具有免疫增強作用的酵母及含有該酵母的食品或飼料的制作方法

專利名稱：具有免疫增強作用的酵母及含有該酵母的食品或飼料的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有良好的安全性且即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強作用的酵母及含有該酵母的食品或飼料。
背景技術：
免疫是指當從外界侵入的病毒或細菌，或者癌細胞等侵襲機體時，機體防御自己的機構。免疫中參與多種細胞，其中由于巨噬細胞(macrophage)普遍存在于所有動物中，并且參與免疫應答的所有階段，尤其包括初期階段的作用，因此已經認識到其重要性。已經了解到，如果免疫低下，則會引發癌、感染癥、過敏癥等各種疾病；反之，如果免疫被增強，則可以期待抑制癌癥發生、抗癌作用、抗感染癥、抗敏作用，特別是恢復身體狀態節律、維持機體穩態等多種效果。鑒于此，以改善消費者的健康狀態為目的，已在提供具有免疫增強作用的各種化合物及微生物。例如，可以列舉利用乳鐵蛋白的水解物的(例如，參照專利文獻I);利用甲殼素(例如，參照專利文獻2)、海藻糖(例如，參照專利文獻3)、巖藻聚糖硫酸酷(例如，參照專利文獻4)等糖類的；利用植物源物質的(例如，參照專利文獻5);利用肽(例如，參照專利文獻6)、白細胞介素(例如,參照專利文獻7)的；利用核酸的(例如，參照專利文獻8);利用谷胱甘肽(例如，參照專利文獻9)、氨基酸(例如，參照專利文獻10)、多聚賴氨酸(例如，參照專利文獻11)的；利用腸內細菌(例如，參照專利文獻12)、乳酸菌(例如，參照專利文獻13)、場球菌屬細菌(例如，參照專利文獻14)等微生物的化合物及微生物。另外，近年來，￠-葡聚糖(glucan)的免疫增強效果受到廣泛關注。例如，提出從酵母或蘑菇類提純￠-葡聚糖，并且利用該物質的免疫增強方法(例如，參照專利文獻15、16)。然而，為了利用所述具有免疫增強作用的化合物而增強消費者的免疫，必須大量提純而服用這種化合物，這需要多道制備エ序、大量勞動カ及費用。并且，所述具有免疫增強作用的微生物中，存在性狀未知的微生物，并且還有不適合用于食品的微生物。另外，如果所述具有免疫增強作用的微生物其本身不能直接利用于食品制造(發酵等)，則為了使食品具備免疫增強功能，需要向食品単獨添加該微生物。在此，已經公開有，由于酵母的染色體上的基因中，MCD4基因、GASl基因以及CWH41基因中的ー個或兩個以上的基因被破壞，而導致具有免疫增強作用的酵母(例如，參照專利文獻17)。根據所述專利文獻17所公開的酵母，如同所述專利文獻15、16中記載的技術那樣，無需從酵母特意地提純3 -葡聚糖，而即使直接服用該酵母，也能夠增強免疫。然而，對于專利文獻17中公開的酵母而言，所述特定的基因是根據基因重組技術而被破壞的。近年來，隨著基因重組技術的發展，安全性已被鑒定的基礎上，已有多種轉基因食品得到認可，甚至在銷售。但是，從消費者的角度來看，對于被基因重組的食物的安全性，仍然有較高的恐懼感。因此，現階段，以食用用途為目的利用所述專利文獻17的酵母，在應用上是具有難度的。而且，專利文獻17中公開的酵母，由于與細胞壁結構有關的基因缺損，因此如預期的那樣，已經證實，該酵母在低滲透壓的培養基中增殖極其緩慢。因此，在培養所述酵母時，為了避免向結構已變得脆弱的細胞壁施加負荷，需要在培養基中添加例如糖類等物質來提高培養基的滲透壓，使得培養基與酵母細胞膜內的溶液的滲透壓變為相同，這需要培養成本。并且，將所述酵母應用在例如面包等食品的發酵時，存在發酵條件受限制、以及為了使發酵液變為等壓而添加糖類時食品風味被改變等問題。另外，人工誘變方法是指根據例如誘變劑、紫外線照射、放射線照射等誘變因素，而相比于自然突變，以更高頻率引起DNA突變的方法。所述人工誘變方法不同于所述基因重組技木，其不會插入食物原本具有的堿基序列以外的堿基序列。因此，根據所述人工誘變方法而遺傳性狀被改變的食物，在目前來看，由于安全性比較高而被消費者所接受。因此，到目前為止的現狀是，還沒有提供具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強作用、便宜且易購得、食品制造中可以直接利用、且在低滲透壓下也能夠培養的酵母等微生物，并且迫切期望能夠早日提供。專利文獻1:專利公開公報平5-178759號專利文獻2 :專利公開公報平6-271470號專利文獻3 :專利公開公報2003-81839號專利文獻4 :專利公開公報2001-181303號專利文獻5 :專利公開公報平6-56685號

