雜交酶的制作方法

專利名稱：雜交酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及至少一種碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding module,〃CBM〃)和至少葡糖淀粉酶的催化模塊(catalytic module, CM)的雜交體及其它。本發明也涉及雜交酶在淀粉處理中的用途，在此處理中，顆粒淀粉降解為糖，例如，漿液(slurry)、或者可以用作產生發酵產物，尤其是乙醇所用的酵母的營養。相關現有技術描述已經描述了大量的將淀粉轉化為淀粉水解產物，如麥芽糖、葡萄糖或特制漿液以用作甜味劑或作為其它糖類如果糖的前體的方法。葡萄糖也可發酵為乙醇或其它的發酵產物。淀粉是由葡萄糖單位的鏈所組成的高分子量多聚體。其通常由約80%的支鏈淀粉和20%直鏈淀粉組成。支鏈淀粉為支鏈多糖，其中a-1，4D_葡萄糖殘基的線性鏈通過a-1，6糖苷鍵連接起來。直鏈淀粉是由D-吡喃葡萄糖單位通過a-1，4糖苷鍵連接在一起而構成的線性多糖。在將淀粉轉化為可溶性淀粉水解產物的例子中，所述淀粉被解聚化。傳統的解聚方法由糊化步驟(gelatinization step)和兩個連續的處理步驟即液化處理和糖化處理所組成。顆粒淀粉由顯微鏡下可見的顆粒組成，其在室溫下不溶于水。水性淀粉漿液加熱時，顆粒膨脹并最終破裂，將淀粉分子分散到溶液中。在此“糊化”處理期間粘性急劇增加。由于典型工業處理中固體水平為30-40%，淀粉必須稀釋或“液化”以使之能夠處理。目前粘性的降低主要通過酶學降解獲得。在液化步驟期間，長鏈淀粉被a-淀粉酶降解為更小的支鏈和線性單位(麥芽糊精)。通常，液化處理在約105-110°C實施約5到10分鐘，接下來約95°C實施約1-2小時。然后將溫度降至60°C，加入葡糖淀粉酶或￠-淀粉酶和可選的脫支酶如異淀粉酶或支鏈淀粉酶(pullulanase),糖化處理進行約24至72小時。傳統的淀粉轉化處理是非常耗能的，因為許多步驟中在溫度方面有不同的需求。因此需要能夠選擇和/或設計此處理中所使用的酶以使整個過程能夠在無需糊化淀粉的情況下進行。發明概述第一個方面本發明提供了包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模塊的氨基酸序列和碳水化合物結合模塊的氨基酸序列的雜交酶。優選催化模塊可以是真菌、細菌、或植物起源的。更多方面，本發明提供編碼第一方面所述雜交酶的分離的DNA序列，包含編碼第一方面所述雜交酶的DNA序列的DNA構建體，包含編碼第一方面所述雜交酶的DNA序列的表達載體，用載體轉化的宿主細胞，其中宿主細胞能夠表達編碼第一方面所述雜交酶的DNA序列。最后一方面，本發明提供由顆粒淀粉產生漿液或發酵產物的方法，包括用水性介質中的a -淀粉酶和本發明具有葡糖淀粉酶活性的雜交酶處理天然淀粉(raw starch)。當需要發酵產物時，所述方法包括發酵生物的存在。具體地，本發明涉及如下各項:1.雜交酶，包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模塊的氨基酸序列和碳水化合物結合模塊的氨基酸序列。2.項I的雜交酶，其中碳水化合物結合模塊的氨基酸序列是真菌起源的，優選源于曲霉、阿太菌或踝節菌。3.項2的雜交酶，其中碳水化合物結合模塊的氨基酸序列源于川地曲霉，例如具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的CBM，或者碳水化合物結合模塊(CBM)的氨基酸序列源于黑曲霉，優選具有SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列的CBM，或者碳水化合物結合模塊(CBM)的氨基酸序列源于阿太菌，優選源于羅耳阿太菌，尤其是SEQ ID NO: 28所示的CBM氨基酸序列。4.項1-3任一項的雜交酶，其中所述催化模塊是真菌起源的葡糖淀粉酶，優選源于曲霉菌株，優選源于黑曲霉或米曲霉菌株；尤其是SEQ ID NO: 24所示的序列；阿太菌，優選羅耳阿太菌；尤其是SEQ ID NO:26所示的序列；踝節菌，優選埃默森踝節菌，尤其是SEQID NO:25所示的序列。5.編碼項1-4任一項的雜交酶的DNA序列。6.包含項5所述DNA序列的DNA構建體。7.包含項5所述DNA序列的表達載體。8.用項7的載體轉化的宿主細胞，所述宿主細胞能夠表達項5的DNA序列。9.產生漿液的方法，包括用項1-4任一項的雜交酶在水介質中處理顆粒淀粉。10.項9的方法，其中所述顆粒淀粉進一步用a _淀粉酶處理。11.