專利名稱：新城疫病毒株rLX/H9HA及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及應用反向遺傳技術，拯救一株以新城疫病毒為載體表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rLX/H9HA，用于研制疫苗。
背景技術：
反向遺傳操作技術(Reversegenetics manipulation technique)是指將 RNA病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在體外通過采用基因突變、基因插入、基因敲除、基因置換等方法人為構建新的具有感染性的病毒，以研究病毒的基因組結構及功能和病毒宿主之間的相互作用等[Conzelmann KK.Reverse genetics of mononegavirales.Curr TopMicrobiol Immunol.2004.283:1_41.]，也叫全長感染性cDNA克隆技術，又常被稱為“病毒拯救”。解決了 RNA病毒基因組難以操作這一難題，同時為新型疫苗的研發提供了新的思路[Nakaya T,et al., Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.Journal of Virology, 2001.75(23):p.11868-73.]。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是單股、不分節段的負鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科成員。按照標準的致病性指標可以將病毒分為速發型(強毒)、中發型(中等毒力)和緩發型(弱毒)。基因組長度大約15kb，其結構為3’ -1eader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次編碼6種結構蛋白:核衣殼蛋白(Nucleocapsidprotein, NP)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基質蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidaseprotein,HN)和大分子蛋白(Largeprotein, L)。 禽流感病毒(AvianInfluenza Virus,AIV)是禽流感(Avian influenza, A I)的病原體，分類上屬于正黏病毒科(Orthomyxovoridae) ,A型流感病毒屬。病毒基因組由8個單股負鏈的RNA片段組成，各自編碼功能性蛋白，分別為PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。一般呈球形，直徑80nnTl20nm，有囊膜，囊膜表面主要有2種糖蛋白纖突，即血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase, NA),迄今已發現16種HA亞型和9種NA亞型。禽流感病毒對宿主的致病性是由多個基因決定的，其中HA基因及其編碼的蛋白尤為重要，在病毒吸附及穿膜過程中起著關鍵作用，是重要的表面抗原，它刺激機體產生中和抗體，可中和病毒的感染。H9N2亞型禽流感病毒是危害當前養禽業的重要病原之一，廣泛存在于家禽中，雖然表現為低致病性，但具有一些獨有的發病特點，主要表現為高感染率、高發病率、低死亡率，多引起雛雞和育成雞的隱性感染和產蛋雞的產蛋下降且產蛋率難以恢復，對養禽業造成了嚴重的危害，并具有重要的公共衛生意義。疫苗接種是防制新城疫和禽流感這兩種疾病的主要有效手段。同滅活苗相比，活載體疫苗具有用量少、成本低、省時省力、免疫保護時間長等優點，可達到一針防多病的目的。載體病毒最重要的一個特點是能被用來迅速研制出針對新發高致病性傳染病的基因工程疫苗。NDV除具備這一特點外，還具有遺傳穩定性好、不存在與細胞基因組整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性強等諸多優點，可作為疫苗載體[Bukreyev A, Skiadopoulos MH, Murphy B R, et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology, 2006, 80 (21): 10293-10306.] 在 NDV 基因組內插入禽流感病毒HA基因后的重組病毒，可在動物體內復制并穩定持續地表達HA蛋白，用此重組病毒作為疫苗，可以誘導機體產生針對Al和ND的雙重免疫保護力[Veits J, Wiesner D, FuchsWj et al.Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protectschickens against Newcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad SciUSA, 2006, 103(21):8197-8202.Schroer Dj Veits Jj Grund C，et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7 avian influenza virus[J].Avian Dis，2009，53 (2):190-197.]。2004年劉曉文等從LBM的健康鴨群中分離到具有高滴度生長特性的NDV毒株LX(遺傳進化上屬于ClassII基因I型)，并成功構建其全長克隆pLX[王曉泉，劉曉文，等.新城疫病毒弱毒骨架表達強毒F基因的重組病毒生物學特性研究[J].中國動物傳染病學報.2010, 18 (6): 22-26.]。2012年，古小兵等于常州武進分離到一株具有代表性的H9N2亞型 AIV 流行毒株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012，其 HA 效價為 Illog2, EID5tl 為 9.17，熱穩定，具有很好的抗原性。因此，本發明以PLX為骨架，構建可表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，用于應對 當前H9亞型禽流感和新城疫的流行。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種以新城疫病毒為載體表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，用于制造疫苗。本發明新城疫病毒(NewcastleDisease Virus) rLX/H9HA,保藏號為 CGMCC No:6652。本發明新城疫病毒rLX/H9HA用于表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的應用。本發明利用已建立的鴨源新城疫病毒LX株的反向遺傳操作平臺，將H9N2亞型AIVWJ57株的HA基因ORF插入NDV全長轉錄載體pLX，構建出重組質粒pLX_H9HA，該重組質粒與三個輔助質粒共轉染BSR-T7/5細胞后，獲得了具有較高繁殖性能的表達H9亞型禽流感病毒HA蛋白的重組疫苗株rLX/H9HA，適合疫苗的大規模生產。本發明的第二個目的在于提供一種表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組新城疫疫苗株rLX/H9HA的構建方法，是以NDV弱毒LX株的基因組全長轉錄載體pLX為骨架，將H9亞型AIV流行株A/Chicken/JiangSu/WJ57/2012的HA基因的開放閱讀框插入轉錄載體PLX的？、1基因之間，經反向遺傳技術獲得重組病毒1*1^/!19撤。具體包括以下步驟:1.全長克隆pLX-H9HA的構建I) H9N2亞型禽流感病毒WJ57株HA基因的分段克隆構建陽性質粒pmWJl和pmWJ2:以WJ57株病毒的cDNA為模板，設計兩對引物分兩段擴增HA基因0RF，即WJl:1 1067nt、WJ2:1068 1683nt，分別克隆獲得陽性質粒pmWJl和pmffJ202) pmWJl與NDVLX株P基因融合克隆的構建