專利文獻6 :專利公 報第2873434號專利文獻7 :專利公報2002-3395號專利文獻8 :專利公報第2529605號專利文獻9 :專利公開公報平11-49696號專利文獻10 :專利公開公報2000-281571號專利文獻11 :專利公開公報2003-128589號專利文獻12 :專利公開公報平6-56678號專利文獻13 :專利公開公報平7-228536號專利文獻14 :專利公開公報平11-92389號專利文獻15 :專利公開公報2001-354570號專利文獻16 :專利公開公報2003-183176號專利文獻17 :專利公開公報2006-75039號

發明內容
本發明將解決上述現有技術中存在的諸多問題，并以達到以下目的作為課題。即，本發明的目的在于提供ー種具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強作用、便宜且容易購得、食品制造中可以直接利用、并且在低滲透壓下也能夠培養的酵母，以及含有該酵母的食品或飼料。
為了解決上述課題，本發明的發明者們努力探討的結果，得到了以下見解。S卩，對于目前廣泛地應用在食品制造中的酵母，根據利用甲基磺酸こ酯的人工誘變方法來使酵母染色體上發生突變時，能夠獲得細胞壁的甘露聚糖少的酵母；該酵母由于細胞壁的甘露聚糖少的原因，￠-葡聚糖暴露在菌體表面，因此即使不專門從酵母提純￠-葡聚糖，而直接用在免疫增強作用試驗，也表現出顯著的免疫增強作用；該酵母雖然細胞壁的甘露聚糖少，但是具有預料不到的效果，即對低滲透壓表現出較高的耐性，適用于酵母制備(培養)以及含有該酵母的食品和飼料的制造。本發明是基于發明人們的以上見解而完成的，作為解決上述課題的技術手段如下。<1>酵母的特征在干，細胞壁甘露聚糖少，具有免疫增強作用，能夠在滲透壓為300m Osm的YPD液體培養基中増殖。<2>所述〈1>中記載的酵母的特征在于，免疫增強作用是巨噬細胞活化作用。<3>所述〈1>至〈2>任意ー項中記載的酵母的特征在于，根據人工誘變方法獲得免疫增強作用。<4>所述〈1>至〈3>任意ー項中記載的酵母的其特征在干，未被基因重組。<5>所述〈3>至〈4>任意ー項中記載的酵母的特征在于，在人工誘變方法中使用的未株為 Saccharomyces cerevisiae。<6>所述〈3>至〈5>任意ー項中記載的酵母的特征在于，人工誘變方法是利用誘變齊U、紫外線照射以及放射線照射中的任意ー種的方法。<7>所述〈1>至〈6 >任意一項中記載的酵母的特征在于，該酵母是Saccharomycescerevisiae FERM BP-11293 以及 Saccharomyces cerevisiaeFERM BP-11294 中的任意一種。<8>含有所述〈1>至〈7>任意ー項中記載的酵母的食品或者飼料。根據本發明，能夠解決現有技術中存在的諸多問題，且可以提供具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強作用、便宜且容易購得、食品制造中可以直接利用、并且在低滲透壓下也能夠培養的酵母，以及含有該酵母的食品或飼料。


圖1為突變體f 4的顯微鏡圖像；圖2為示出關于突變體廣4的巨噬細胞活化作用試驗的結果的圖；圖3A為示出關于突變體3以及親株的增殖試驗的結果的圖；圖3B為示出關于突變體3以及親株的增殖試驗的結果的圖；圖4為示出關于記載在專利公開公報2006-75039中的變異體(MCD4 A株)的增殖試驗的結果的圖；圖5為示出根據實施例6、7制造的含有突變體3的食品的巨噬細胞活化試驗的結果的圖。
具體實施例方式(酵母)
本發明的酵母的特征在于，細胞壁的甘露聚糖少，并且具有免疫增強作用，而且能夠在滲透壓為300m Osm (0SM0L，滲量)的YPD液體培養基中増殖。<免疫增強作用>所述免疫增強作用是，增強自然免疫的作用。所述自然免疫是指，機體所具備的免疫中，機體先天具備而起到即使事先未暴露在抗原中也能夠將所述抗原從機體排除的作用的機構。作為所述抗原，只要不影響本發明的效果，就沒有特別的限制。例如可以列舉，病毒、細菌等外來抗原以及癌細胞等內在抗原。