專利名稱：一種利于杜鵑花屬植物生長發育和菌根形成的菌液制備方法
技術領域：
本發明涉及一種植物生長發育菌液，即一種利于杜鵑花屬植物生長發育和菌根形成的菌液制備方法。
背景技術：
在現有技術中，杜鵑是世界著名觀賞植物，也是我國十大傳統名花之一。我國杜鵑花資源十分豐富，是杜鵑花的重要資源和地理分布中心。但國內外對野生杜鵑花的引種、人工繁育、栽培和育種等研究開展緩慢，究其原因，大多因杜鵑花人工繁殖、栽培和生長發育等環節存在較大難點，特別是野生高山杜鵑尤為明顯。長白山杜鵑花屬植物包括牛皮杜鵑 {Rhododendron chrysanthum PalI·)、短果杜匿$ {Rhododendron brachycarpum D. Don)、 照白杜匿$ {Rhododendron micranthum Turcz.)、小葉杜匿$ {Rhododendron parvifolium Adams.)、大字杜醇{Rhododendron schlippenbachii Maxim.)、興安杜醇{Rhododendron dauricum L.)、迎紅杜匿$ {Rhododendron mucronulaturn Turcz.)、毛|￡杜匿$ {Rhododendron confertissimum Nakai)和 口十杜匿$ {Rhododendron redowskianum Maxim.)等共有 9 個種，均為吉林省重點保護植物。
杜鵑花類菌根是真菌和杜鵑花屬植物之間形成的一種共生體，它具有促進杜鵑花對營養元素的吸收、改良根際土壤，增強植物的長勢、移栽成活率、抗旱和抗病力等作用。國內杜鵑花菌根真菌研究處于起步階段，相關報道較少，大多處于基礎研究階段，一直未進入應用領域。發明內容
本發明的目的是針對上述不足而提供一種利于杜鵑花屬植物生長發育和菌根形成的菌液制備方法，該菌液用于浸泡杜鵑花種子、浸泡組培苗根、浸泡移栽的杜鵑花根部。
本發明的技術解決方案是一種利于杜鵑花屬植物生長發育和菌根形成的菌液制備方法，其步驟如下(I)材料與處理采集杜鵑花屬植物的成熟須根，消毒，切成根段備用。
(2)培養基和配置1000 mL 培養基的含量為KH2P04380 mg，MgS04 ·7Η20149 mg，維生素 C26 mg，泛酸鈣 67 11^，煙酸1.4 11^，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16. 5 g，瓊脂粉8. 5 g，1. 5%脫氧膽酸鈉溶液4 mL和O.05 mg 口引哚乙酸。
(3)母液制備將步驟(I)中的根段切段后接種到培養皿中培養基表面，置于25±2 °C的生化培養箱中培養。
待菌絲從根上發 出，挑取橫切面真菌菌絲，轉接于新的培養基(步驟(2)中培養基)上繼續培養，純化，純化后的菌株接種到試管內的斜面培養基上，置于3 5 °C的低溫設備中保存。
液體菌種母液的培養是將步驟(2)中培養基中的瓊脂去掉后配置的液體培養基， 6Phialocephala fortinii, PeziziIla ericace, Oidiodendron maius,Meliniomyces variabilis, Cryptosporiopsis ercae, Acaulospora lacunosa 分另lj在試管內培養至菌絲長滿斜面后，分別取含有菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養基的三角錐形瓶中，錫紙封住瓶口后置于恒溫搖床上振蕩培養15 20 d，收集500 mL培養液并以無菌水定容至1000 mL，并分裝于500 mL的茶色容器中用錫紙封口后搖均，置于溫度為25±2 °〇條件下保存7 10 d，期間每天搖動I 2次，每次20 30 min,即成液體菌種母液。
(4)菌液制備生產用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL，紅糖500 g溶解后，加水至50 L發酵 7 10 d，聞到香味后即可使用。
本發明的優點是1、本發明選取我國長白山區杜鵑花屬9個品種杜鵑花的根系進行了菌根真菌的分離、純化、初步鑒定，并完成了液體母種和生產用菌液的制備，為長白山杜鵑花屬和國內外其它種杜鵑的引種、人工繁育、栽培和育種等生產應用和基礎研究提供技術方法，同時，可促進杜鵑花的高效生產和推廣應用。可用該菌液浸泡杜鵑花種子48 h， 散播于已用菌液灌透的基質(基質為腐殖土和蛭石，比例為3:1)中覆蓋腐熟松針保濕，18 d 可萌發，萌發率為92. 1%，移栽成活率90. 0%以上。杜鵑花組培苗出瓶后，用菌液浸泡組培苗根18 24 h后，將組培苗植于已用菌液灌透的基質(基質為腐殖土、腐熟松針和蛭石，比例為3:2:1)中，覆蓋透光性好的塑料薄膜保溫保濕(煉苗)。可提高成活率至99. 5%以上。杜鵑花移栽時，可將杜鵑花粗根剪掉2/3，再用菌液浸泡12 18 h，可提高成活率至93. 9%以上。