項10的方法，其中所述a -淀粉酶是酸性a -淀粉酶，優選源于真菌，優選源于曲霉屬，尤其源于黑曲霉或米曲霉。12.項9-11任一項的方法，其中所述漿液是葡萄糖或麥芽糖。13.產生發酵產物的方法，包括在發酵生物存在時，用項1-4任一項的雜交酶在水介質中處理顆粒淀粉。14.項13的方法，其中所述顆粒淀粉進一步用a _淀粉酶處理。15.項14的方法，其中所述a -淀粉酶是酸性a -淀粉酶，優選源于真菌，優選源于曲霉屬，尤其源于黑曲霉或米曲霉。16.項13的方法，其中所述發酵生物是酵母，優選糖酵母，尤其是啤酒糖酵母。17.項13-16任一項的方法，其中所述發酵產物是乙醇，例如燃料乙醇或飲用乙醇。18.項1-4任一項的雜交酶用于產生發酵產物或漿液的用途。19.項18的用途， 用于產生乙醇。
20.項1-4任一項的雜交酶在項9-17任一項的方法中的用途。附圖簡述

圖1比較了包含埃默森踝節菌(Talaromyces emersonii)催化結構域和黑曲霉(A.niger) SBM的兩個葡糖淀粉酶-SBM (淀粉結合模塊)雜交體(TEAN-1和TEAN-3)與野生型埃默森踝節菌葡糖淀粉酶的每g DS的乙醇產量。發明詳述術語“顆粒淀粉(granular starch) ”理解為天然(raw)的未煮過的淀粉，即未被糊化的淀粉。淀粉作為不溶于水的微小顆粒在植物中形成。這些顆粒在低于起始糊化溫度的溫度中儲存在淀粉中。當置于冷水中時，谷物可以吸收少量的液體。達到50°C至70°C時膨脹是可逆的，可逆程度依賴于具體淀粉。當溫度更高時，稱為糊化作用的不可逆膨脹開始。術語“起始糊化溫度”理解為淀粉糊化作用開始時的最低溫度。在水中加熱的淀粉在50°C和75°C之間開始糊化；糊化的確切溫度依賴于具體淀粉，熟練技術人員可以很容易地測定。因此，根據植物種類、植物種類的具體品種以及生長條件，起始糊化溫度可以不同。在本發明的上下文中，給定淀粉的起始糊化溫度為使用Gorinstein.S.和Li1.c.，Starch/Starke，Vol.44 (12) pp.461-466(1992)所描述的方法測定時，5%的淀粉顆粒中雙折射(birefringence)消失時的溫度。術語“可溶性淀粉水解產物”理解為本發明方法的可溶性產物，可以包含單糖、二糖、和寡糖，例如葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精、環糊精及其任何混合物。優選至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97%，98%或至少99%的顆粒淀粉的干燥固體轉化為可溶性淀粉水解產物。術語多肽“同源性”理解為兩條序列之間的一致性程度，其表明第一條序列與第二條序列的衍生關系。可以使用本領域已知的電腦方法如GCG方法包中提供的GAP (ProgramManual for the Wisconsin Package,Version8,Augustl994,Genetics ComputerGroup,575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711)(Needleman, S.B.和 Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48，443-453)測定同源性。使用以下的氨基酸序列比對設置:GAP產生罰分為3.0，GAP延伸罰分為0.1。雜交酶本說明書及權利要求中的酶分類號(EC編號)與生物化學與分子生物學國際聯合會的命名委員會，Academic Press Inc.，1992所推薦(1992)的一致。此處所稱雜交酶包括包含葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)的氨基酸序列且其連接(即共價結合)至包含碳水化合物結合模塊(CBM)的氨基酸序列的那些。術語“碳水化合物結合模塊(CBM) ”也可稱“碳水化合物結合結構域(CBD) ”。含CBM的雜交酶，及其制備和純化的詳述描述是本領域已知的[參見，例如 TO90/00609，W094/24158 和 W095/16782，以及 Greenwood 等，Biotechnology andBioengineering44 (1994) pp.1295-1305]。其可以通過例如將DNA構建體轉化到宿主細胞中并培養該轉化的宿主細胞以表達融合基因來制備，所述DNA構建體包含至少一個編碼碳水化合物結合模塊的DNA片段，該DNA片段通過或不通過接頭連接至編碼目標葡糖淀粉酶的DNA序列，此DNA序列具有或不具有其自身的天然碳水化合物結合模塊。