專利名稱：采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法
技術領域：
本發明屬于植物細菌學技術領域，特別是涉及一種采采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法。
背景技術：
我國是獼猴桃的主要產區，其種植面積和產量均居世界之首。陜西省的獼猴桃產量更是位居全國之首。獼猴桃潰瘍病在我國獼猴桃的各大產區都有不同程度的發生，嚴重威脅獼猴桃的生產，被列為全國森林植物檢疫對象。此病來勢兇猛，是一種毀滅性病害，發生時不僅減低產量，而且導致果皮變厚，果味變酸，果實變小，果形不一，品質下降，商品價值降低，造成嚴重的經濟損失。獼猴桃潰瘍病的危害嚴重及防治困難，一直是獼猴桃生產和理論上的一個重要問題。目前很難找到一種有效的防治藥物。目前普遍采用的檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法主要有血清學方法、電鏡技術和分子生物學檢測等。但上述方法均存在不同的缺點，例如，所需試驗周期較長、操作繁瑣、靈敏度不高、特異性不強、準確性較低、易受檢測材料限制等。環介導等溫核酸擴增(Loop-mediatedi sothermalmplification, LAMP)技術是由T. Notomi發明的一種新型核酸擴增技術，該技術依賴四條特異引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶,在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增祀序列(Notomietal,2000)。迄今已建立了針對多種病原性細菌、病毒、真菌、寄生蟲等的LAMP檢測方法，在耐藥性基因檢測、家畜早期胚胎性別判定等方面也有相關報道。該方法應用范圍廣泛，適于基層實驗室進行快速檢測。本發明根據獼猴桃潰瘍病菌16S基因設計了 LAMP引物，采用環介導等溫擴增技術(LAMP)建立了一種快速、靈敏、高度特異的檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法。為獼猴桃潰瘍病的快速檢測提供了新的手段。
發明內容
為解決上述技術問題，本發明提供了一種采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法，其中該方法包括獼猴桃潰瘍病菌DNA的提取，LAMP反應和實時濁度檢測，從分子水平對獼猴桃潰瘍病菌進行篩查和檢測，所述LAMP反應采用如下三對引物中的任意一對引物組外引物(F3和 B3):SEQID NO.1 :5’ -CCGATTTTGGGTCTGTAGCT-3’ ；SEQID NO. 2 :5’ -GTAAGTGGTGGAGCCAAGC-3’ ；內引物(FIP和 BIP):SEQID NO. 3 :5’ -CGCGCTCTGACCAACTTCACCACCCCTGATAAGGGTGAGG-3’ ；SEQID NO. 4 5’ -TACGACACCCGGATACGGGGATCGAACCGCTGACCTCC-3’ ；環引物(LF 和 LB)SEQID NO. 5 :5’ -GGCAGATTCGAACTGCCGA-3’ ；SEQID NO. 6 :5’ -CCATAGCTCAGCTGGGAGA-3’。
優選地，上述方法中，所述LAMP反應采用上述全部3對引物組，即六條引物，SEQIDNO. 1-6。在一個具體的實施方案中，本發明所述的采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法，其包括如下步驟I)潰瘍病菌總DNA的提取提取獼猴桃潰瘍病菌的總DNA ；2) LAMP 反應使用外引物SEQ ID NO. 1-2、內引物SEQ ID NO. 3-4和環引物SEQ IDN0. 5-6對潰瘍病菌總DNA進行LAMP反應，得到擴增產物；3)濁度檢測對擴增產物進行濁度觀察，確定獼猴桃是否感染所述潰瘍病菌。在一個具體的實施方案中，本發明所述的采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法，其包括如下步驟
I)潰瘍病菌的培養獼猴桃潰瘍病菌在液體LB培養基中，26°C條件下培養12小時，取O. 5微升該液體直接用于檢測；2) LAMP 反應使用外引物SEQ ID NO. 1-2、內引物SEQ ID NO. 3-4和環引物SEQ IDN0. 5-6對潰瘍病菌的DNA進行LAMP反應，得到擴增產物；3)濁度檢測對擴增產物進行濁度觀察，確定獼猴桃是否感染所述潰瘍病菌。在一個具體的實施方案中，在本發明上述的方法中，LAMP反應中使用的引物濃度比例為外引物SEQ ID NO. 1-2 內引物SEQ ID NO. 3-4 :環引物SEQ ID NO. 5-6 =1:8:4;在一個具體的實施方案中，在本發明上述的方法中，LAMP反應中的反應溫度優選為 64 0C ；在一個具體的實施方案中，在本發明上述的方法中，LAMP反應中的Mg2+濃度優選為 6mM。獼猴桃潰瘍病菌危害嚴重，本發明經過優化和摸索實驗條件建立了檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法，極大地提高檢測效率，降低檢測成本。本發明的方法具有快速、靈敏、高度特異性等特點。本發明的方法已經成功地應用于室內和田間獼猴桃潰瘍病菌病害的檢測。本發明證明了 LAMP是一種檢測植物潰瘍病菌的有效手段。
