專利名稱：一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白a親和配基及其構建方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基及其構建方法。
背景技術：
金黃色葡萄球菌蛋白A簡稱蛋白A，是金黃色葡萄球菌表面的一種蛋白質，通過共價鍵連接到胞壁肽聚糖。蛋白A分子中存在五個同源性很高的E、D、A、B、C序列，由于能和人及多種哺乳動物IgG的Fe段結合，因此稱之為抗體結合區。蛋白A與抗體的Fe段結合并不影響抗體對抗原的吸附活性，因此被廣泛應用于抗體的親和純化。由于B結構域對抗體的結合力最穩定，而且本身結構也最穩定，因此人們對B序列的研究最多。B序列由3個α螺旋和連接螺旋片段的兩個Loop組成，按照從N端到C端的順序依次是Helixl-Loopl-Helix2-Loop2-Helix3。以蛋白A為親和配基吸附IgG時結合力很強，需要使用較低pH洗脫液(pH3.0左右)，往往會影響IgG的活性。蛋白A親和層析柱在使用過程中會在柱內殘留核苷酸、變性蛋白質、脂類和微生物 等雜質，需要使用在位清洗進行清除，其中NaOH是工業生產中較為廉價和常用的清洗液。天然蛋白A雖然對堿性環境有著較好的耐受性，但是仍然不能滿足長期使用強堿對其進行清洗。盡管天然蛋白A抗體結合區的E、D、A、B、C五個結構域彼此之間有很高的同源性，但是它們對IgG的結合能力存在差異，導致最適洗脫條件不一樣。因此，本發明針對以上幾點，選取B結構域對天然蛋白A進行分子改造。利用分子生物學方法從核苷酸序列上進行改造和連接，利用大腸桿菌高效表達系統實現高效表達，得到一系列個改造序列串聯組成而且C端添加一個半胱氨酸的重組蛋白A，將得到的重組蛋白A作為親和配基制備親和層析填料，用于抗體的分離純化，具備較溫和洗脫性能和較高的耐堿性能。
發明內容
本發明的目的是提供一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基，用于抗體制備的親和層析填料，具有較好的洗脫性能和耐堿性能。所述的重組蛋白A親和配基由I到10個Z序列串聯構成的一系列蛋白質。Z序列是B序列經過改造后的產物，與B序列的區別在于在Loop2與Helix3之間添加6個甘氨酸，并將第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分別替換成蘇氨酸和丙氨酸，為了實現蛋白A與填料基質更穩定的連接，在B蛋白序列的C端添加了 2個半胱氨酸，從而實現與基質實現雙位點連接。將表達Z序列的基因命名為z，利用同尾酶將I到10個不同數量的z串聯，所表達的重組蛋白A中每兩個Z序列均由兩個絲氨酸相連接。所述的性能改進的重組蛋白A親和配基的構建方法的步驟為:(I)引物設計
本發明對蛋白A的B片段進行分子改造，根據重疊PCR和同尾酶連接原理設計引物，將改造后的B片段命名為Z，改造內容為Z (6G)的改造、Z(N23T，F30A)的改造、C端半胱氨酸的添加和I到10個z核苷酸序列的拼接，其中Z (6G)的改造是在B序列第二個Loop后面添加6個甘氨酸增加Loop2長度，從而降低其與抗體的結合力強度，使洗脫更容易進行，Z(N23T，F30A)的改造是對B序列的第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸進行定點突變，分別替換為蘇氨酸和丙氨酸，減少B序列的脫酰胺作用，增強對高濃度堿液的耐受性能，C端半胱氨酸的添加是在B序列的C端添加3個半胱氨酸，以實現重組蛋白A親和配基與瓊脂糖填料基質實現雙位點連接，在引物中添加Nhe 1、Xba 1、Noc I和BamH I四個酶切位點，利用同尾酶作用原理將不同個數的z核苷酸序列首尾相連，組成含有不同個數z序列串聯的重組蛋白A表達基因；(2)重組菌的構建本發明根據步驟(I)所設計的引物，以金黃色葡萄球菌基因組為模板進行重疊PCR,獲得所需的目的核苷酸序列z，利用T載體pMD18-T構建重組質粒pMD18_T-Zl，轉化感受態E.coli JM109進行甘油凍管保 藏，以此為基礎進行不同個數z序列(Zn)的構建，然后利用Noc I和BamH I兩個酶切位點將構建好的2 序列與表達質粒pET_28a進行酶切連接，得到重組表達質粒pET-28a-zn，最后轉化感受態E.coli BL21 (DE3)，得到重組蛋白A的表達菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-zn，制備甘油凍管保藏備用；(3)重組蛋白A的表達本發明利用IPTG對步驟(2)所構建的重組菌E.coli BL21 (DE3)/pET-28a_zn進行誘導表達，獲得具有1-10個Z片段串聯的重組蛋白A，Wzn表示η (η為1_10)個Z片段串聯的重組蛋白Α。