專利名稱：一種賴氨酸高產菌株的篩選方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種賴氨酸高產菌株的篩選方法及其在發酵產賴氨酸中的應用。
背景技術：
現有技術中，一般通過賴氨酸搖瓶發酵篩選賴氨酸高產菌株，具體操作步驟包括分別將賴氨酸發酵菌株接種至液體培養基中進行搖瓶發酵，發酵結束后測定發酵液中的賴氨酸含量并計算轉化率從而篩選出高產量菌株。 而在搖瓶發酵的過程中，隨著營養物質的消耗，發酵液的pH值會不斷下降，所以需要人工定時取樣檢測PH值并添加氨水或液氨來控制pH值在適當范圍內以保證菌種的正常生長代謝。因此，搖瓶發酵篩選菌株的操作過程繁瑣，即每次添加氨水或液氨時至少需要進行2次pH值的測定，而且在添加氨水或液氨時容易使發酵液染雜菌，存在導致篩選失敗的風險。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種操作簡單且結果可靠的賴氨酸高產菌株篩選方法及其應用。為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種賴氨酸高產菌株的篩選方法，該方法包括配制固體培養基，將多株賴氨酸發酵菌株接種至固體培養基中進行培養，然后篩選出高產菌株，其特征在于，所述固體培養基為添加了指示劑的固體培養基且所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8 ;并通過觀察固體培養基中指示圈的大小篩選出所述高產菌株。另一方面，本發明提供了上述方法在發酵產賴氨酸中的應用。通過上述技術方案，在賴氨酸發酵菌株的培養過程中，隨著營養物質的消耗，會逐漸在固體培養基上形成指示圈，操作人員根據該指示圈的大小便可直觀地篩選出高產量的賴氨酸高產菌株。本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
具體實施例方式以下對本發明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。本發明中，在未作相反說明的情況下，術語“指示劑的變色pH范圍”指的是指示劑的變色pH點所在的范圍。本發明提供的賴氨酸高產菌株的篩選方法包括配制固體培養基，將多株賴氨酸發酵菌株接種至固體培養基中進行培養，然后篩選出高產菌株，其特征在于，所述固體培養基為添加了指示劑的固體培養基且所述指示劑的變色PH范圍為5. 5-8，優選為6-7. 4 ;并通過觀察固體培養基中指示圈的大小篩選出所述高產菌株。其中，所述多株賴氨酸發酵菌株優選至少為8株賴氨酸發酵菌株。所述賴氨酸發酵菌株可以是商購獲得的產賴氨酸菌株，也可以是人工篩選獲得的產賴氨酸菌株。本領域技術人員所公知的是指示劑一般以溶液的形式使用，可以直接商購獲得，也可以購買粉末狀產品再配制成溶液使用，且配制時使用的溶劑為常規試劑，配制方法為常規方法，例如，溴百里酚藍一般以O. 1-0. 3重量％濃度的溶液形式使用，配制方法包括先將O. 1-0. 3克溴百里酚藍溶于60ml濃度為100%的乙醇中，再加水至100ml。根據本發明，相對于每千克的固體培養基，所述指示劑的添加量優選為
O.002-0. 012克。當指示劑的添加量在上述優選范圍內時，顯色明顯且不會對賴氨酸發酵產生影響。需要說明的是，本發明中，指示劑的添加量以指示劑的干重計，即當所述指示劑以溶液形式使用時，指示劑的添加量不包括其中溶劑的量。 根據本發明，只要所述指示劑的變色pH范圍在上述范圍內即可實現本發明的目的，優選地，所述指示劑為溴百里酚藍、溴酚藍、中性紅、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。根據本發明，如前所述，在賴氨酸發酵菌株的培養過程中，隨著營養物質的消耗，會逐漸在固體培養基上形成指示圈，指示圈越大，說明賴氨酸發酵菌株產生的賴氨酸的量越多，因此可以直接選用形成的指示圈直徑最大和/或形成的指示圈的直徑為直徑最大的指示圈的直徑的98%以上的菌株作為高產菌株。本領域技術人員能夠理解的是，指示圈的顏色與使用的指示劑的類型有關，故在此不再詳述。根據本發明，所述固體培養基可以為本領域常規使用的能夠培養賴氨酸發酵菌株并添加了指示劑的培養基，優選情況下，所述固體培養基為添加了指示劑的賴氨酸發酵固體培養基、胰蛋白大豆瓊脂固體培養基或LB固體培養基。使用上述優選的培養基能夠獲得更易于觀測的指示圈。進一步優選情況下，所述固體培養基為添加了溴酚藍的賴氨酸發酵固體培養基；或者所述固體培養基為添加了溴百里酚藍的胰蛋白大豆瓊脂固體培養基。本發明的發明人發現，使用這兩種固體培養基最終獲得的指示圈更大且邊緣更明顯，故更適于觀測。本發明中，所述賴氨酸發酵固體培養基可以通過往常規的賴氨酸發酵液體培養基中添加瓊脂而獲得，所述賴氨酸發酵液體培養基為本領域常規使用的發酵制賴氨酸的培養基。所述LB固體培養基可以通過往常規的LB液體培養基中添加瓊脂而獲得。通過添加瓊脂來配制固體培養基是本領域技術人員所公知的，因此瓊脂的添加量可以為本領域常規使用的量，例如，相對于每千克的固體培養基，所述瓊脂的添加量為15-30g,優選為15-25g。