作為所述免疫增強作用，只要能夠增強所述自然免疫，就沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如可以列舉，吞噬細胞(巨噬細胞、單球、中性粒細胞、樹突狀細胞)、抗原呈遞細胞(巨噬細胞、樹突狀細胞)、自然殺傷(NK)細胞、多形核白細胞(嗜酸球、嗜堿球、月巴大細胞)等活化作用。其中，基于普遍存在于各種生物中且排除抗原的效果較高的原因，優選為所述巨噬細胞的活化作用。作為評價所述酵母具有所述免疫增強作用的方法，沒有特別限制，可以根據與自然免疫有關的所述細胞的種類，從現有的公知的評價方法中適當選擇。例如，對所述巨噬細·胞的活化作用的評價，可以根據如下方法來進行。即，通過將巨噬細胞在培養基或者緩沖液中接觸所述酵母而刺激所述巨噬細胞，并測定在刺激前后所述巨噬細胞產生的細胞因子(例如，TNF-a等)的量。所述酵母具有免疫增強作用的原因被認為是，由于細胞壁的甘露聚糖少，從而導致具有免疫增強作用的3-葡聚糖暴露在菌體表面。<甘露聚糖>通常，甘露聚糖是構成酵母的細胞壁的主要成分之一，是以D-甘露糖為主鏈的糖鏈。甘露聚糖與蛋白質結合而以甘露聚糖蛋白質形態存在。在酵母的細胞壁中，沿著細胞膜的外周面形成有￠-葡聚糖層，所述甘露聚糖蛋白質通過稱為糖基化磷脂酰肌醇(GPI，glycosylphosphatidylinositol)錨的糖脂類與該P -葡聚糖結合。其結果，甘露聚糖覆蓋而隱藏￠-葡聚糖，并存在于細胞壁的最外層(即，菌體表面)。對此，本發明的所述酵母中，由于細胞壁的甘露聚糖少，因此P -葡聚糖代替甘露聚糖暴露在菌體表面。所述酵母，其細胞壁上甘露聚糖少的原因尚未證實，但是被認為是例如，甘露聚糖、甘露聚糖蛋白質及GPI錨中的至少ー種未被合成；雖然已被合成但沒有運輸到細胞膜外；相結合的部位發生缺損或突變等原因造成的。確認所述酵母中細胞壁甘露聚糖少時，例如可以利用，甘露聚糖特異性抗體、與甘露聚糖中的D-甘露糖、甲基-a -D-吡喃甘露糖苷等特異性結合的ConA (刀豆蛋白A)凝集素等物質來確認。具體來講，將所述抗體或者所述ConA利用異硫氰酸熒光素(FITC，Fluorescein isothiocianate)等突光色素標記后,根據所述突光來檢測結合于菌體表面的所述抗體或者所述ConA。此時,如果沒有檢測出根據所述抗體或者所述ConA結合到菌體表面而產生的熒光，則可以判定為細胞壁甘露聚糖少。對于所述熒光的檢測，可以通過熒光顯微鏡下觀察的方法來進行，也可以利用例如流式細胞儀、熒光分析儀等裝置來以定量分析的方法來進行。并且，確認所述酵母中細胞壁甘露聚糖少時，例如可以根據對細胞壁甘露聚糖的含量進行定量分析的方法來確認。作為對甘露聚糖含量的定量分析方法，沒有特別限制，例如可以根據以下的順序進行。S卩，首先，利用玻璃珠來破碎細胞，通過離心調整細胞壁物質并冷凍干燥。其次，根據Dallies們的方法(Yeast，1998，14，P1297_1306)進行硫酸水解，將中和后的上清液凍結干燥，并利用 REZEXTM RPM-Mono sac char i de Phenomenex (ShimadzuGLC LTD)等色譜柱以高效液相色譜法(HPLC)進行分析，根據得到的葡萄糖與甘露糖的比值，能夠得到細胞壁中的甘露聚糖的含量。作為細胞壁中甘露聚糖的含量，只要以￠-葡聚糖暴露于菌體表面的程度少時，沒有特別限制，但是更加優選為，細胞壁中不含有甘露聚糖。所述￠-葡聚糖是構成酵母的細胞壁的主要成分之一，是由葡萄糖通過￠1-3結合的糖鏈。作為所述P -葡聚糖的平均分子量及修飾實施形態，只要具有免疫增強作用，就沒有特別限制，可以根據酵母的種類和培養條件而變更。作為確認所述酵母中￠-葡聚糖暴露在菌體表面的方法，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以利用￠-葡聚糖特異性抗體、苯胺藍等熒光試劑來確認。另外，可以利用電子顯微鏡觀察菌體表面的3-葡聚糖纖維來確認。<對滲透壓的耐性>通常，包括酵母的一部分微生物、植物具有細胞壁，這種細胞壁具有對滲透壓的耐性、維持細胞形態等極其重要的功能。鑒于此，本發明的所述酵母，由于如上所述其細胞壁中的甘露聚糖少，因而可能會喪失對滲透壓的耐性。但是，在后述的實施例中可以證實，根據本發明的發明人們制備的酵母，具有預料不到的 效果，即具有對滲透壓的耐性。作為表示本發明的所述酵母對滲透壓具有耐性的指標，只要不影響本發明的效果，就沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。