本發明利用分子生物學方法對天然蛋白A的B序列進行分子改造，首次對蛋白A的B序列同時進行洗脫性能和耐堿性能的改造，以及實現將改造后的I到10個ζ緊密串聯，構建重組表達質粒pET-28a-zn并轉化感受態E.coli BL21 (DE3)進行表達。利用本發明表達的重組蛋白A作為親和配基制備親和層析填料對抗體具有較好的結合能力、洗脫性能和耐堿性能:使用PH4.0,5.0和6.0的洗脫液分別可以實現97.7%、89.4%和67.5 %的洗脫率；使用2.0moI/L的NaOH溶液浸泡7h和14h，牛初乳IgG結合率分別為86.1 %和72.8%。本發明的關鍵在于:對B序列進行洗脫性能改造，在B序列Loop2和Helix3之間添加6個甘氨酸，使洗脫條件更加溫和；對B序列耐堿性能改造，利用重疊PCR技術將第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分別替換為蘇氨酸和丙氨酸，減少脫酰胺作用，增強序列對高濃度堿溶液的耐受性能；利用同尾酶作用原理，將不同個數ζ序列進行串聯，經過轉化和誘導表達得到一系列包含不同個數Z片段的重組蛋白A。
圖1是本發明一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A表達的SDS-PAGE驗證圖。I, marker ；2, E.coli BL21 (DE3)/pET28a_z5 ;3, E.coli BL21 (DE3)/pET28a。圖2是本發明制備的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和層析填料純化牛初乳IgG的過程圖。
圖3是本發明制備的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和層析填料純化牛初乳IgG的SDS-PAGE驗證圖。I，marker ； 2，洗脫液；3，穿透液；4，粗樣品IgG。圖4是本發明制備的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基的洗脫性能分析。圖5是本發明制備的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基的耐堿性能分析。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步描述:(I)引物設計實施例1使用重疊PCR技術對蛋白A的B片段進行改造，并將改造后的B片段命名為Z片段，其表達基因為ζ。根據GeneBank提供的基因序列，利用分子生物軟件DNAMAN設計ζ序列的正向引物Ftl和反向引物Rci:F0 -.CCATGGCTAGCO CGGATAACAAATTCAACR0: GGATCC TTAGCAACA TCTAGA TTTTGGTGCTTGTGC。正向引物和反向引物分別引入Noc I和BamH I酶切位點，其中斜體部分為酶切位點，下劃線部分為添加的兩個半胱氨酸的密碼子。在B片段第二個Loop后面添加6個甘氨酸，降低蛋白A與IgG的結合力強度，表示為Z(6G);為了增加蛋白 A的耐堿性能，將第23位的天冬酰胺和第30位的苯丙氨酸分別替換成蘇氨酸和丙氨酸，用Z(N23T，F30A)表示。根據GeneBank提供的基因序列設計 z 基因序列:CCATGGCTAGO GCGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAACCGAAGAACAACGCAATGGTGCCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAGGTGGCGGAGGGGGCGGTAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAAGCACCAAAA TCTAGATGTTGCTAA.GG^rCC其中下劃線標記的是基因改造部分，斜體標記部分是酶切位點，在ζ前端添加Nhe I和Noc I兩個酶切位點，后端添加XbaI和BamH I兩個酶切位點。根據重疊PCR原理，利用分子生物軟件DNAMAN設計兩對引物:F1:ATGACCCAAGCCAAGGTGGCGGAGGGGGCGGTAGCGCTAACCTTTTAR1:TAAAAGGTTAGCGCTACCGCCCCCTCCGCCACCTTGGCTTGGGTCF2:ACTTAACCGAAGAACAACGCAATGGTGCCATCCAAAGCTTAAR2:TTGGATGGCACCATTGCGTTGTTCTTCGGTTAAGT其中FjP R1分別是Z (6G)的正、反向引物，F2和R2分別是Z(N23T，F30A)的正、反向引物。將所設計的引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(2)重組載體pMD18-T-Zl的構建實施例2提取金黃色葡萄球菌DNA，利用實施例1設計的FpRci為引物，金黃色葡萄球菌DNA為模板，利用Pfu DNA聚合酶對B序列進行PCR。