下面將結合實施例對本發明的實施方式作進一步詳細描述。
具體實施方式
一種利于杜鵑花 屬植物生長發育和菌根形成的菌液制備方法，其步驟如下I材料與處理于長白山區采集牛皮杜胃$ {Rhododendron chrysan thum Pall.)、短果杜匿$ {Rhododendron brachycarpum D. Don)、照白杜匿$ (TPAotZoofeWro/ micranthum Turcz·)、小葉杜匿烏{Rhododendron parvi folium Adams.)、大字杜匿 $ {Rhododendron schlippenbachi i Maxim.)、興安杜匿 $ {Rhododendron dauricum L.)、迎紅杜匿 $ {Rhododendron mucronula turn Turcz.)、毛租杜胃$ {Rhododendron confer ti ssimum Nakai)和荀葉杜胃$ {Rhododendron redowskianum Maxim.)等9個種的杜醇花纖細根。破土后剪取近粗根處生長健壯直徑為1.O mm以下的成熟須根，用軟毛刷輕輕洗去泥土，流水沖洗過夜后剪成3 4 cm。在超凈工作臺下，用70%酒精(其中含有5%鏈霉素)消毒20 S，再用質量濃度為0. 5%的次氯酸鈉溶液消毒8 min,無菌水沖洗8次，無菌濾紙吸干根表面水分，切除被殺毒滅菌劑損傷部分后并切成約2. O 3. O cm左右的根段備用。
2 方法2.1培養基和配置培養基成分及含量(1000 mL培養基的含量)為KH2P04380 mg，MgSO4 · 7H20149 mg，維生素C26 mg,泛酸|丐67 11^,煙酸1.4 mg,蛋白胨3. O g,葡萄糖16.5 g，瓊脂粉8. 5 g。
將以上組分混合均勻并溶化后分裝于培養皿中，121°C濕熱滅菌20 25 min取出，待溶液未凝固前，通過過濾滅菌每個培養皿中加入1. 5%脫氧膽酸鈉溶液4 mL和O. 05 mg吲哚乙酸。
2.2真菌的分離、純化、初步鑒定、保存、母液和菌液制備將步驟I中處理的根段切成O. 5 Cm (切口面要盡可能大)后接種到培養皿中培養基表面，每皿接3段，共10皿，置于(25±2) °〇的生化培養箱中培養。
待菌絲從根上發出，挑取橫切面真菌菌絲，轉接于新的培養基(步驟2.1中的培養基)上繼續培養，每轉接培養I次都需顯微鏡下觀察菌株純度，直至獲得純化菌株(形態一致)。純化后的菌株接種到試管內的斜面培養基上，至于3 5 °C的低溫設備中保存。
采用形態學方法對純化的菌種進行初步鑒定，將菌株接種于培養基中，至于 (25 ±2) °C條件下培養。并記錄菌株生長速度，觀察菌落特征。
液體母種的培養是將步驟2.1中培養基中的瓊脂去掉后配置的液體培養基，分裝到250 mL三角錐形瓶中(每瓶50 75 mL)，將純化的多個菌種分別在試管內培養至菌絲長滿斜面后，分別取1. O cm大小的含有菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養基的三角錐形瓶中 (每種各放I塊)，用適當尺寸的錫紙封住瓶口后置于恒溫搖床上振蕩培養15 20 d，收集 500 mL培養液并以無菌水定容至1000 mL,并分裝于500 mL的茶色容器中用錫紙封口后搖均，置于溫度為(25±2) °C條件下保存7 IOd (期間每天搖動I 2次，每次20 30 min)即成液體菌種母液。液體菌種母液防止于陰涼干燥處保存即可。
生產用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL,紅糖500 g溶解后，加水至50 L發酵7 10 d，聞到香味后即可使用(期間用干凈的木棒每天攪拌2次)。
結果3.1菌根真菌的分離、純化和初步鑒定杜鵑花類菌根真菌生長及其緩慢，需要培養20 30天，生長稍快的菌落直徑達5 7 cm,生長較慢的僅O. 5 2. 5 cm。
通過對9種野生杜鵑花科植物根部菌根真菌的分離培養、純化和初步鑒定，共分離獲得根內生真菌70余株，每種杜鵑花分離獲得的真菌菌落形態上可以大致分為3 8種以上。
利用形態學方法鑒定得到9種杜鵑的6種杜鵑花類菌根真菌的優勢種，分別為 Phialocephala fort ini i, Pezizilla ericace，Oidiodendron maius，Meliniomyces variabiHs, Cryptosporiopsis ercae，Acaulospora lacunosa。
