專利名稱：一種有效的稻曲病菌分離方法
技術領域：
本發明涉及一種有效的稻曲病菌分離方法，屬于微生物技術領域。
背景技術：
水稻稻曲病俗稱豐收病，為水稻穗部的一種重要病害，其病原菌為半知菌亞門綠核菌氣綠核M Ustilaginoidea virens (Cook.)Tak。近年來,隨著密穗型高產優質稻的大力推廣，稻曲病發生面積及為害程度逐漸加重，稻曲病的發生對水稻產量和品質有明顯影響，田間病穗上的稻曲球數量通常在I 10粒，多的會達到30 50粒，稻曲球厚垣孢子粉呈墨綠色或黑色，混入稻谷后嚴重污染稻谷，影響米質和外觀，而且混雜于病稻谷中的稻曲球及病菌含有對人畜有毒害作用的毒素，稻曲病現已成為水稻生產上的重要病害，嚴重制約著我國水稻的安全生產。目前用于稻曲病菌分離的材料有稻曲球及菌核(由少數稻曲球產生)，但相對于菌核而言，田間稻曲球數量多，容易采集。在不同生境病菌、同一稻曲球不同單孢分離物的遺傳多樣性、變異機制及致病性研究方面，采用稻曲球作為病菌分離的材料顯示出更為重要的作用。稻曲病菌屬于一種寄生性較強腐生性較弱的真菌，稻曲球營養豐富，常伴生大量的腐生細菌、真菌及其它病原菌，加之該菌生長緩慢，分離過程中容易受到雜菌污染，分離成功率很低。目前利用稻曲球分離病菌的方法有組織分離法、孢子振落法、厚垣孢子懸浮液法，其中稻曲球內層組織分離法多被研究者所采用。然而在實際操作過程中，所需的培養時間較長，分離速度較慢，成功率較低，因其常伴隨其它細菌、真菌等雜菌的出現，影響稻曲病菌進一步分離和純化的效果。孢子振落法，是直接將稻曲球表面的厚垣孢子直接振落至分離用的培養基上，由于稻曲表面不作消毒處理，稻曲表面大量的雜菌也易被振落在培養基表面上，并快速生長，影響厚垣孢子萌發、生長及菌落的純化。厚垣孢子懸液法，因混于培養基中的厚垣孢子須萌發成菌絲穿過培養基，延長了厚垣孢子形成單菌落的時間，易導致生長速度過快的雜菌覆蓋于少量饅頭狀的單菌落上，加大分離純化的難度。劉明霞2009分別采用組織分離法和厚垣孢子懸液法對稻曲球病菌進行分離，結果表明兩種方法分離的成功率分別只有8.5%和5.3% (劉明霞，2009，稻曲病菌分離技術、培養條件研究，遼寧農業科學，2009.(6):20-22)。一種簡便的稻曲病菌快速分離法(ZL201010301356.0)為申請者一個發明專利，其主要技術特點是稻曲球表面消毒劑處理后，用無菌水搗碎稻曲球，使搗碎液含有厚垣孢子和內層組織塊，然后用搗碎液沖洗分離用的脅本哲氏培養基表面，能快速地分離出稻曲病菌，但該方法在分離過程中使用了乙醇和升汞消毒劑，由于厚垣孢子對消毒劑較為敏感(王永強，2010，稻綠核菌(稻曲病菌)分離方法的比較研究，菌物學報2010，29 (1)，采用此法對存放時間較長、厚垣孢子萌發力較低的稻曲球病菌分離有明顯的影響。田間采集的稻曲球存放3個月，其表面的厚垣孢子仍具有一定的萌發能力，稻曲球表面雖有較多的雜菌伴生，但種群數量不及厚垣孢子，因此本發明的目的是在專利ZL201010301356.0技術特征基礎上，利用 稻曲球厚垣孢子的萌發特性及其數量優勢，通過技術改進，弱化稻曲球厚垣孢子中雜菌的干擾作用，同時避免消毒劑對厚垣孢子的殺傷作用，增加分離的成功率，減少分離過程和步驟，而提供一種更為簡便、更為有效的稻曲病菌分離方法，供稻曲病研究工作者使用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種更為簡便、有效的稻曲病菌分離方法，在短期內可從稻曲球中大量、快速地分離出稻曲病菌，為稻曲病菌的研究提供基礎。本發明的目的是通過如下步驟來實現:
