專利名稱：水稻osa-miR171a基因的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，具體地說，涉及水稻osa-miR171a基因的啟動子MIR171aP的應用，利用此啟動子可誘導基因組織特異性表達及改變所啟動基因在干旱脅迫下的表達量。
背景技術：
miR171在擬南芥等植物中的相關研究很早就有報道，但是在水稻中的研究相對較
少。2002年David P. Bartel等從擬南芥幼苗和花中分別克隆了大量的小RNAs,Northern分析發現ath-miR171在花中表達量較高；2002年James C. Carrington等的研究發現，miR171在擬南芥、水稻和煙草的花中積累量相對比較高，而在葉和莖桿中表達量較少或不能被檢測到；2005年Vincent L. Chiang等發現miR171在毛果楊莖桿中特異表達,可能參與了木質組織的形成，木質組織機械損傷脅迫導致ptr-miR171下降；miR171在小麥的各種組織中都有表達，特別是根中相對較高(孫其信，2007)；2009年薛紅衛等對水稻miRNA做了表達譜分析，得出osa-miR171g/h在水稻根中選擇性優先表達。可見miR171在不同植物的各個組織中表達量是有差異的。本發明啟動子MIR171aP克隆自水稻第6染色體。結合⑶S染色及qRT_PCR結果可知，其主要在根、節及花藥中表達，且對干旱脅迫有響應。
發明內容
本發明的目的在于提供OMnTtV/ia基因的啟動子MIR171aP，該啟動子主要在根、節及花藥中表達，并且響應逆境脅迫。本發明從水稻中分離克隆了 osa-miR171a的上游調控區，并命名為啟動子MIR171aP。從水稻中分離克隆了 osa_miR171a的上游調控區的啟動子MIR171aP通過Plant-CARE (http://bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/) 分析可知，該啟動子中存在多個抗逆相關的順式作用元件，如ABRE (cis-acting elementinvolved in the abscisic acid responsiveness), MBS (MYB binding site involvedin drought-1nducibility),TCA-element (cis-acting element involved in salicylicacid responsiveness),TGACG-motif(cis-acting regulatory element involved in theMeJA-responsiveness),這些保守序列的存在預示著該啟動子與植物的抗逆性存在密切關系。本發明采用的技術方案是，提供一種啟動子MIR171aP，所述啟動子MIR171aP序列表為下列之一
如 SEQ ID NO:1 所示；
或基本上相當于SEQ ID NO:1所示的90%同源的DNA序列；
或功能相當于SEQ ID NO:1所示序列的亞片段。
本發明還提供一種包含上述啟動子MIR171aP的重組載體，其中，構建所述重組載選用的載體為可以引導外源基因在植物中表達的載體，所述表達的載體為Ti質粒或植物病毒載體。
本發明還提供一種包含啟動子MIR171aP的轉化體，其中，所述轉化體的宿主為植物，所述植物為水稻。
本發明還提供一種包含上述啟動子MIR171aP在水稻旱脅迫中的應用。其采用的操作步驟是a)、將所述的啟動子驅動目的基因導入植物細胞、組織或器官；b)、再將轉化后的植物細胞、組織或器官培育成植株，得到響應干旱脅迫的轉基因植物，本發明還提供一種包含權利要求1所述啟動子MIR171aP在驅動水稻基因特異表達中的應用，其中，所采用的操作步是a)、將所述的啟動子驅動目的基因導入植物細胞、 組織或器官；b)、再將轉化后的植物細胞、組織或器官培育成植株，得到驅動目的基因在特定的組織部位表達的轉基因植株。
實現上述技術方案采用的方法是，采用已克隆的MIR171aP啟動子為探針，從基因組文庫中篩選得到本發明的啟動子片段或其同源序列。也可以采用PCR技術，從基因組中擴增得到本發明的MIR171aP啟動子片段以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段 DNA。采用以上技術，可以分離得到包含MIR171aP啟動子的序列，將這一序列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體連接后轉化植物，可獲得在根、節及花藥中特異表達且對逆境響應的轉基因植株。
本發明的技術效果是本發明的MIR171aP啟動子主要在根、節及花藥中表達，因此以本發明MIR171aP啟動子與任何感興趣的基因構建的植物表達載體，可使其下游基因主要在根、節及花藥中表達。
本發明的MIR171aP啟動子可響應干旱，調節下游基因表達。因此以本發明 MIR171aP啟動子與任何感興趣的基因構建的植物表達載體，可使其下游基因在干旱脅迫下的表達發生變化。