圖1 :LAMP結果濁度觀察，1:陽性，2 :陰性；圖2A =LAMP反應最佳溫度為64 °C ；圖2B =LAMP反應最佳Mg2+濃度為6mM ；圖2C =LAMP反應最佳DNTPS濃度為O. 8mM ；圖2D =LAMP反應最佳betaine濃度為OmM ；
具體實施例方式為了理解本發明，下面以實施例進一步說明本發明，但不限制本發明。為了理解本發明，下面以實施例進一步說明本發明，但下述實施例并不限制本發明。材料與試劑獼猴桃健康枝條，感染潰瘍病菌的枝條分別采自中國陜西楊凌、周至、眉縣、岐山等地，采集枝條保存于4°C冰箱中。主要試劑Bst DNApolymerase 購自 NEB 公司；Betaine, MgS04 購自 Sigma 公司；Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；大腸桿菌(Escherichia,coli) JM109, DNA 標準 Markerl 購自 Voson 公司；膠回收試劑盒購自Bioteke公司。實施例1 1.引物設計首先本發明人從NCBI上下載了獼猴桃潰瘍病菌的ITS基因序列，使用Primer4. O (http://primerexplorer. jp/e/v4_manual/index, html)設計了多組弓丨物，然后根據引物所在序列區域的保守性、引物的發夾結構、二聚體GC含量以及Tm值等綜合因素選擇了每種病毒的引物。最后為獼猴桃潰瘍病菌選擇了 6條引物，包括2條外引物(F3和B3)、2條內引物(FIP和BIP)和兩條環引物(LF和LB)。所述引物參見SEQ IDN0. 1-6。引物的信息見表I。表I引物序列SEQ IDN0. 1-6的信息
權利要求
1.一種采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法，其中該方法包括獼猴桃潰瘍病菌DNA的提取，LAMP反應和實時濁度檢測，從分子水平對獼猴桃潰瘍病菌進行篩查和檢測，所述LAMP反應采用如下三對引物中的任意一對引物組外引物(F3和B3)SEQ ID NO.1 :5’ -CCGATTTTGGGTCTGTAGCT-3’ ；SEQ ID NO. 2 :5，-GTAAGTGGTGGAGCCAAGC-3，；內引物(FIP和BIP)SEQ ID NO. 3 :5’ -CGCGCTCTGACCAACTTCACCACCCCTGATAAGGGTGAGG-3’ ；SEQ ID NO. 4:5’ -TACGACACCCGGATACGGGGATCGAACCGCTGACCTCC-3’ ；環引物(LF和LB)SEQ ID NO. 5 :5’ -GGCAGATTCGAACTGCCGA-3’ ；SEQ ID N0.6 :5’ -CCATAGCTCAGCTGGGAGA-3’。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述LAMP反應采用全部3對引物組，即六條引物 SEQ ID NO. 1-6。
3.根據權利要求1所述的方法，所述的采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法包括如下步驟1)潰瘍病菌總DNA的提取提取獼猴桃潰瘍病菌的總DNA ；2)LAMP 反應使用外引物SEQ ID NO. 1-2、內引物SEQ ID NO. 3_4和環引物SEQ IDN0. 5-6對潰瘍病菌總DNA進行LAMP反應，得到擴增產物；3)濁度檢測對擴增產物進行濁度觀察，確定獼猴桃是否感染所述潰瘍病菌。
4.根據權利要求1所述的方法，所述的采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法包括如下步驟1)潰瘍病菌的培養獼猴桃潰瘍病菌在液體LB培養基中，26°C條件下培養12小時，取O. 5微升該液體直接用于檢測；2)LAMP 反應使用外引物SEQ ID NO. 1-2、內引物SEQ ID NO. 3_4和環引物SEQ IDN0. 5-6對潰瘍病菌的DNA進行LAMP反應，得到擴增產物；3)濁度檢測對擴增產物進行濁度觀察，確定獼猴桃是否感染所述潰瘍病菌。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其中LAMP反應中使用的引物濃度比例為外引物 SEQ ID NO. 1-2 :內引物 SEQ ID NO. 3-4 :環引物 SEQ ID NO. 5-6 =1: 8 : 4。
6.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其中LAMP反應中的反應溫度為64°C。
7.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其中LAMP反應中的Mg2+濃度為6mM。
全文摘要
本發明涉及采用環介導等溫擴增技術檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法，其中該方法包括獼猴桃潰瘍病菌DNA的提取，LAMP反應和實時濁度檢測，LAMP反應采用六條引物SEQ ID N0.1-6，從分子水平對獼猴桃潰瘍病菌進行篩查和檢測，其中所述獼猴桃潰瘍病菌采自陜西省，本發明根據獼猴桃潰瘍病菌的ITS基因設計了LAMP引物，采用環介導等溫擴增技術建立了一種快速、靈敏、高度特異的檢測獼猴桃潰瘍病菌的方法。為獼猴桃潰瘍病菌的快速檢測提供了新的手段。
文檔編號C12Q1/68GK103045742SQ20121057989
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者趙磊, 郝興安, 樊紅科, 吳云鋒 申請人:西北農林科技大學