(1)稻曲球標樣選擇:選取從田間采集的新鮮的黃色、黃綠色或綠色稻曲球，或選取用紙袋分裝晾干，常溫或4°C冰箱保存，保存時間不超過3個月的稻曲球；
(2)厚垣孢子懸浮液的制備:用無菌挑針刮取單粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于無菌培養皿中,加入0.5mL的無菌水懸浮制成厚垣孢子懸浮液；
(3)厚垣孢子懸浮液的稀釋:將厚垣孢子懸浮液與無菌水按1:5比例稀釋2 3個梯度后備用；
(4)稻曲病菌分離:用移液槍吸步驟(3)已稀釋好的厚垣孢子懸浮液0.2mL于分離用脅本哲氏固體培養基表面，并用無菌玻璃三角棒均勻涂抹，再將含有上述培養基的培養皿倒置放入恒溫箱中28°C黑暗培養，逐日觀察分離結果；
(5)稻曲病菌純化:培養第6天后，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落移至培養用PSA固體培養基中純化培養10天；
(6)稻曲病菌保存:依據病菌在培養基的生長特性及其顯微觀察結果，將稻曲病菌移至PSA斜面培養基中培養10天后，保存于4°C冰箱中。所述分離用脅本哲氏培養基的配方為:馬鈴薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(NO3)2 4H20 0.5g、Na2HPO4 12H20 2.0g、瓊脂 16g、加水定容至 lOOOmL，在 121°C下高壓濕熱滅菌20 25min，待培養基冷卻至45°C 50°C時加入抑制細菌生長的氯霉素50 y g/ml混勾，倒入培養皿中凝固后備用。所述培養用PSA固體培養基的配方為:馬鈴薯200g、瓊脂20g、蔗糖20g、加水定容至1OOOmL,在121°C下高壓濕熱滅菌20min后備用。采用本發明對于煙粉風寄生菌臘階輪枝菌(K6 r(ici77iw Iecanii)(從被感染的煙粉風若蟲體表)的分離、對于稻痕病菌iiyricuInrin grisea)(感染病菌的穗頸痕枝梗保濕24后，能產生大量分生孢子)的單孢分離也較為適用。本發明利用存放3個月之內稻曲球厚垣孢子的萌發特性及其種群數量優勢，采用厚垣孢子粉的挑釷刮取和無菌水梯度稀釋技術減少厚垣孢子懸浮液中雜菌數量，弱化雜菌的干擾效果，同時避免了消毒劑對厚垣孢子的殺傷作用，保障了厚垣孢子原有的萌發能力，而提供一種更為簡便、省材、實用、有效的稻曲病菌分離方法。
圖1為稻曲病菌的單孢分離物；A表示分離培養第6天的單孢小菌落，平皿無污染；B表示分離培養第6天的單孢小菌落，平皿有污染，但不影響菌落的純化；C表示分離培養第10天的單孢菌落,菌落形態清晰。圖2為稻曲病菌平板培養的菌落形態。
圖3為稻曲病菌液體培養的形態。圖4為稻曲病菌菌絲及其分生孢子。圖5為稻曲病菌分生孢子萌發圖，從左至右分別表不分尚病菌萌發12h、分尚病菌萌發24h、 已知病菌萌發24h。
具體實施例方式實施例1
(I)稻曲球標樣來源:常溫下保存3個月的稻曲球。(2)培養基配制
