水稻條紋病毒p3基因用于制備轉基因抗稻瘟病植物體的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)p3基因用于制備轉基因抗稻瘟病植物體的應用。該基因的核苷酸序列為SEQ?IDNO：1所示。該基因來源于水稻條紋病毒，通過GenBank序列比對設計引物從我們田間采集的水稻病株上序列擴增而來。作為優選，該基因用于制備抗稻瘟病水稻。本發明具體優勢如下：(1)目前的抗稻瘟病基因多數是水稻內源基因，p3作為病毒蛋白能夠提高水稻對稻瘟病的抗性，豐富了抗稻瘟病基因資源。(2)正因為p3基因不是水稻內源抗性基因，所以它的抗性機制可能與其他抗性基因不同，有助于人們對水稻抗稻瘟菌機理和稻瘟菌致病機理的理解。
【專利說明】水稻條紋病毒P3基因用于制備轉基因抗稻瘟病植物體的應用【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】及植物病害防治領域，尤其涉及水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)P3基因在植物抗稻痕病中的應用領域。
【背景技術】
[0002]水稻條紋病毒(TPice Stripe virus, RSV)是由灰飛虱傳播的一種重要水稻病毒，由該病毒導致的水稻條紋葉枯病在我國持續發生，造成嚴重經濟損失。近年來，我國科學家針對RSV的生物學和分子生物學研究開展了一系列細致而深入的工作:測定了病毒全基因組序列、鑒定了病毒沉默抑制蛋白、運動蛋白、開展了水稻互作蛋白的分離篩選工作、建立了灰飛虱飼毒、檢測技術、綜合防治技術等工作，這些工作所取得的進展加深了人們對于RSV致病機制的了解。RSV的p3基因編碼一個沉默抑制蛋白，通過與siRNA結合起到抑制RNA沉默的作用。
[0003]稻瘟病又名稻熱病，俗稱火燒瘟、吊頭瘟、掐頸瘟等，是世界性的重要稻病，在我國它同紋枯病、白葉枯病被列為水稻三大病害，由稻梨孢菌(PyriculeirieioryzeieQiv.)引起，在世界各水稻產區都有發生，其中以亞洲和非洲稻區發病最為嚴重。稻瘟病是危害我國水稻產區的三大水稻病害之一，一般可造成產量損失10%-30%，流行時產量損失可達40%-50%。
[0004]防治稻瘟病的最經濟有效的措施是選育和種植抗病品種。傳統的防治方法是通過不斷更換農藥品種以及加大農藥使用量來防治稻瘟病，這對生態環境和人類健康產生壓力。利用植物基因工程可向現有栽培品種中導入外源基因而不受種屬限制，拓展可利用基因的來源，為作物抗病育種工作開辟了一條嶄新而有效的途徑。
【發明內容】
[0005]為了解決上述的技術問題，本發明的第一個目的是提供水稻條紋病毒{Ricestripe virus, RSV)p3基因用于制備轉基因抗稻痕病植物體的應用。本發明的第一個目的是提供一種抗稻瘟病的水稻的制備方法。
[0006]為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案:
水稻條紋病毒stripe virus, RSV)p3基因用于制備轉基因抗稻痕病植物體的應用。該基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示。該基因來源于水稻條紋病毒，通過GenBank序列比對設計引物從我們田間采集的水稻病株上序列擴增而來。作為優選，該基因用于制備抗稻瘟病水稻。
[0007]為了實現上述的第二個目的，本發明采用了以下的技術方案:
一種抗稻瘟病的水稻的制備方法，該方法采用包含水稻條紋病毒{Rice stripevirus, RSV)p3基因的宿主細胞對水稻成熟胚進行的遺傳轉化獲得。作為優選，所述的宿主細胞由包含水稻條紋病毒stripe virus, RSV)p3基因的植物表達載體轉化。作為再優選，轉化菌株為農桿菌菌株EHA105。
[0008]作為優選，所述的宿主細胞的制備方法包括以下的步驟:
(1)水稻條紋病毒P3基因的克隆及載體構建
通過GenBank中的RSV p3序列分析,設計如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴增得到水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，引物設計時已加入酶切位點，用于將p3基因重組到雙元表達載體PCV1300中；引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5’ - G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’ ； (2)轉化農桿菌
取-70 °C保存的EHA105農桿菌感受態，置冰上融解；取I μ I抽純pCV_P3_C質粒加入到100 μ I感受態中，混勻，加入到處理好的電擊杯；設置2200V電壓，電擊轉化；點擊完成加入900 μ I的液體YEP培養基，28 V，200 rpm搖床培養1.5 h，菌液涂布在含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上，28 °C培養至形成單菌落。
[0009]作為優選，所述的抗稻瘟病的水稻的制備方法包括以下的步驟:
1)菌液的準備
取-70 °C保存的包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的陽性轉化菌株，于含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上劃線，28 °C培養至形成單菌落，挑取單菌落于含50 μ g/ml KanUOO ug/ml Rif的YEP液體培養基中培養，28°C，220rpm振蕩培養24 h ;將菌液按1:100用YEP培養基稀釋，繼續震蕩培養至0D600為0.6 ;