按照Pfu DNA聚合酶說明書，選擇50 μ L進行。PCR反應條件:預變性94°C反應5min ;變性94 °C反應40s，退火溫度56 °C反應lmin30s，延伸溫度72°C延伸30s，進行30個循環；最后72°C保持lOmin。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收B片段。使用重疊PCR的方法，利用Pfu DNA高保真聚合酶，以回收到的B片段為模板，分別以實施例1設計的Ftl和R1A1和Rtl為引物進行PCR，反應體系和條件同上。將PCR回收產物按照體積比1:1混合，將該混合物作為模板，以Ftl和Rtl為模板進行PCR，反應體系和條件同上，瓊脂糖凝膠回收增加6個甘氨酸密碼子的序列。再以相同的方法和體系對耐堿性進行突變，分別以實施例1設計的Ftl和R2、F2和Rtl以及Ftl和Rtl為引物，以得到的改造后的序列為模板進行重疊PCR，膠回收得到ζ序列。以F0和Rtl為引物、ζ序列為模板，利用Ex-Taq DNA聚合酶進行PCR，反應體系和條件同上，得到兩端各帶有一個腺嘌呤的ζ序列，利用堿基互補配對原則將ζ序列連接到T載體pMDlS-T上，得到重組質粒PMDlS-T-Z115將重組質粒轉化感受態E.coli JM109,得到重組菌E.coliJM109/pMD18-T-Zl進行甘油凍管保藏備用。(3)重組載體pET-28a_zn的構建實施例3Zn表示η (η為1_10)個ζ序列首尾相連。以Nhe I和BamHI作為第一組限制內切酶，Xba I和BamH I作為第二組限制內切酶。過夜培養實施例2得到的重組菌E.coliJM109/pMD18-T-z1；質粒提取pMD18_T-Zl，用兩組酶分別對重組質粒pMD18-T-Zl進行酶切反應。膠回收兩組酶切產物，利用T4DNA連接酶將兩組產物于16°C過夜連接，得到含有兩個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z2，將pMD18-T-z2的轉化到感受態E.coli JM109進行保存。實施例4過夜培養實施例3得到的重組菌E.coli JM109/pMD18-T-z2,提取質粒pMD18-T-z2，利用實施例3的第二組限制性內切酶對？1 18-1'-21進行酶切，第一組限制性內切酶對PMDlS-T-Z2進行酶切，將兩組所得的酶切產物回收后進行連接得到含有3個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z3，轉化感受態E.coli JM109進行保存。根據相同的方法，利用實施例3提到的兩組酶分別對PMDlS-T-Z2進行酶切，將兩組所得的酶切產物進行連接，可得到含有4個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z4,轉化感受態E.coli JM109進行保存；利用實施例3的一組酶對？1 18-1'-22進行酶切，另一組酶對？1 18-1'-23進行酶切，將兩組所得的酶切產物進行連接，可得到含有5個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z5，轉化感受態E.coli JM109進行保存；利用實施例3提到的兩組酶分別對pMD18-T-z3進行酶切，將兩組所得的酶切產物進行連接，可得到含有6個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z6，轉化感受態E.coli JM109進行保存；利用實施例3的一組酶對pMD18-T-z3進行酶切，另一組酶對PMDlS-T-Z4進行酶切，將兩組所得的酶切產物進行連接，可得到含有7個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z7，轉化感受態E.coli JM109進行保存；利用實施例3提到的兩組酶分別對PMDlS-T-Z4進行酶切，將兩組所得的酶切產物進行連接，可得到含有8個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z8，轉化感受態E.coli JM109進行保存；利用實施例3的一組酶對pMD18-T-z4進行酶切，另一組酶對pMD18-T-z5進行酶切，將兩組所得的酶切產物進行連接，可得到含有9個ζ序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z9，轉化感受態E.coli JM109進行保存；利用實施例3提到的兩組酶分別對PMDlS-T-Z5進行酶切，將兩組所得的酶切產物進行連接，可得到含有10個Z序列首尾相連的重組質粒pMD18-T-z1(l,轉化感受態E.coliJM109進行保存。 實施例5