A:分離用的培養基采用脅本哲氏培養基:馬鈴薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(N03) 2 4H20 0.5g、Na2HP04 12H:0 2.0g、瓊脂 16g、加水定容至 IOOOmL0 培養基在121°C下高壓濕熱滅菌20min，待培養基冷卻至45°C 50°C時加入抑制細菌生長的氯霉素(50ug/ml)混勻，并倒入培養皿中，培養基凝固后備用。B:培養用的培養基采用PSA固體培養基、PS液體培養基。PSA固體培養基為馬鈴薯200g、瓊脂20g、蔗糖20g、加水定容至lOOOmL。PS液體培養基為馬鈴薯200g、蔗糖20g、加水定容至lOOOmL。以上培養基均在121°C下高壓濕熱滅菌20min后備用。(3)厚垣孢子懸浮液的制備:用無菌鑷子夾住稻曲球，用無菌挑針將稻曲球表面某一處的厚垣孢子粉刮取少許(約0.005g),使之置于無菌培養皿(直徑=8.9cm)中，加入
0.5mL的無菌水懸浮，制成厚垣孢子懸浮液。在1.8mL的Eppendorf管中，用移液槍吸取
0.1ml厚垣孢子懸浮液與0. 5ml無菌水按1:5比例稀釋3個梯度后備用，使稀釋液中厚垣孢子粉的最終濃度約為4.6X l(T5g/mL。(4)稻曲病菌分離:用移液槍吸已稀釋好的厚垣孢子懸浮液0.2mL于分離用的脅本哲氏固體培養基表面，并用無菌玻璃彎棒均勻涂抹。將含有培養基的培養皿倒置放入恒溫箱中28°C黑暗培養，逐日觀察分離結果。(5)稻曲病菌純化:培養第6天后，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落(如圖1所示)移至培養用PSA培養基中純化培養10天。(6)稻曲病菌保存:依據病菌在培養基的生長特性及其顯微觀察結果，將稻曲病菌移至PSA斜面培養基中培養10天后，保存于4°C冰箱中。(7)稻曲病菌生長及顯微觀察
取純化培養7天的病菌進行平板培養現狀觀察，觀察菌落形態特征及生長速度，如圖2所示；挑取純化培養的病菌菌塊接種于PS液體培養基中，28°C振蕩培養7 10天后，分別觀察菌絲球的形態及菌絲產孢情況。(8)分生孢子萌發特性觀察
吸取少量的PS液體培養基振蕩培養10天的分生孢子液于PSA固體培養基表面,均勻涂抹后，將含有培養基的培養皿倒置放入恒溫箱中28°C黑暗培養12h或24 h，400倍鏡下觀察稻曲病菌分生孢子的萌發情況，并與已知稻曲病菌的分生孢子萌發特征作比較。如圖3、4、5所示，依據分離物培養特征觀察、孢子形態顯微觀察及其分生孢子萌發特性觀察結果，可鑒定出分離物為稻曲病菌。采用稻曲病室內人工接種法，供試的分離物能引起水稻產生稻曲球。(楊秀娟，2011，水稻稻曲病室內人工接種技術.植物保護學報，2011，38(5):395-400),由此表明采用本發明方法從稻曲球上能有效地分離出稻曲病菌。實施例2幾種稻曲病菌分離方法結果比較
1、本發明的稻曲病菌有效分離法，其步驟如下:
1)稻曲病菌的分離 同實施例1
2)稻曲病菌生長、分生孢子萌發特性與顯微觀察 同實施例1
2、厚垣孢子懸液法
參照周永力1999方法(周永力，1999，稻曲病菌分離技術的初探，中國水稻科學，1999.13(3):186-188),即稻曲球用75%乙醇將消毒30s后，再用無菌水洗3次，然后置于Eppendorf管中振蕩配制成厚垣孢子懸浮液，取2 3滴滴加在培養皿中，待培養基冷卻至45°C 50°C時倒入培養皿中，輕輕搖動使之與孢子懸浮液混勻，待培養基凝固后置于恒溫箱中28°C黑暗培養，逐日觀察分離結果。3、專利 ZL201010301356.0 分離法