2)水稻成熟胚愈傷組織的誘導與培養
取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子；將種子放入100 ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒lmin，無菌水洗3_5遍，直到沒有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸鈉；溶液，浸泡30min ;倒去次氯酸鈉溶液,用無菌蒸懼水清洗種子4_5遍,最后一遍浸泡30min ;種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導培養基中，每皿9-12顆；操作完畢用封口膜；封好培養皿，在28°C光照培養箱，培養3周；在超凈工作臺上打開培養皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織，置入繼代培養基中，在28°C光照培養箱，繼代培養I周；
3)愈傷組織與農桿菌的共培養
收集菌體，用含200 Mmol/L As的AAM感菌液制成懸浮液，使菌液0D600的終濃度為0.1 ;將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農桿菌懸浮液侵染5min ;將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干30-40min ;將愈傷組織置于共培養基上；26°C暗培養2.5d ；
4)抗性愈傷的篩選與分化
將愈傷組織取出，用無菌水清洗I遍，再用含500 mg/L頭孢拉定或頭孢噻肟鈉的無菌水浸泡30 min,清洗3-5遍，置于無菌濾紙上浙干2h。隨后將晾干的愈傷轉入選擇培養基上進行第一輪選擇，28°C，光照培養14d ;將長有抗性愈傷的初始愈傷進行第二輪選擇，28°C，光照培養，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；挑取顏色鮮黃的顆粒類抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養基的塑料廣口瓶中，放入恒溫培養室中，等待分化成苗；
5)生根壯苗和移載
當抗性愈傷組織分化的芽長至約2 cm時，將小苗移到生根培養基上，培養兩周；選擇高10 Cm、根系發達的小苗，洗去培養基，在溫室內移栽入土。
[0010]本發明通過設計引物克隆基因閱讀框全長，構建表達載體，通過遺傳轉化與分子技術檢測，獲取穩定遺傳的轉p3基因植株。然后對轉基因植株接種稻瘟菌，進行抗稻瘟分析，篩選抗病株系。本發明獲取的轉P3基因水稻，主要應用于抗稻瘟菌水稻育種，避免真菌病害的為害。本發明對培育高抗稻瘟病水稻具有重要的理論及實際意義，對植物病害防治其他領域也有指導作用。與通過其他抗稻瘟菌策略獲得的抗性株系相比，本發明具體優勢如下:
(I)目前的抗稻瘟病基因多數是水稻內源基因，P3作為病毒蛋白能夠提高水稻對稻瘟病的抗性，豐富了抗稻瘟病基因資源。
[0011](2)正因為p3基因不是水稻內源抗性基因，所以它的抗性機制可能與其他抗性基因不同，有助于人們對水稻抗稻瘟菌機理和稻瘟菌致病機理的理解。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1:含有p3基因的載體的構建圖譜。
[0013]圖2:轉p3基因水稻的DNA PCR檢測圖譜。
[0014]圖3:轉p3基因水稻的Northern blot檢測圖譜。
[0015]圖4:轉p3基因水稻的抗稻瘟病鑒定顯示接種后的葉片。
[0016]圖5:轉p3基因水稻的抗稻瘟病鑒定顯示接種后葉片的壞死斑數量差異。
[0017]圖6:轉p3基因水稻的抗稻瘟 病鑒定顯示接種后葉片的壞死斑大小差異。 【具體實施方式】
[0018]本發明所轉水稻品種為日本晴。
[0019]1.重組農桿菌的獲得 (I) P3克隆及載體構建
本發明通過GenBank中的RSV p3序列分析,設計如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴增得到P3基因序列，引物設計時已加入酶切位點，用于將p3基因重組到雙元表達載體PCV1300中。引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5，- G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3，。
[0020](2)轉化農桿菌
取-70 °C保存的EHA105農桿菌感受態，置冰上融解。取I μ I抽純pCV_P3_C質粒加入到100 μ I感受態中，混勻，加入到處理好的電擊杯。設置2200V電壓，電擊轉化。點擊完成加入900 μ I的液體培養基(YEP)。28 °C, 200 rpm搖床培養1.5 h，菌液涂布在含50μ g/ml卡那霉素(Kan)和100 μ g/ml利福平(Rif)平板上,28 °C培養至形成單菌落。
[0021](3)陽性克隆的鑒定與保存
挑取轉化的農桿菌單菌落接種于含50 μ g/ml KanUOO μ g/ml Rif的液體培養基中，28 °C, 200 rpm搖培16 h，取I μ I菌液進行PCR檢測。檢測引物為Ρ3 (+)、Ρ3㈠。取檢測結果為陽性的菌液，混合15-30%甘油，置甘油管中，于_70°C超低溫冰箱中保存，備用。
[0022]PCR體系如下:
【權利要求】
1.水稻條紋病毒{Ricestripe virus, RSV)p3基因用于制備轉基因抗稻痕病植物體的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:該基因用于制備抗稻瘟病水稻。