但是優選的指標為，能夠在滲透壓為300m0sm(OSMOL,滲量)的YPD液體培養基中増殖。在此，所述YPD液體培養基是使用由I質量％的酵母膏、2質量％的蛋白胨，2質量％的葡萄糖組成的培養基。并且，用在所述YPD液體培養基中的酵母膏是使用東方酵母エ業(株式)會社制備的酵母膏，蛋白胨是使用日本制藥(株式)會社制備的蛋白胨，葡萄糖是使用國產化學(株式)會社制備的葡萄糖。所述滲透壓例如可以根據山梨醇等非發酵性糖類、NaCl等物質來調節。所述滲透壓例如可以利用滲透壓計F-2000 (roebling公司造)來測定。本發明中“能夠増殖”是指，將屬于高滲透壓培養基的YPDS液體培養基中預培養的一部分培養液添加到所述YPD液體培養基，使OD66tl達0. 1，然后在適宜條件下震蕩培養吋，24小時培養后的OD66tl達到1. 0以上。在此，所述YPDS液體培養基是使用由I質量％的酵母膏、2質量％的蛋白胨，2質量％的葡萄糖、5. 5質量％ (0. 3mol/L)的山梨醇組成的培養基。并且，用在所述YPDS液體培養基中的酵母膏是使用東方酵母エ業(株式)會社制備的酵母膏，蛋白胨是使用日本制藥(株式)會社制備的蛋白胨，葡萄糖是使用國產化學(株式)會社制備的葡萄糖，山梨醇是使用和光純藥エ業(株式)會社制備的山梨醇。另外，增殖試驗中所使用的酵母為尿嘧啶營養缺陷型吋，在使用的YPD液體培養基和YPDS液體培養基中，均添加相當于葡萄糖含量的0. 3質量％以上的尿嘧啶而進行増殖試驗。即，對于YPD液體培養基或者YPDS液體培養基，葡萄糖含量為2質量％時，對于YPD液體培養基或者YPDS液體培養基，尿嘧啶含量為6X 10_3質量％以上。并且，増殖試驗中所使用的酵母為其他營養缺陷型吋，也同樣在所使用的YPD液體培養基和YPDS液體培養基中，均添加足夠的所需物質后，進行増殖試驗。所述OD66tl例如可以利用分光光度計來測定。由于所述酵母能夠在滲透壓為300m 0sm(0SM0L，滲量)的YPD液體培養基中増殖，因此例如不需要為了提高培養基的滲透壓而添加糖等物質，從而可以降低培養成本。并且，將所述酵母添加到食品吋，即使在培養后以低滲透壓溶液洗浄，菌體也不會被破壞，因此可以提1 活菌回收率，而且可以提1 食品制造效率。< 酵母 >對于所述酵母的種類，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以列舉面包酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、清酒酵母以及味增醬油酵母等。其中，優選為面包酵母。作為所述酵母，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以列舉酵母(Saccharomyces)屬、接合酵母(Zygosaccharomyces)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、擬威爾酵母(Williopsis)屬、有孢圓酵母(Torulaspora)屬、假絲酵母(Candida)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、畢赤酵母(Pichia)屬等。作為所述酵母的種，可以列舉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、措抗酵母(Candida saitoana)、熱帶假絲酵母(Candida tropical is)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)、德爾布有抱圓酵母(Torulaspora deIbrueckii)、皺糟假絲酵母(Candida sake)、熱帶假絲酵母(Candidatropical is)、產 朊假絲酵母(Candida 11丨;[118)、異常畢赤酵母(？;[(31113311011^13)、土星擬威爾酵母(Williopsis saturnus)、扣囊復膜抱酵母(Saccharomycopsis fibIigera)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、畢赤酵母(Pichia farinosa)等。其中，優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus),而且尤其優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。