單粒稻曲球用75%乙醇消毒Imin、0.1%升萊消毒2min后,再用無菌水清洗3次。然后置于培養皿中(d=5cm)中，加無菌水4mL，用無菌手術刀搗碎后，即為組織搗碎液(內含厚垣孢子和組織碎塊)。再用移液槍吸取搗碎液ImL (含組織碎塊)沖洗于含脅本哲氏培養基的培養皿中(d=9cm )，使培養基表面有搗碎液覆蓋和組織碎塊分散，隨后吸去殘余的搗碎液。并在操凈工作臺無菌條件下風干培養基表面水份，風干后的培養皿置于恒溫箱中28°C黑暗培養，逐日觀察分離結果。4、實施效果
I)本發明的稻曲病菌有效分離法，分離培養第6天后便可見較多形態一致、清晰、無雜菌感染的黃色和白色單菌落，分離純化容易。這些純化物經平板培養、液體培養特征、孢子和菌絲顯微觀察及其分生孢子萌發特性觀察均可證實為稻曲病菌。田間采集的稻曲球存放3個月后，其表面的厚垣孢子仍具有較好的萌發能力，稻曲球表面雖有較多的雜菌伴生，但種群數量不及厚垣孢子，操作過程中由于不使用稻曲球表面消毒劑，避免了消毒劑對厚垣孢子的殺傷作用，同時采用稻曲球厚垣孢子粉挑針刮取法和無菌水梯度稀釋法減少厚垣孢子懸浮液中的雜菌數量，弱化了厚垣孢子懸浮液中雜菌的干擾作用，使得平板污染較少，甚至無污染，出現的單菌落形態清晰，易于純化。且厚垣孢子是均勻擴散在培養基表面，保證了厚垣孢子萌發和菌絲生長時的氧氣，因而在6天內即可快速分離到稻曲病菌。采用此法對田間剛采集的稻曲球分離效果最好，也特別適用于常溫或4°C冰箱存放3個月以內的黃色、黃綠色和綠色的稻曲球病菌分離，分離的標本成功率可達85%以上。2)采用厚垣孢子懸液 法，由于稻曲病菌生長極為緩慢，混于培養基中的厚垣孢子須萌發成菌絲穿過培養基，需10天才長出少量白色單菌落(分布不均勻，菌落出現聚集)，同時出現生長較快的白色或暗綠色雜菌覆蓋于饅頭狀的單菌落上。厚垣孢子對溫度較為敏感，28°C后隨溫度的升高，萌發率急劇下降，45°C幾乎不發芽，50°C為致死溫度。采用厚垣孢子懸液法與培養基(45°C)混勻法，當培養基溫度過高會對孢子有殺傷作用，溫度過低引起培養基與孢子懸液法混勻不充分，導致白色單菌落分布不均勻，菌落出現聚集，培養10天時，菌落形成處常出現生長速度過快的雜菌覆蓋，增加了稻曲病菌分離純化的難度。3)采用專利ZL201010301356.0分離法，分離培養第6天后便可見較多形態一致、清晰、無雜菌污染的黃色和白色單菌落，部份組織塊長有疑似稻曲病菌的白色菌絲，分離純化培養容易。這些純化物經平板培養特征、孢子和菌絲顯微觀察及其其分生孢子萌發特性觀察均可證實為稻曲病菌。由于搗碎液厚垣孢子多，雜菌較少，即使有少量雜菌出現也可通過菌落優勢性進行快速區分和初篩，但該方法使用了乙醇和劇毒的升汞消毒劑。厚垣孢子對消毒劑較為敏感，稻曲球表面消毒劑的處理能導致部分厚垣孢子萌發能力的喪失，稻曲球表面清洗也能引起部份具有萌發能力厚垣孢子數量的減少，采用此法對常溫存放3個月的稻曲球病菌分離效果較差。從供試68個不同來源的稻曲球標樣中能分離出目標菌株的標樣有27個，而采用本發明的方法能有效分離出目標菌株的標樣有59個。相同稻曲球采用本發明的方法分尚之后，再米用專利ZL201010301356.0分尚法分尚，發現供試的15個標樣中，前者有13個標樣分離成功，而后者僅7個標樣分離成功，平板中分離獲得單菌落數明顯低于后者。表明本發明的方法更適用于稻曲球病菌的分離，操作上更為簡便。本發明的方法是 在專利ZL201010301356.0技術特征基礎上，通過技術改進，減少操作步驟，而提供的一種更為簡便、實用、有效的稻曲病菌分離方法，具有更為省材、快捷、方便、適用等優點。