所得的重組產物(雜交酶)-本領域通常稱為“融合蛋白”-可以用下述的通式描述:A-CBM-MR-X在后者的通式中，A-CBM為至少包含碳水化合物結合模塊(CBM)本身的氨基酸序列的N端或C端區域。MR為中間區域(“接頭”)，X為由編碼CBM所連接的酶(或其它蛋白)的DNA序列所編碼的多肽的氨基酸殘基序列。A部分可以不存在(這樣A-CBM為CBM本身，即不包含除構成CBM的氨基酸殘基之外的其它氨基酸殘基)，或者可以為具有一個或多個氨基酸殘基的序列(作為CBM本身的末端延伸體而發揮功能)。接頭(MR)可以不存在，或者是鍵，或者為包含約2至約100個碳原子，特別地2至40個碳原子的短的連接基團。然而，MR優選為約2至約100個氨基酸殘基的序列，更優選2至40個氨基酸殘基，例如2至15個氨基酸殘基。X部分可以構成整個雜交酶的N端或C端區域。這樣，由以上所述很明顯所討論的雜交酶類型中的CBM可以位于雜交酶的C端、N端或內部。在CBM位于內部的實施方案中，CBM可以通過兩個接頭連接。應了解，本發明的雜交酶可以具有一個以上CBM，例如兩個或三個CBM。本發明涉及加入一個以上CBM的實施方案:例如，N或C端具有兩個或多個CBD的串聯構建體，具有N端+C端CBM的構建體。因此，本發明雜交體的例子也包括下述通式的雜交體:A-CBM1-MR1-X-MR 2-CBM2-BA-CBM1-MR1-B-CBM2-MR2-XA-CBM1-MR1-CBM2-X-MR3-CBM3-CCBMl和CBM2可以不同或相同。B和C可以不存在(這樣，例如，B-CBM2為CBM2本身，即不包含除構成CBM2的氨基酸殘基之外的其它氨基酸殘基)，或者可以(如A)為具有一個或多個氨基酸殘基的序列(作為CBM2本身的末端延伸體而發揮功能)。接頭可以不存在也可以存在。接頭序列接頭序列可以為任何適合的接頭序列。在優選實施方案中，接頭序列衍生于羅耳阿太菌(Athelia rolfsii)葡糖淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、埃默森踝節菌葡糖淀粉酶、或川地曲霉(A.kawachii) a -淀粉酶。這樣的接頭序列的具體例子包括:-黑曲霉AMG接頭:TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA(SEQ ID NO:20)，-川地曲霉a-淀粉酶接頭:TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS(SEQ ID NO:21)，-羅耳阿太菌AMG接頭:STGATSPGGSSGS(SEQ ID NO:27)，PEPT 接頭:PEPTPEPT(SEQ ID NO:22)。所述接頭也可以是上述接頭的片段。在另一優選實施方案中,所述雜交酶具有在不超過10個位置、不超過9個位置、不超過8個位置、不超過7個位置、不超過6個位置、不超過5個位置、不超過4個位置、不超過3個位置、不超過2個位置、或者甚至不超過I個位置不同于SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的接頭序列。碳水化合物結合模塊(CBM)碳水化合物結合模塊(CBM)為優先結合于多糖或寡糖(碳水化合物)的多肽氨基酸序列，經常-但不一定僅僅-結合于其水不溶性(包括晶體)形式。衍生于淀粉降解酶的CBM通常稱為淀粉結合模塊或SBM(可見于一些水解淀粉的酶的CBM,例如一些葡糖淀粉酶、或見于例如環糊精糖基轉移酶(glucanotransferase)、或見于a-淀粉酶)。同樣，其它的CBM亞類將包含例如，纖維素結合模塊(源于水解纖維素的酶的CBM)、幾丁質結合 模塊(通常見于幾丁質酶的CBM)、木聚糖結合模塊(通常見于木聚糖酶的CBM)、甘露聚糖結合模塊(通常見于甘露聚糖酶的CBM)。SBM通常也稱為SBD (淀粉結合結構域)。可以發現CBM為由兩個或多個多肽氨基酸序列區域組成的大型多肽或蛋白質的內在部分(integral parts)，尤其是在水解性酶(水解酶)中，這樣的酶通常包含催化模塊，其中含有底物水解活性位點和結合目標碳水化合物底物的碳水化合物結合模塊(CBM)。這樣的酶可以包含不止一個催化模塊，例如一個、兩個或三個CBM，可選地進一步包含與具有催化模塊的CBM連接的一個或多個多肽氨基酸序列區域，后一類型的區域通常稱為“接頭”。包含CBM的水解性酶的例子-其中一些在上面已經提到-為纖維素酶、a-淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和幾丁質酶。CBM也已發現以非水解多糖結合蛋白的形式存在于藻類例如紅藻Porphyra purpurea中。在有CBM的蛋白質/多肽中(例如，酶、通常水解性酶)，CBM可以位于N或C端或位于內部位置。