作為所述釀酒酵母，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。但是優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11291、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293 以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERMBP-11294。基于免疫增強作用高的理由，尤其優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293 以及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERMBP-11294。所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11291、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11293以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11294是由發明人們制備的菌株，并且保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物保藏中心。另外，所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11291、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11293以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11294的染色體上的突變位點，尚未被明確證實。但是已經明確，在所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERMBP-11294中，15號染色體的約IOOOObp的BamHI酶切片段上發生了突變。所述BamHI酶切片段中包含完整的RPS12、MRS6、GPB1、RAD17、NDD1基因，以及部分SCPl基因。因此暗示著，所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP_11294所具有的免疫增強作用，并不是由記載在專利公開公報2006-75039中的MCD4基因、GASl基因以及CWH41基因的突變引起的。另外，對于所述酵母的染色體組的數目，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇，例如，可以列舉一倍體等。-培養方法-作為所述酵母的培養方法，沒有特別限制，可以根據目的從現有的公知的方法中適當選擇。例如，可以列舉分批培養、流加培養等方法。可以優選地利用發酵罐(jar fermenter)來進行所述培養，對于此時的發酵罐中的條件，沒有特別限制，可以適當選擇。例如，培養溫度約為28 33°C，培養時間約為f 120小時，PH值約為4 7，通氣量約為(T5vvm，而攪拌速度約為10(T700rpm。—用途一作為所述酵母的用途，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。但是優選為作為添加到食品中而被使用的食品原材料、飼料、魚飼料等用途，尤其優選為作為所述食品原材料的用途。另外，所述酵母可適用于例如面包、啤酒發酵等食品的制造中。通過利用本發明的酵母，可以得到具有免疫增強功能的食品、具有免疫增強功能的飼料、具有免疫增強功能的魚飼料。此時，所述酵母可以以菌體未被破壞的狀態直接使用，也可以以菌體被破壞的狀態使用，另外還可以以干燥狀態使用，并且還可以以活菌狀態甚至未干燥的狀態使用。作為所述破碎方法，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以選擇磨碎機(DYN0-MILL)等物理破碎 處理，也可以選擇化學破碎處理。作為所述酵母的適用對象，只要具有自然免疫，就沒有特別限制。