本發明采用的技術方案可以用于研究利用此基因遺傳轉化獲得轉基因植物的分子方法，及該啟動子序列差異對此基因表達的影響。
由于水稻基因及其啟動子對逆境產生明顯響應，可應用于在植物抗逆育種，提高植物的抗逆性。
圖1水稻苗期MIR171aP啟動子在干旱脅迫下對O1SanTtV77a基因啟動表達分析； 圖2為本發明水稻MIR171aP啟動子在各組織器官對O1SanTtV77a基因啟動表達分析； 圖3為本發明水稻MIR171aP啟動子驅動⑶S報告基因表達結果。
具體實施方式
下述實施例進一步描述本發明，但所述實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1
水稻苗期MIR171aP啟動子在干旱脅迫下對O1SanTtV77a基因啟動表達分析1.選取材料
本實驗以粳型旱稻品種IRAT109 (Oryza sativa L. ssp. Japonica,國外引進的旱稻品種，上海市農業生物基因中心種質資源庫收集保存)為基因表達量分析的實驗材料。挑選飽滿的IRAT109水稻種子，1%次氯酸鈉消毒后，4°C條件下清水浸泡24小時。然后轉入35-38°C環境里破胸20小時，待露白后置25-28°C環境下催芽至半粒谷長，胚根為谷粒長。選擇Wagner’ s規格(1/5000 a)大小的塑料小桶,采用穴播的方式,每個小桶種16株。正常條件下生長至五葉一心時進行旱處理，分別在旱處理前、旱處理后3d、5d、7d、9d、11d和復水后Ih、3h、6h、12h、24h、48h取樣。取樣時，只選擇倒數第二片葉片，用于總RNA的提取。 2. RNA提取與第一鏈cDNA合成
RNA的提取所取樣品在研缽中用液氮冷凍后研磨成粉狀，加入盛有ImlTRNzol-A+試劑(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振蕩后，室溫放置5min，之后加
0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s后，室溫放置3min ;后于4°C,12000rpm離心IOmin后，上清液移至新的2mL EP管中，加等體積異丙醇沉淀RNA，加100耵RNase-free ddH20溶解。電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。反轉錄之前需用DNaseI消化所提取樣品，反應體系如下
權利要求
1.水稻OMnTtV/ia基因的啟動子MIR171aP，其特征在于，所述啟動子具有下列核苷酸序列之一 SEQ ID NO:1中所示的DNA序列； 與SEQ ID NO:1至少90%同源的DNA序列； 功能相當于SEQ ID NO:1所示序列的亞片段。
2.一種包含權利要求1所述啟動子MIR171aP的重組載體。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于，構建所述重組載選用的載體為可以引導外源基因在植物中表達的載體。
4.根據權利要求3所述的重組載體，其特征在于構建重組載體所選用的載體為Ti質粒或植物病毒載體。
5.一種包含權利要求1所述啟動子MIR171aP的轉化體。
6.根據權利要求5所述的轉化體，其特征在于，所述轉化體的宿主為植物。
7.根據權利要求6所述的轉化體，其特征在于，所述植物為水稻。
8.一種包含權利要求1所述啟動子MIR171aP在水稻旱脅迫中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述應用的操作步驟 a)、將所述的啟動子驅動目的基因導入植物細胞、組織或器官，b)、再將轉化后的植物細胞、組織或器官培育成植株，得到響應干旱脅迫的轉基因植物。
10.一種包含權利要求1所述啟動子MIR171aP在驅動水稻基因特異表達中的應用。
11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于，所述應用的操作步驟 a)、將所述的啟動子驅動目的基因導入植物細胞、組織或器官，b)、再將轉化后的植物細胞、組織或器官培育成植株，得到驅動目的基因在特定的組織部位表達的轉基因植株。
全文摘要
本發明提供一種從水稻DNA片斷中分離克隆的啟動子MIR171aP，該啟動子驅動osa-miR171a基因表達。啟動子MIR171aP能響應干旱脅迫，與水稻抗旱性相關，該啟動子主要在水稻根、節及花藥中驅動基因表達，具有一定的組織特異性，本發明的水稻啟動子可驅動基因組織特異性表達及改變所啟動基因在干旱脅迫下的表達量。
文檔編號C12N15/63GK102994505SQ20121055707
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者孔德艷, 劉灶長, 周立國, 秦劍英, 馬瑞芳, 羅利軍 申請人:上海市農業生物基因中心