構成CBM本身的多肽或蛋白質(例如，水解性酶)部分通常由約30個以上但少于約250個氨基酸殘基組成。“碳水化合物結合模塊家族20”或CBM-20模塊在本發明上下文中定義為與 Joergensen 等(1997)在 Biotechnol.Lett.19:1027-1031 圖1 的多妝的碳水化合物結合模塊(CBM)具有至少45%同源性的大約100個氨基酸的序列。所述CBM包含所述多肽的至少102個氨基酸，即從氨基酸582至氨基酸683的子序列。本說明書中應用的糖苷水解酶家族的編號遵循URL: afmb.cnrs-mrs.fr/ cazy/CAZY/index.html 上 Coutinho, P.M.&Henrissat,B.(1999)CAZy-Carbohydrate-ActiveEnzymes server 或 Coutinho, P.M.&Henrissat, B.1999 ；The modular structure ofcellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated databaseapproach.1n〃Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation".，K.0hmiya, K.Hayashi, K.Sakka, Y.Kobayashi, S.Karita 和 T.Kimura 編,Uni PublishersC0., Tokyo,pp.15-23, 和 Bourne, Y.&Henrissat, B.2001;Glycoside hydrolases andglycosyItransferases:families and functional modules,Current Opinion inStructural Biologyll: 593-600 的概念。包含適合用于本發明上下文中的CBM的酶的例子為a -淀粉酶、產麥芽糖a _淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和幾丁質酶。與本發明有關的更多的目標CBM包括衍生于葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)或CGT酶(EC2.4.1.19)的CBM。衍生于真菌、細菌或植物來源的CBM—般會適合用于本發明上下文中。優選的為源于曲霉(Aspergillus sp.)、阿太菌(Athelia sp.)、踩節菌(Talaromyces sp.)、芽抱桿菌(Bacillus sp.)、克雷伯桿菌(Klebsiella sp.)、或根霉(Rhizopus sp.)物種的 CBM。優選的為真菌來源的CBM。就此而論，適合于分離相關基因的技術是本領域所熟知的。本發明優選的為碳水化合物結合模塊家族20的CBM。“碳水化合物結合模塊家族20”或CBM-20模塊在本發明上下文中定義為與Joergensen等(1997)在Biotechnol.Lett.19:1027-1031圖1的多肽的碳水化合物結合模塊(CBM)具有至少45%同源性的大約100個氨基酸的序列。所述CBM包含所述多肽的最后102個氨基酸，即從氨基酸582至氨基酸683的子序列。本說明書中應用的CMB編號遵循Coutinho&Henrissatl999 的概念(Coutinho, P.M.&Henrissat, B.The modular structureof cellulases and other carbohydrate-active enzymes:an integrated databaseapproach.1n〃Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation".，K.0hmiya, K.Hayashi, K.Sakka, Y.Kobayashi, S.Karita 和 T.Kimura 編,Uni PublishersC0., Tokyo,pp.15-23or alternatively:Coutinho, P.M.&Henrissat, B.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes server at URL:afmb.cnrs~mrs.fr/ cazy/CAZY/index.html)。