3.一種抗稻瘟病的水稻的制備方法，其特征在于:該方法采用包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的宿主細胞對水稻成熟胚進行的遺傳轉化獲得。
4.根據權利要求3所述的一種抗稻瘟病的水稻的制備方法，其特征在于:所述的宿主細胞由包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的植物表達載體轉化。
5.根據權利要求4所述的一種抗稻瘟病的水稻的制備方法，其特征在于:轉化菌株為農桿菌菌株EHA105。
6.根據權利要求4所述的一種抗稻瘟病的水稻的制備方法，其特征在于:所用載體為PCV1300。
7.根據權利要求5所述的一種抗稻瘟病的水稻的制備方法，其特征在于宿主細胞的制備方法包括以下的步驟: (1)水稻條紋病毒P3基因的克隆及載體構建 通過GenBank中的RSV p3序列分析,設計如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴增得到水稻條紋病毒(/Pice stripe virus, RSV)p3基因，引物設計時已加入酶切位點，用于將P3基因重組到雙元表達載體PCV1300中；引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5’ - G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’ ； (2)轉化農桿菌 取-70 °C保存的EHA105農桿菌感受態，置冰上融解；取I μ I抽純pCV_P3_C質粒加入到100 μ I感受態中，混勻，加入到處理好的電擊杯；設置2200V電壓，電擊轉化；點擊完成加入900 μ I的液體YEP培養基，28 0C, 200 rpm搖床培養1.5 h，菌液涂布在含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上，28 °C培養至形成單菌落。
8.根據權利要求3或5或7所述的一種抗稻瘟病的水稻的制備方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: 1)菌液的準備 取-70 °C保存的包含水稻條紋病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的陽性轉化菌株，于含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上劃線，28 °C培養至形成單菌落，挑取單菌落于含50 μ g/ml KanUOO ug/ml Rif的YEP液體培養基中培養，28°C，220rpm振蕩培養24 h ;將菌液按1:100用YEP培養基稀釋，繼續震蕩培養至OD_為0.6 ; 2)水稻成熟胚愈傷組織的誘導與培養 取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子；將種子放入100 ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒lmin，無菌水洗3_5遍，直到沒有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸鈉；溶液，浸泡30min ;倒去次氯酸鈉溶液,用無菌蒸懼水清洗種子4_5遍,最后一遍浸泡30min ;種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導培養基中，每皿9-12顆；操作完畢用封口膜；封好培養皿，在28°C光照培養箱，培養3周；在超凈工作臺上打開培養皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織，置入繼代培養基中，在28°C光照培養箱，繼代培養I周； 3)愈傷組織與農桿菌的共培養收集菌體，用含200 Mmol/L As的AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD6c?的終濃度為0.1 ；將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農桿菌懸浮液侵染5min ;將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干30-40min ;將愈傷組織置于共培養基上；26°C暗培養2.5d ； 4)抗性愈傷的篩選與分化 將愈傷組織取出，用無菌水清洗I遍，再用含500 mg/L頭孢拉定或頭孢噻肟鈉的無菌水浸泡30 min，清洗3-5遍，置于無菌濾紙上浙干2h ； 隨后將晾干的愈傷轉入選擇培養基上進行第一輪選擇，28°C,光照培養14d ;將長有抗性愈傷的初始愈傷進行第二輪選擇，28°C，光照培養，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；挑取顏色鮮黃的顆粒類抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養基的塑料廣口瓶中，放入恒溫培養室中，等待分化成苗； 5)生根壯苗和移載 當抗性愈傷組織分化的芽長至約 2 cm時，將小苗移到生根培養基上，培養兩周；選擇高10 cm、根系發達的小苗，洗去培養基，在溫室內移栽入土。
【文檔編號】A01H5/00GK103497971SQ201310469665
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】燕飛, 吳根土, 王教瑜, 王艷麗, 孫國昌, 陳劍平 申請人:浙江省農業科學院