,K2HPO4,0. 5,MgS047H200. 5，生物素50，酵母膏5，尿素3，鹽酸硫胺素10，初始pH 7. 2-7. 4 ； 培養條件溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，培養18_20h ； 2)液體發酵培養 發酵培養基以g/L計葡萄糖20，酵母粉15，尿素15，KH2PO4L 5，K2HPO4L 5，MgSO4 · 7Η200· 4，MnCl24H20 MgSO4 · 7Η200· 2，硫酸銨 20，初始 PH 7. 2-7. 4 ； 發酵條件接種量10%，溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，發酵72h。
全文摘要
本發明闡述了一種產牛磺酸菌株的篩選方法及用該菌株發酵法生產牛磺酸，屬于生物工程技術領域。本發明菌株首先將土壤經過沸水浴后稀釋涂布，染色鏡檢獲得有芽孢菌株，然后對篩選出的菌株采用一級發酵逐一搖瓶培養，發酵液中加入牛磺酸標準品作為內標，采用高效液相色譜法進行定性分析篩選，并對篩選菌株進行形態學、生理生化及分子生物學鑒定，最終獲得一株高產牛磺酸的枯草芽孢桿菌。本發明同時公開一種采用該菌株生產牛磺酸的方法，采用本方法發酵72h牛磺酸產量為1g/L。
文檔編號C12R1/125GK102965317SQ20121048749
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者吳靜, 羅秋玲, 朱曉彤 申請人:江南大學