例如，可以列舉人；除了人以外的動物(馬、牛、豬、綿羊、山羊、駱駝、原駝等家畜，小白鼠、大鼠、豚鼠、兔子等實驗動物，雞、鴨、火雞、鴕鳥等家禽，真鯛、條石鯛、牙鲆、比目魚、五條螄、黃獅魚、琥珀魚、金槍魚、長縞鰺、香魚、鮭鱒魚類、紅鰭東方飩、鰻魚、泥鰍、鯰魚等魚類，日本囊對蝦、斑節對蝦、中國對蝦、三疣梭子蟹等甲殼類，鮑魚、海螺、扇貝、牡蠣等貝類，寵物狗、寵物貓等寵物)等。<酵母的制備方法>所述酵母可以通過以下方法制備。即，可以以食品用途使用的酵母作為親株，對該親株以人工誘變的方法在染色體上引起突變。另外，也可以利用，可以以食品用途使用的酵母作為親株，在該親株中根據自然突變在染色體上發生突變的菌體。作為所述可以以食品用途使用的親株，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以利用所述〈酵母 > 部分中列舉的酵母。所述人工誘變方法是指根據例如誘變劑、紫外線照射、放射線照射等誘變因素，而相比于自然突變，以更高頻率引起DNA突變的方法。通過利用所述人工誘變方法，在不插入親株原本具有的堿基序列以外的堿基序列的前提下，能夠在染色體上發生突變。對于所述誘變劑，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以列挙，甲基磺酸こ酯(Ethylmethane Sulfonate)、亞硝基胍、5_溴尿卩密唳等。
所述放射線例如，可以列舉X線、a線、P線、Y線、粒子束等。作為進行人エ誘變處理后，篩選具有免疫增強作用的酵母的方法，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以將對選擇培養基的耐性、細胞表層的甘露聚糖的含量、巨噬細胞活化作用作為指標，進行篩選。作為根據所述人工誘變方法或者所述自然突變而發生突變的基因，只要親株能夠獲得免疫增強作用，就沒有特別限制。例如，可以列舉RPS12、MRS6、GPB1、RAD17、NDD1、SCP1、MCD4、GAS1、CffH41等基因。另外，除了這些基因以外的染色體上的堿基序列發生突變也是可以的。另外，作為所述突變種類，只要親株能夠獲得免疫增強作用，就沒有特別限制，例如，可以列舉堿基取代、添加、缺失、逆位等。(食品或飼料)

本發明的食品或飼料的特征在于，含有所述酵母。對于所述食品，沒有特別限制，可以根據目的適當選擇。例如，可以列舉面包、餅干、烤餅(scone)等糕點，醫院膳食，流質食物，水產及肉類加工品，面條類，調料，啤酒及果汁等飲料，健康食品，健康飲料等。對于所述飼料，沒有特別限制，可以根據適用對象適當選擇。作為所述適用對象，沒有特別限制，例如可以列舉，在所述酵母的用途部分中列舉的適用對象。本發明的食品或飼料由于含有具有較高的免疫增強作用的所述酵母，因此具有較高的免疫增強功能。實施例以下，對本發明的實施例進行說明，但是本發明不限于這些實施例。(實施例1)-具有免疫增強作用的酵母的制備-——人工誘變處理——作為用于人工誘變處理的親株，使用實用面包酵母的一倍體的T-21 (東方酵母エ業株式會社制備)的尿嘧啶營養缺陷型突變株T-21U株。另外，所述T-21U株是通過以下方法得到的。即，通過將T-21株在YPD液體培養基中培養之后，涂于含有5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid)的培養基(0. 7質量％的酵母氮源(YEAST NITROGEN BASE (DIFC0公司))、2質量％的葡萄糖、0.1質量％的5-氟乳清酸、
0.05質量％的尿嘧啶、2質量％的瓊脂)，在30°C下培養3天，使菌體生長，由此作為自然突變的突變體被篩選出的菌株。使用含有尿嘧啶的YPD液體培養基(I質量％的酵母膏(東方酵母エ業(株式)會社制備)，2質量％的蛋白胨(日本制藥(株式)會社制備)，2質量％的葡萄糖(國產化學(株式)會社制備)，6X 10_3的尿嘧啶(和光純藥エ業(株式)會社制備)，以下相同)，將親株過夜培養。將培養的菌體分裝在2支艾本德(印pendorf)離心管中，離心分離，并集菌。棄上清液，用無菌水洗滌2次，再將菌體懸浮于0.1M (mol/L,以下相同)磷酸緩沖液(pH7. 0)中。混合30iU甲基磺酸こ酯(EMS)，在30°C下震蕩培養(incubate) I小吋。通過離心回收菌體，棄上清，再將菌體懸浮于200 Ul的5質量％硫代硫酸鈉中。將懸浮液移到新的離心管中，離心回收,用200 ill的5質量％硫代硫酸鈉洗凈兩次。