對于賴氨酸發酵固體培養基，一般地，相對于每千克的賴氨酸發酵固體培養基，葡萄糖的用量為30-50g，優選為35-45g ;糖蜜的用量為0_40g，優選為15_25g ;玉米漿(干重為20-50重量％)用量為10-40g，優選為15-25g ;磷酸氫二鉀的用量為O. 5-1. 5g，優選為O. 75-1. 25g ;硫酸鎂的用量為O. 4-2g，優選為O. 8-1. 5g ;硫酸銨的用量為5_20g，優選為10-15g ；蘇氨酸的用量為O. 05-0. 6g，優選為O. 1-0. 3g ；蛋氨酸的用量為O. 05-0. 6g，優選為O. 1-0. 4g ;谷氨酸的用量為O. 2-0. 6g，優選為O. 3-0. 5g ;甜菜堿的用量為l_5g，優選為2-4g ；pH 值為 6. 8-7. 4，優選為 7-7. 2。對于胰蛋白大豆瓊脂固體培養基，可以通過商購獲得，一般地，相對于每千克的胰蛋白大豆瓊脂固體培養基，胰蛋白大豆瓊脂的用量為30-50g，優選為35-45g，pH值為6. 8-7. 4，優選為 7-7. 2。
對于LB固體培養基，可以自行配制，也可以通過商購獲得，一般地，相對于每千克的LB固體培養基，蛋白胨的用量為5-15g，優選為8-12g ;酵母膏的用量為2_8g，優選為4-6g ;氯化鈉的用量為2-8g，優選為4-6g ;pH值為6. 8-7. 4，優選為7-7. 2。根據本發明，所述賴氨酸發酵菌株可以為本領域常規使用的賴氨酸發酵菌株，例如可以為選自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(EscherichiaColi)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的一株。根據本發明，對所述培養的條件沒有特殊限定，優選情況下，所述培養的條件包括溫度為30-38°C，時間為50-80h。本發明還提供了上述方法在發酵產賴氨酸中的應用。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這 些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中，黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購自江南大學)；將培養的黃色短桿菌菌種用無菌水稀釋101°倍，制得菌懸液；pH值的檢測使用梅特勒DeLTA320pH計；發酵液中賴氨酸的含量參照標準GB10794-89。以下實施例中，所用固體培養基的具體成分及其含量如下表I所示表I
權利要求
1.一種賴氨酸高產菌株的篩選方法，該方法包括配制固體培養基，將多株賴氨酸發酵菌株接種至固體培養基中進行培養，然后篩選出高產菌株，其特征在于，所述固體培養基為添加了指示劑的固體培養基且所述指示劑的變色PH范圍為5. 5-8 ;并通過觀察固體培養基中指示圈的大小篩選出所述高產菌株。
2.根據權利要求I所述的方法，其中，所述指示劑的變色PH范圍為6-7.4。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中，相對于每千克的固體培養基，所述指示劑的添加量為0. 002-0. 012克。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述指示劑為溴百里酚藍、溴酚藍，中性紅、酚紅、苯酚紅和石蕊中的ー種。
5.根據權利要求I或4所述的方法，其中，所述固體培養基為添加了溴酚藍的賴氨酸發酵固體培養基。
6.根據權利要求I或4所述的方法，其中，所述固體培養基為添加了溴百里酚藍的胰蛋白大豆瓊脂固體培養基。
7.根據權利要求I所述的方法，其中，所述賴氨酸發酵菌株為選自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的一株。
8.根據權利要求I所述的方法，其中，所述培養的條件包括溫度為30-38°C，時間為50-80h。
9.權利要求1-8中任意一項所述的方法在發酵產賴氨酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種賴氨酸高產菌株的篩選方法及其應用，該方法包括配制固體培養基，將多株賴氨酸發酵菌株接種至固體培養基中進行培養，然后篩選出高產菌株，其特征在于，所述固體培養基為添加了指示劑的固體培養基且所述指示劑的變色pH范圍為5.5-8；并通過觀察固體培養基中指示圈的大小篩選出所述高產菌株。通過上述技術方案，在賴氨酸發酵菌株的培養過程中，隨著營養物質的消耗，會逐漸在固體培養基上形成指示圈，操作人員根據該指示圈的大小便可直觀地篩選出高產量的賴氨酸高產菌株，且本發明方法的篩選結果可靠。
文檔編號C12N1/02GK102766591SQ201210266750
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者盧宗梅, 吳曉艷, 夏令和, 滿云, 馬靜 申請人:中糧生物化學(安徽)股份有限公司