適合于本發明的碳水化合物結合模塊家族20的CBM可以衍生自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(SWISSPROT Q12537)、川地曲霉(SffISSPROT P23176)、黑曲霉(SWISSPR0T P04064)、米曲霉(Aspergillus oryzae) (SffISSPROT P36914)的葡糖淀粉酶，衍生自川地曲霉(EMBL:#AB008370)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans) (NCBIAAF17100.1)的 a -淀粉酶，衍生自臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) (SffISSPROT P36924)的￠-淀粉酶、或者衍生自環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) (SWISSPROT P43379)的CGT酶。優選為衍生自川地曲霉(EMBL:#AB008370) a-淀粉酶的CBM以及與川地曲霉(EMBL:#AB008370) a -淀粉酶的 CBM 有至少 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 或者甚至至少99%同源性的CBM，即與SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少50%，60%，70%，80%，90%，95%，97%或者甚至至少99%同源性的CBM。本發明還優選具有SEQ ID NO: 3 (黃熱芽孢桿菌(Bacillus flavorthermus)CBM)、SEQ ID NO: 4 (芽孢桿菌 CBM)、和 SEQ ID NO: 5 ( Bf堿芽孢桿菌(Alcaliphilic Bacillus)CBM)所示氨基酸序列的碳水化合物結合模塊家族20的CBM。更多優選的CBM包括來自Hormoconis sp.例如來自Hormoconis resinae (與雜酹真菌或脂暗膜菌(Amorphotheca resinae)同義)的葡糖淀粉酶的CBM,例如CBMSWISSPROT:Q03045 (SEQ ID NO: 6)，來自香菇(Lentinula sp.)如埃杜香菇(Lentinulaedodes)(花菇(Shiitake mushroom))的葡糖淀粉酶的 CBM 如 CBM SPTREMBL: Q9P4C5 (SEQID N0:7)、來自脈孢霉(Neurospora sp.)如粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的葡糖淀粉酶的 CBM 如 CBM SWISSPROT:P14804(SEQ ID NO:8)、來自踝節菌如 Talaromycesbyssochlamydioides 的葡糖淀粉酶的 CBM如 CBM NN005220 (SEQ ID NO: 9)，來自 Geosmithiasp.如 Geosmithia cylindrospora 的葡糖淀粉酶的 CBM 如 CBM NN48286 (SEQ ID NO: 10),來自 Scorias sp.如 Scorias spongiosa 的葡糖淀粉酶的 CBM 如 CBM NN007096 (SEQ IDN0:11),來自正青霉(Eupenicillium sp.)如 Eupenicillium Iudwigii 的葡糖淀粉酶的CBM 如 CBM NN005968 (SEQ ID NO: 12)，來自曲霉如日本曲霉(Aspergillus japonicus)的葡糖淀粉酶的 CBM 如 CBM NNOO1136 (SEQ ID NO: 13)，來自青霉(Penicillium sp.)如米舒青霉(Penicillium cf.miczynskii)的葡糖淀粉酶的 CBM如 CBM NN48691 (SEQ ID NO: 14),來自Mzl青霉的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN48690 (SEQ ID NO: 15)，來自Thysanophorasp.的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN48711(SEQ ID NO: 16)，和來自腐質霉(Humicola sp.)如灰腐質霉高溫變種(Humicola grisea var.thermo idea)的葡糖淀粉酶的CBM如CBMSPTREMBL:Q12623 (SEQ ID N0:17)。最優選的CBM包括來自曲霉例如黑曲霉葡糖淀粉酶的CBM, ta SEQ ID NO: 18，和來自阿太菌如羅耳阿太菌葡糖淀粉酶的CBMjBSEQ ID NO: 19。