以LX株基因組cDNA為模板擴增其2350_3141nt，以pmWJl為模板擴增HA基因ORF的fl067nt，通過Overlap PCR將二者融合在一起并克隆得到質粒pPWJl。3) pmffJ2與NDVLX株M基因融合克隆的構建分別以陽性質粒pmWJ2和LX株基因組cDNA為模板PCR擴增H9HA基因ORF的1068 1683nt和LX株基因組3142 3635nt，Overlap PCR將二者融合在一起，克隆得到陽性質粒pWJ2M。4)全長克隆pLX- H9HA的獲得質粒pPWJl與pWJ2M同時用Aar I和Spe I進行雙酶切，回收目的片段并連接，構建質粒pPWJM ;用Sac II和Avr II對質粒pPWJM進行雙酶切后替換pLX的對應序列，構建出重組NDV基因組全長克隆pLX-H9HA，具體的構建模式見圖1。2.重組病毒rLX/H9HA株的拯救將質粒pLX-H9HA與pCI_NP、pC1-P和pCI_L三個真核表達質粒共轉染BSR-T7/5細胞，一段時間后接種9 11日齡SPF雞胚，收獲得到重組病毒rLX/H9HA。
圖1重組質粒pLX-H9HA構建模式圖。圖2重組質粒pLX-H9HA的Hind III酶切鑒定圖；M:500bp DNA ladder marker ；1:pLX_H9HA。圖3重組病毒rLX/H9HA的HA基因RT-PCR產物電泳圖；I =WJ-SU WJ-R2 引物擴增產物；M:200bp DNA ladder marker 圖4重組病毒感染CHO細胞外源基因表達的檢測；A-C為LX感染組，D-F為rLX/H9HA感染組。A、D組以抗NDV HN的單克隆抗體為一抗，B、E組以H9N2亞型AIV高免血清為一抗，C、F組以SPF雞陰性血清為一抗進行間接免疫熒光檢測。
具體實施例方式本發明表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組新城疫疫苗株rLX/H9HA于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；其保藏號CGMCC No:6652，分類命名為:新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)其長度為:16896bp。構建步驟一:以新城疫病毒LX為載體表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的全長表達克隆的構建生物材料準備:新城疫病毒LX株的全長表達克隆pLX[王曉泉，劉曉文，等.新城疫病毒弱毒骨架表達強毒F基因的重組病毒生物學特性研究[J].中國動物傳染病學報.2010, 18(6):22-26.]，由揚州大學農業部畜禽傳染病重點開放實驗室構建、保存。H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012株(下稱WJ57株)由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室分離、保存。pGEMT-easy 載體:購自 Promega 公司；AMV 反轉錄酶、High fidelityDNApolymerase、T4 DNA 連接酶、Agarose Gel DNA ExtractionKit 購自 Roche 公司；轉染試劑SuperFect和質粒抽提試劑盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)為QIAGEN公司產品；其余常規試劑均為國產分析純。1、H9N2亞型禽流感病毒HA基因的序列分析與基因突變提取H9N2亞型禽流感病毒WJ57株的總RNA，并用12nt隨機引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3’ (SEQ ID N0.1))進行RT-PCR反應。序列分析發現需要先對其ORF的31和1063位兩個Spe I酶切位點進行沉默突變。設計2對引物，分別用于擴增HA基因ORF 的 I 1076nt、1068 1683nt。兩對突變引物分別是:WJ-Sl:5，-TTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACT O CT O GTAGCAA-3 ’ (SEQ ID N0.2 )WJ-Rl:5’ -TATTCACCTGCATCGACgAGCCCTGACCAACCTCCCTCTAT-3’ (SEQ ID N0.3)WJ-S2:5，-TATTCACCTGCATCGToGTTGCTGGTTGGTATGGATT-3’ (SEQ ID N0.4)WJ-R2:5’ -GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3’ (SEQ ID N0.5)突變堿基以斜體標注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應:以 反轉錄的cDNA為模板配制如下PCR反應體系:
權利要求
1.一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rLX/H9HA,保藏號為 CGMCC No:6652。
2.權利要求1所述新城疫病毒rLX/H9HA的構建方法，其特征在于:以NDV弱毒LX株的基因組全長轉錄載體PLX為骨架，將H9亞型AIV流行株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因插入轉錄載體pLX的？、1基因之間，經反向遺傳技術獲得重組病毒1*1^/!19撤。
3.權利要求1 所述新城疫病毒rLX/H9HA用于表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的應用。
全文摘要
本發明表達H9亞型禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus)血凝素蛋白的重組新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus)rLX/H9HA，保藏號為CGMCCNo6652。本發明是利用已建立的NDV弱毒LX株的反向遺傳操作平臺，將H9N2亞型AIV流行株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因插入LX株基因組全長轉錄載體pLX中，得到含有H9N2亞型AIVHA基因的重組新城疫病毒基因組全長cDNA克隆pLX-H9HA。經轉染獲得的重組病毒rLX/H9HA在雞胚上具有較高的繁殖滴度，連續傳多代仍能穩定表達HA蛋白，適合于疫苗的大規模生產，可用于制造疫苗。
文檔編號C12N15/86GK103146751SQ201310042470
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者劉秀梵, 丁平云, 陳雨昕, 劉曉文, 胡順林, 王曉泉 申請人:揚州大學