再將菌體懸浮于ImL無菌水中，適度稀釋后，涂布在YPD瓊脂培養基上。——篩選——通過以下的一次至三次篩選，從經過所述人工誘導處理的酵母群中，篩選出具有免疫增強作用的酵母。作為一次篩選，進行細胞壁突變株的選擇。在含有尿嘧啶的YPD瓊脂培養基(I質量％的酵母膏、2質量％的蛋白胨、2質量％的葡萄糖、6X 10_3的尿嘧啶、2質量％的瓊脂)、含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養基(0. 2質量％的酵母膏、0. 4質量％的蛋白胨、0. 4質量％的葡萄糖、1. 2X10—3的尿嘧啶、2質量％的瓊脂)、含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的瓊脂培養基上涂布菌體。在30°C下培養3天后，選擇(I)含有尿嘧啶的YPD瓊脂培養基與含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養基比較時，在含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養基上增殖較為緩慢，且(2)含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養基與含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的瓊脂培養基比較時，在含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的瓊脂培養基上增殖較為緩慢的菌株(或者死亡的菌株)。一次篩選的結果，得到了 3120株突變體。作為二次篩選，根據用FITC標記ConA，而進行甘露聚糖的染色。利用牙簽刮取菌落,并懸浮于加入1. OM山梨醇的PBS溶液中。離心回收,再懸浮于加入1. OM山梨醇的PBS溶液之后，混合到用FITC標記的ConA溶液(Sigma公司)中，在室溫下遮光放置30分鐘。洗凈I次，利用熒光顯微鏡在藍色激發光下觀察菌體。由此，選擇當整體觀察時幾乎看不到熒光的菌株，或者從照片上不能確認熒光的菌株。所述二次篩選的結果，從3120株選擇了 4株(突變體廣4)。圖1為突變體廣4的顯微鏡圖像，上面的是光學顯微鏡圖像，下面的是在甘露聚糖染色后觀察的熒光顯微鏡圖像。圖1中，突變體廣4幾乎觀察不到熒光，尤其突變體2 4完全觀察不到熒光。另タ卜，突變體I 為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11291,突變體2為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11292,突變體3為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293,突變體 4 為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11294。這些4株突變體均保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生物保減中心。作為三次篩選，檢測突變體廣4的巨噬細胞的活化作用。將突變體廣4離心集菌，用こ醇處理后，用無菌水洗凈2次。進ー步用RPM1-1640培養基洗浄一次后，再懸浮于RPM1-1640培養基中，用血細胞計數板對酵母進行計數。將酵母濃度調整到規定量，并作為樣品。巨噬細胞使用自培養第2天的細胞。經過培養的巨噬細胞從培養燒瓶中回收，用新的培養基洗滌2次，再用血細胞計數板對細胞進行計數。將巨噬細胞的細胞濃度調整到規定量，并作為待檢測活性的巨噬細胞培養液。將所述巨噬細胞培養液分裝在24孔板中，并混合所述樣品，使酵母與巨噬細胞的細胞數的比值成為30:1。將混合液在37 °C，5%CO2下培養6小時之后，用滴管取培養液，并離心。回收上清液，利用小鼠腫瘤壞死因子免疫檢測試劑盒(Quantikine MouseTNF-a Immunoassay (R&D systems公司))檢測上清液中含有的TNF-a蛋白質量。作為對巨曬細胞的活化作用的陽性對照，使用內毒素(Lipopolysaccharide(LPS, Wako公司))。圖2為示出關于突變體f 4的巨噬細胞活化作用試驗的結果的圖。