本發明還優選與前述任何CBD氨基酸序列有至少50%，60%, 70%, 80%, 90%, 95%，97%或者甚至至少99%同源性的任何CBD。更多合適的碳水化合物結合模塊家族20的CBM可見于URL:afmb.cnrs~mrs.fr/ cazy/CAZY/index, html)的碳水化合物活性酶服務器。其它的CBM可以在來自卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、米根霉(Rhizopusoryzae) > Arxula adeninivorans 的葡糖淀粉酶中找到。一旦鑒定了編碼底物結合(碳水化合物結合)區域的核苷酸序列(它們為cDNA或染色體DNA)，接下來就可以以許多方式操作而將其融合到編碼目標酶的DNA序列中。然后編碼結合碳水化合物的氨基酸序列的DNA片段和編碼目標酶的DNA用或不用接頭而連接起來。然后所得的連接DNA可以以許多方式操作而獲得表達。葡糖淀粉酶序列適合作為本發明的CBM/葡糖淀粉酶雜交體的基礎的葡糖淀粉酶包括例如衍生自真菌生物、細菌或植物的葡糖淀粉酶。優選的葡糖淀粉酶為真菌或細菌起源，選自曲霉葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3 (5)，p.1097-1102)，SEQ ID NO: 24 所示)，或其變體，例如 W092/00381，W000/04136 和 W001/04273(來自Novozymes, Denmark)中所公開的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(W084/02921),米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55 (4)，p.941-949)，或其變體或片段。其它的葡糖淀粉酶包括羅耳阿太菌葡糖淀粉酶(美國專利4，727，046)，見SEQ ID NO: 26，踝節菌葡糖淀粉酶，特別是衍生自埃默森踩節菌(W099/28448),見 SEQ ID NO: 25) >Talaromyces Ieycettanus (美國再版專利32, 153) >Talaromyces duponti>Talaromyces thermophilus (美國專利 4，587，215)的葡糖淀粉酶。本發明涉及的細菌葡糖淀粉酶包括源于梭菌屬(Clostridium),特別是熱解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum) (EP135, 138),和熱硫化氫梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(W086/01831)的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以具有或不具有天然CBM，但至少包含所述催化模塊(CM)。優選的葡糖淀粉酶為SEQ ID NO: 24所公開的黑曲霉葡糖淀粉酶，或者與SEQ IDNO: 24所示氨基酸序列具有大于50%，例如60%，70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同源性(一致性)的葡糖淀粉酶。應了解葡糖淀粉酶(催化模塊)在一個實施方案中可以為具有葡糖淀粉酶活性的活性片段。 另一優選的葡糖淀粉酶為SEQ ID N0:26所示的羅耳阿太菌葡糖淀粉酶，或者與SEQ ID NO: 26 所示氨基酸序列具有大于 50%,例如 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 或99%同源性(一致性)的葡糖淀粉酶。第三個優選的葡糖淀粉酶為SEQ ID N0:25所示的埃默森踝節菌葡糖淀粉酶，或者與 SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列具有大于 50%,例如 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同源性(一致性)的葡糖淀粉酶。雜交體一方面本發明涉及雜交酶，其包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模塊的氨基酸序列和碳水化合物結合模塊的氨基酸序列。在優選的實施方案中，所述催化模塊為真菌起源的。在更優選的實施方案中，所述催化模塊衍生于踝節菌菌株(優選埃默森踝節菌)，曲霉菌株(優選黑曲霉)，或阿太菌菌株(優選羅耳阿太菌)。在優選實施方案中，本發明的雜交酶包含衍生自埃默森踝節菌的具有葡糖淀粉酶活性的催化模塊和衍生自黑曲霉或羅耳阿太菌的碳水化合物結合模塊。