3.2純化后的菌根真菌母液和菌液制備根據步驟2. 2中方法 ，將含有6個菌種菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養基的三角錐形瓶中進行混合培養，得到液體菌種母液。
生產用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL,紅糖500 g溶解后，加水至50 L發酵7 10 d，聞到香味后即可使用。
3.3純化后的菌根真菌、母液和菌液保存純化后的菌株接種到試管內的斜面培養基上，至于3 5 °C的低溫設備中保存。液體菌種母液防止于陰涼干燥處保存即可。
3.4純化后的菌根真菌菌液的應用范圍及方法應用以上真菌回接試驗和菌液侵染春鵑、夏鵑、烈香杜鵑、鹿角杜鵑、羊躑躅、細葉杜香、篤斯越桔、各種盆栽杜鵑和高山杜鵑等120余種均不同程度或至少I種真菌于不同種杜鵑花形成菌根結構，但存在菌根形成快慢差異。
方法一可用菌液浸泡杜鵑花種子48 h，散播于已用菌液灌透的基質(基質為腐殖土和蛭石，比例為3:1)中覆蓋腐熟松針保濕，18 d可萌發，萌發率為92. 1%，移栽成活率 90. 0%以上。
方法二 杜鵑花組培苗出瓶后，用菌液浸泡組培苗根18 24 h后，將組培苗植于已用菌液灌透的基質(基質為腐殖土、腐熟松針和蛭石，比例為3:2:1)中，覆蓋透光性好的塑料薄膜保溫保濕(煉苗)。可提高成活率至99. 5%以上。
方法三杜鵑花移栽 時，可將杜鵑花粗根剪掉2/3，再用菌液浸泡12 18 h，可提高成活率至93. 9%以上。
權利要求
1.一種利于杜鵑花屬植物生長發育和菌根形成的菌液制備方法，其特征在于步驟如下(1)材料與處理采集杜鵑花屬植物的成熟須根，消毒，切成根段備用；(2)培養基和配置·1000 mL 培養基的含量為KH2P04380 mg，MgS04 ·7Η20149 mg，維生素 C26 mg，泛酸鈣 67 11^，煙酸1.4 11^，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16. 5 g，瓊脂粉8. 5 g，1. 5%脫氧膽酸鈉溶液4 mL和·O.05 mg卩引哚乙酸；(3)母液制備將步驟(I)中的根段切段后接種到培養皿中培養基表面，置于25±2 °C的生化培養箱中培養；待菌絲從根上發出，挑取橫切面真菌菌絲，轉接于新的培養基上繼續培養，純化，純化后的菌株接種到試管內的斜面培養基上，置于3 5 °C的低溫設備中保存；液體菌種母液的培養是將步驟(2)中培養基中的瓊脂去掉后配置的液體培養基，將 6 yIvIifft Phialocephala for tin i i, Pezi zi Ila ericace, Oidiodendron maius, Meliniomyces variabilis, Cryptosporiopsis ercae, Acaulospora /acwfliosa 分另lj在試管內培養至菌絲長滿斜面后，分別取含有菌絲的瓊脂塊放入裝有液體培養基的三角錐形瓶中，錫紙封住瓶口后置于恒溫搖床上振蕩培養15 20 d，收集500 mL培養液并以無菌水定容至1000 mL，并分裝于500 mL的茶色容器中用錫紙封口后搖均，置于溫度為25±2 °〇條件下保存7 10 d，期間每天搖動I 2次，每次20 30 min,即成液體菌種母液；(4)菌液制備生產用菌液配置方法是液體菌種母液500 mL，紅糖500 g溶解后，加水至50 L發酵 7 10 d，聞到香味后即可使用。
全文摘要
本發明涉及一種植物生長發育菌液，即一種利于杜鵑花屬植物生長發育和菌根形成的菌液制備方法。其步驟如下(1)材料與處理采集杜鵑花屬植物的成熟須根，消毒，切成根段備用。(2)培養基和配置1000mL培養基的含量為KH2PO4380mg，MgSO4·7H2O149mg，維生素C26mg，泛酸鈣67mg，煙酸1.4mg，蛋白胨3.0g，葡萄糖16.5g，瓊脂粉8.5g，1.5%脫氧膽酸鈉溶液4mL和0.05mg吲哚乙酸。(3)母液制備。(4)菌液制備。為長白山杜鵑花屬和國內外其它種杜鵑的引種、人工繁育、栽培和育種等生產應用和基礎研究提供技術方法。
文檔編號C12N1/14GK103060207SQ20131001895
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者顧地周, 顧川岳, 朱俊義, 姜云天, 陸爽, 潘雨, 禚玲玲, 張學士, 王秋爽, 付航 申請人:通化師范學院