在圖2中表現出突變體3、4相比于親株具有非常強的巨噬細胞活化作用(免疫增強作用)。經過三次篩選的結果，從突變體廣4的4株中選擇了 2株(突變體3、4)。(實施例2)一低滲透壓培養基中的増殖試驗ー將實施例1中的突變體3作為樣品使用，并且根據以下試驗方法進行在低滲透壓培養基中的増殖作用的試驗。首先，將突變體3在含有尿嘧啶的YPDS液體培養基(I質量％的酵母膏(東方酵母エ業(株式)會社制備)、2質量％的蛋白胨(日本制藥(株式)會社制備)、2質量％的葡萄糖(國產化學(株式)會社制備)、5.5質量％ (0.3M)的山梨醇(和光純藥エ業(株式)會社制備)，以下相同)中進行預培養。將經過預培養后的一部分培養液接種到含有尿嘧啶的YPD液體培養基以及含有尿嘧啶的YPDS液體培養基中，使OD66tl達0. 1，然后在30°C下振蕩培養。并且，利用分光光度計來檢測培養中的培養基的0D_，由此評價菌體數量隨時間的變化(増殖)。并且，作為對照，使用親株和專利公開公報2006-75039號中記載的根據基因重組技術制備的變異體(MCD4A )，并根據與突變體3相同的方法培養，評價菌體數量隨時間的變化(増殖)。

圖3A及圖3B為示出關于突變體3和親株的增殖試驗的結果的圖，圖4為示出記載在專利公開公報2006-75039中的變異體(MCD4A株)的增殖試驗的結果的圖。從3A及圖3B的結果可以看出，本發明的酵母(突變體3)在低滲透壓的含有尿嘧啶的YPD液體培養基以及在調整過滲透壓的含有尿嘧啶的YPDS液體培養基中均能夠與親株近乎相同地増殖。另外，從圖4的結果可以看出，專利公開公報2006-75039號中記載的根據基因重組技術制備的變異體(MCD4 A )，雖然在調整過滲透壓的含有尿嘧啶的YPDS液體培養基中較為快速増殖，但是在低滲透壓的含有尿嘧啶的YPD液體培養基中增殖極其緩慢。(實施例3)-壓榨鮮酵母的制備-使用實施例1中得到的突變體3而制備壓榨鮮酵母。將在含有尿嘧啶的YMPD液體培養基(0. 3質量％的酵母膏、0. 3質量％的麥芽膏、
0.5質量％的蛋白胨、3質量％的葡萄糖、9X 10_3質量％的尿嘧啶)中培養的突變體3為種子酵母，進行流加培養。連續流加糖溶液(相當于添加糖濃度260g/L、尿素19. 49g/L、KH2PO4 52g/L的溶液)而進行培養。流加方法按照常規的方法進行。培養結束后，分離、水洗、過濾培養發酵液(broth)而得到壓榨鮮酵母。(實施例4)一發酵カ試驗ー將實施例3的壓榨鮮酵母作為樣品使用，并根據以下的試驗方法對壓榨鮮酵母的發酵カ的進行試驗。根據酵母エ業會制定的酵母發酵カ測定方法，檢測120分鐘的氣體發生量。結果表不在表Io[表I]1: 親株 I突變體權利要求
1.ー種酵母，其特征在于，能夠在滲透壓為300m Osm的YPD液體培養基中增殖； 所述增殖是指，將YPDS培養基中預培養的一部分培養液向所述YH)液體培養基中添カロ，以使OD66tl達到0. 1，在30°C條件下培養時，培養24小時后的OD66tl達到1. 0以上， 細胞壁甘露聚糖少， 具有巨噬細胞活化作用， 該酵母是 Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11294。
2.如權利要求1所述的酵母，其特征在于，未被基因重組。
3.含有如權利要求1至2中任意一項所述的酵母的食品或者飼料。
全文摘要
本發明涉及一種具有免疫增強作用的酵母及含有該酵母的食品或飼料。目的在于提供具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強作用、便宜且容易購得、食品制造中可以直接利用、并且在低滲透壓下也能夠培養的酵母，以及含有該酵母的食品。酵母的特征在于，細胞壁甘露聚糖少，具有免疫增強作用，能夠在滲透壓為300m Osm的YPD液體培養基中增殖。所述酵母優選為Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11293以及Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11294中的任意一種。
文檔編號C12R1/865GK103060214SQ20121057994
公開日2013年4月24日 申請日期2008年12月10日 優先權日2007年12月10日
發明者東雅之, 立花太郎, 古川周平, 中島亮一, 渡邊肇, 小林紗由美 申請人:東方酵母工業株式會社, 東雅之