在一個實施方案中，所述雜交體在催化模塊和碳水化合物結合模塊之間可以包括接頭序列，優選來自黑曲霉、羅耳阿太菌、川地曲霉或埃默森踝節菌。在優選實施方案中，本發明的雜交酶包含衍生自黑曲霉的具有葡糖淀粉酶活性的催化模塊和衍生自羅耳阿太菌或埃默森踝節菌的碳水化合物結合模塊。在一個實施方案中，所述雜交體在催化模塊和碳水化合物結合模塊之間可以包括接頭序列，優選來自黑曲霉、羅耳阿太菌、川地曲霉或埃默森踝節菌。在另一優選實施方案中，本發明的雜交酶包含衍生自羅耳阿太菌的具有葡糖淀粉酶活性的催化模塊和衍生 自黑曲霉或埃默森踝節菌的碳水化合物結合模塊。在一個實施方案中，所述雜交體在催化模塊和碳水化合物結合模塊之間可以包括接頭序列，優選來自黑曲霉、羅耳阿太菌、川地曲霉或埃默森踝節菌。優選的黑曲霉，羅耳阿太菌或埃默森踝節菌分別為SEQ ID N0S: 24，25，和26中所
/Jn o優選所述雜交酶包含與SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6,SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQID NO: 13，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 16，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 18，或SEQ ID NO: 19任一所示的氨基酸序列具有至少50%，60%，70%，80%，90%，95%，97%或者甚至至少99%同源性的CBM序列。更優選所述雜交酶包含具有SEQ ID NO: 28所示氨基酸序列的CBM序列。在又一優選實施方案中，所述CBM序列具有與SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列，或其它CBM序列中的任何一個，在不超過10個氨基酸位置、不超過9個位置、不超過8個位置、不超過7個位置、不超過6個位置、不超過5個位置、不超過4個位置、不超過3個位置、不超過2個位置、或者甚至不超過I個位置不同的氨基酸序列。在最優選的實施方案中，所述雜交酶包含衍生于來自羅耳阿太菌的葡糖淀粉酶的CBM，例如美國專利4，727，026中所述的來自羅耳阿太菌AHU9627的AMG或者來自黑曲霉的CBM。根據本發明考慮的具體雜交體包括下述:
權利要求
1.一種包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模塊和碳水化合物結合模塊的雜交酶，其中 (a)催化模塊與SEQID NO:25的氨基酸序列的序列具有至少99%序列同一性:并且來源于埃默森踝節菌； (b)碳水化合物結合模塊與SEQID N0:19具有至少99%序列同一性，并且來源于羅耳阿太菌(Athelia rolfsii)。
2.權利要求1的雜交酶，其中所述的催化模塊由SEQID NO:25的氨基酸序列組成，且碳水化合物結合模塊是SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
3.權利要求1的雜交酶，其中所述的催化模塊由SEQID NO:25的氨基酸序列組成，且碳水化合物結合模塊是SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
4.權利要求1的雜交酶，其由SEQID NOs:97-99中任一序列所編碼。
5.—種產生乙醇的方法,包括在發酵生物存在時,用權利要求1-4任一項的雜交酶在水性介質中處理顆粒淀粉。
6.權利要求5 的方法，另外其中對所述顆粒淀粉進行a-淀粉酶處理。
7.權利要求6的方法，其中所述a-淀粉酶是酸性a -淀粉酶。
8.權利要求7的方法，其中所述酸性a-淀粉酶源于黑曲霉菌株。
9.權利要求5的方法，其中雜交酶以0.02-20AGU/g DS的量加入。
10.權利要求5的方法，其中所述顆粒淀粉在低于該顆粒淀粉的初始糊化溫度下被水解為可溶性淀粉水解產物。
11.權利要求5的方法，其中所述發酵生物是啤酒糖酵母的菌株。
全文摘要
本發明涉及雜交酶，其包含至少一種碳水化合物結合模塊氨基酸序列和至少葡糖淀粉酶氨基酸序列的催化模塊。本發明還涉及這種雜交酶在淀粉處理以及尤其是乙醇產生中的用途。
文檔編號C12R1/645GK103215239SQ20131009721
公開日2013年7月24日 申請日期2004年10月27日 優先權日2003年10月28日
發明者托本.博徹特, 斯蒂芬.丹尼爾森, 埃里克.阿蘭 申請人:諾維信北美公司, 諾維信公司