過夜培養實驗室保藏菌株E.coli JM109/pET-28a和實施例4所得10株重組菌E.coli JM109/PMD18-T-ZU，提取質粒，利用限制性內切酶Noc I和BamH I對質粒pET_28a和pMD18-T-Zl,進行酶切，將酶切產物膠回收后進行連接既得重組質粒pET-28a-Zl_1(l，轉化感受態E.coli BL21(DE3)，得到10株表達不同片段長度重組蛋白A的基因工程菌E./oliBL21 (DE3)/ρΕΤ-28&-Ζι_1(ι，甘油凍管保藏。實施例6用烯丙基縮水甘油醚和NHS對Sepharose4FF進行活化和修飾,保藏備用。將實施例5所得重組菌E.coli BL21 (DE3)/pET-28a_z5過夜培養后進行超聲破碎，利用IgG親和層析填料純化所表達的Z5蛋白片段，將純化產物進行冷凍干燥備用。將制備的Z5蛋白片段配成適當濃度溶液，偶聯到經修飾的Sepharose4FF制備重組蛋白A親和層析填料。實施例7 基于AKTA purifier層析系統,將實施例6制備的重組蛋白A親和層析填料裝柱進行性能測試。配制不同PH的0.lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液作為洗脫液，檢測填料的洗脫性能。使用ρΗ4.0,5.0和6.0的洗脫液進行洗脫，分別實現了 97.7%,89.4%和67.5%的洗脫率。使用2.0mol/L的NaOH溶液浸泡7h和14h后，本發明重組蛋白A制備的親和填料對IgG的結合率分別為86.1 %和72.8%。
權利要求
1.一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A，其特征在于重組蛋白A分子結構由I到10個Z片段串聯組成。
2.根據權利要求1所述的一種性能改造的重組金黃色葡萄球菌蛋白A，其特征在于編碼Z片段的基因具有序列表SEQ ID.3所述的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的一種性能改造的重組金黃色葡萄球菌蛋白A，其特征在于Z片段的氨基酸殘基具有序列表SEQ ID N0.8所述的氨基酸序列。
4.根據權利要求1所屬的一種性能改造的重組蛋白A，其特征在于Z序列是由B序列改造得到的，是在B片段的Loop2后面添加6個甘氨酸，并將第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分別替換成蘇氨酸和丙氨酸，在Z序列的C端添加有2個半胱氨酸。
5.根據權利要求1所述的一種性能改造的重組蛋白A，其特征在于I到10個Z片段串聯后具有序列表SEQ ID N0.8-17所述的氨基酸序列。
6.—種如權利要求1所述的性能改造的重組蛋白A的構建方法，其特征在于克隆并改造Z基因序列的3對引物F0和R0J1和R1J2和R2，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0.USEQID N0.2,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，利用重疊 PCR 得到 Z 序列，使用一組同尾酶和限制性內切酶BamH I將I到10個Z序列進行串聯得到Zn序列，利用一組限制性內切酶將2 連接到質粒pET-28a，轉化感受態E.coli BL21(DE3)得到產不同個數Z序列串聯的重組蛋白A菌株，通過一定終濃度的IPTG誘導獲得由1-10個Z片段組成的重組金黃色葡萄球菌蛋白A。
7.根據權利要求6所述的一組同尾酶，其 特征在于是NheI和Xba I。
8.根據權利要求6所述的一組限制性內切酶，其特征在于是NocI和BamH I。
全文摘要
本發明公開了一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基及其構建方法。本發明利用分子生物學方法，選取天然蛋白A的B序列進行分子改造，在B序列的C端添加2個半胱氨酸，從而可以將蛋白A通過雙位點偶聯的層析基質，使連接更加穩定，在B序列第二個Loop后面添加了6個甘氨酸增加其長度，降低與抗體之間的結合力，從而使洗脫條件更加溫和。在此基礎上對蛋白A耐高濃度堿的性能進行改造，將B序列第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分別替換成蘇氨酸和丙氨酸，得到耐堿性能更高的Z序列。然后，利用同尾酶將不同數量的Z序列首尾串聯，并利用大腸桿菌的高效表達系統進行過量表達。將表達的重組蛋白A偶聯到瓊脂糖基質制備親和層析填料，并用于純化抗體，結果表明本發明制備的重組蛋白A親和配基具有較好的洗脫性能和耐堿性能。
文檔編號C12R1/445GK103214563SQ20131009755
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月26日 優先權日2013年3月26日
發明者夏海鋒, 吳璞強, 梁振東, 王沙莉, 鄭夢杰 申請人:江南大學