權利要求
1.一種有效的稻曲病菌分離方法，其特征在于:按照以下步驟進行: (1)稻曲球標樣選擇:選取從田間采集的新鮮的黃色、黃綠色或綠色稻曲球，或選取用紙袋分裝晾干，常溫或4°C冰箱保存，保存時間不超過3個月的稻曲球； (2)厚垣孢子懸浮液的制備:用無菌挑針刮取單粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于無菌培養皿中,加入0.5mL的無菌水懸浮制成厚垣孢子懸浮液； (3)厚垣孢子懸浮液的稀釋:將厚垣孢子懸浮液與無菌水按1:5比例稀釋2 3個梯度后備用； (4)稻曲病菌分離:用移液槍吸步驟(3)已稀釋好的厚垣孢子懸浮液0.2mL于分離用脅本哲氏固體培養基表面，并用無菌玻璃三角棒均勻涂抹，再將含有上述培養基的培養皿倒置放入恒溫箱中28°C黑暗培養，逐日觀察分離結果； (5)稻曲病菌純化:培養第6天后，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落移至培養用PSA固體培養基中純化培養10天； (6)稻曲病菌保存:依據病菌在培養基的生長特性及其顯微觀察結果，將稻曲病菌移至PSA斜面培養基中培養10天后，保存于4°C冰箱中。
2.根據權利要求1所述的有效的稻曲病菌分離方法，其特征在于:所述分離用脅本哲氏培養基的配方為:馬鈴薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(NO3)2 *4H20 0.5g、Na2HPO4 12H202.0g、瓊脂16g、加水定容至lOOOmL，在121°C下高壓濕熱滅菌20 25min，待培養基冷卻至45°C 50°C時加入抑制細菌生長的氯霉素50ii g/ml混勻，倒入培養皿中凝固后備用。
3.根據權利要求1所述的有效的稻曲病菌分離方法，其特征在于:所述培養用PSA固體培養基的配方為:馬鈴薯200g、瓊脂20g、蔗糖20g、加水定容至IOOOmL,在121°C下高壓濕熱滅菌20min后 備用。
全文摘要
本發明涉及一種有效的稻曲病菌分離方法，屬于微生物技術領域。用挑針將稻曲球表面的厚垣孢子粉刮取少許置于無菌培養皿中，加入0.5mL的無菌水懸浮厚垣孢子，然后在1.8mL的Eppendorf管中，采用梯度稀釋法，使厚垣孢子懸浮液與無菌水按15比例稀釋2～3個梯度后，吸0.2mL的厚垣孢子稀釋液到分離用的脅本哲氏固體培養基(內含50μg/ml氯霉素)表面，涂抹均勻后，將培養皿倒置放入28℃恒溫箱中黑暗培養，第6天后就能有效分離出目標病菌。本發明方法明顯弱化了稻曲球厚垣孢子中雜菌的干擾作用，操作程序十分簡便，適用于常溫或4℃冰箱存放3個月以內稻曲球病菌的分離，對田間剛采集的稻曲球病菌的分離效果最好。
文檔編號C12N1/14GK103103136SQ20131005815
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月25日 優先權日2013年2月25日
發明者楊秀娟, 何玉仙, 阮宏椿, 杜宜新, 陳福如 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所