專利名稱：解淀粉芽孢桿菌添加前體物發酵法生產抗病毒藥物利巴韋林的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生化工程領域，涉及一種基因工程菌添加前體物發酵法生產抗病毒藥物利巴韋林的工藝。
背景技術：
利巴韋林(ribavirin)，化學名為1-β _D_呋喃核糖基-1H-1，2，4_三氮唑_3_羧酰胺，別名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有顯著抑制作用，在抗病毒臨床實踐中得到廣泛應用。利巴韋林生產方法有化學合成法、發酵法和酶法三類。目前，國內在工業生產上實施的化學合成法占絕大多數，存在副產物多，產率低，操作步驟多，污染嚴重，成本高等不足。酶法生產利巴韋林由Witkowski等首創，在上個世紀80、90年代發展起來，隨后被廣泛應用于利巴韋林的生產,但酶法生產利巴韋林的酶源細胞生產成本較高,必須先經過對菌體進行分離后才能投入到反應中，菌體培養過程與利巴韋林生產過程分為兩個階段，不能實現偶聯，且需要維持較高的反應溫度。添加前體物發酵法(日本公開專利17830/1979)具有原料成本低，來源廣泛，能耗低，菌體培養與利巴韋林生產的過程同步進行等優點，但是到目前為止，此法產量較低，仍然處于實驗室研究階段，不能投入到 工業生產當中，其關鍵原因在于:由于技術瓶頸，目前的利巴韋林生產菌株不能兼具高效生產核苷和高效表達嘌呤核苷磷酸化酶這兩種特點。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有技術中存在的上述問題，提供一種利用解淀粉芽孢桿菌添加前體物發酵法生產抗病毒藥物利巴韋林的生產工藝。該工藝以鳥苷生產菌解淀粉芽孢桿菌TA208為改造對象，大幅度提高了該菌合成嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的能力，突破了一直以來不能突破的瓶頸，實現只要在培養基中添加前體物TCA (I, 2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)就可以直接生產利巴韋林。其優點在于工藝簡單，生產周期短，產量高，糖苷轉化率高，不需要高溫條件，降低了利巴韋林的生產成本。本發明提供的解淀粉芽孢桿菌添加前體物發酵法生產抗病毒藥物利巴韋林的生產工藝，其步驟如下:A、利用分子生物學技術以鳥苷生產菌解淀粉芽孢桿菌TA208作為宿主菌構建兼具高效表達嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP):利用PCR技術從枯草芽孢桿菌BS168中擴增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因pupG，與經過改造的表達載體PBSA43連接，構建了具有較高表達效率和很高質粒穩定性的分泌型表達載體pBSA43-Bs816PNP 和工程菌 RBVM (pBSA43_Bs816PNP)，詳細過程見實施例1。
(注:鳥苷生產菌解淀粉芽孢桿菌TA208的選育及發酵工藝的研究由本實驗室的武改紅于2005年完成；編碼高酶活力的嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆表達、重組蛋白純化及酶學性質研究由本實驗室的夏俊剛于2010年12月在《中國生物工程雜志》第30卷第12期發表。經進一步改造獲得的利巴韋林工程菌RBVM (pBSA43-Bs816PNP)現保藏于天津科技大學代謝工程研究室。)B、工程菌添加前體物發酵:將步驟A中獲得的經擴大培養的菌種RBVM(pBSA43-Bs816PNP)接入發酵培養基進行工程菌添加前體物發酵，發酵培養基中碳源含量應為8% 12%，氮碳比N: C應介于10:100 15:100之間，無機鹽含量應為0.1% 12%，發酵培養基的初始PH7.2 7.8，培養溫度33°C 35°C，振蕩培養或發酵罐培養60 80h，接種量為5% 10% (V/V)，發酵過程中，添加氨水調節發酵液的pH值維持在7.0 7.4，發酵開始12-24h添加TCA。(I).發酵培養基葡萄糖8% 12%,酵母膏0.8% 1.0%,豆濃1.6% 2%,玉米漿1% 2%, (NH3) 2S041% 1.5%, MgSO4.7Η20 0.1% 0.15%, KH2PO4 0.1% 0.3%, FeSO4 2 4mg/L，自來水 96% 98%，培養基pH值為7.0 7.4。(2).發酵控制工藝采用5L發酵罐，發酵溫度33 35°C，空氣流量為0.8 8.0L/min,罐壓0.001
0.006MPa,溶氧維持在15 40%，發酵pH值控制在7.0 7.4，發酵開始12_24h添加TCA，繼續發酵至60-80h結束。C、產物利巴韋林定量分析:
取樣離心，取上清液經無菌去離子水稀釋適當倍數，采用高效液相色譜(HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC)定量檢測利巴韋林。工作條件為:Agilent1200型高效液相色譜儀；檢測器VWD (可變波長紫外檢測器)；檢測波長207nm ;進樣器標準型自動進樣器；進樣量5μ L ;色譜柱Kromasil C18，5 μ，250mmX 4.6mm ;流動相水:乙腈=96:4 (V/V);柱溫 300C ;流速 lml/min。利巴韋林轉化率定義:
產物利巴韋林質量 x1_/
_化率(％)=———.........................................................................Xl00%
雌葡萄_量本發明的優點和積極效果I)采用基因工程手段，突破了鳥苷高產和PNPase高效表達無法在同一株菌上得到實現的瓶頸，使PNPase得以在鳥苷生產菌解淀粉芽孢桿菌ΤΑ208中得到高效表達，并且能很好的分泌到培養基中且保持活性，較改造之前的PNPase活力有大幅度提高。2)操作簡單，采用傳統的發酵工藝、設備使本發明容易實現普及，發酵溫度控制在33 35°C，避免為了維持較高的轉化溫度而消耗額外的能源。3)發酵周期短，產量高，經60-80小時發酵即可在發酵液中檢測到較高的利巴韋林含量，目前最高可達27g/L，糖苷轉化率35%-44%。
圖1是轉化子提取質粒酶切驗證。
具體實施例方式實施例1構建基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)采用相關分子生物學技術對載體pBE2進行改造后命名為PBSA43，其具有如下特點:①配備有可以被解淀粉芽孢桿菌RNA聚合酶識別的P43啟動子，保證目的基因可以在宿主菌內高效表達，并且無需化學誘導劑IPTG或乳糖誘導。②針對解淀粉芽孢桿菌限制-修飾系統的特點，移除了質粒上的BamH I酶切位點，使質粒更容易轉化可以將sacB基因序列中編碼信號肽的序列融合到目的基因的5’端，使目的基因可以分泌到培養基中。pBSA43質粒的構建:采用PCR技術，分別將P43啟動子的序列和sacB基因序列中編碼信號肽的序列從枯草芽孢桿菌BS168基因組上克隆擴增，插入到pBE2質粒的多克隆位點，使sacB基因序列中編碼信號肽的序列的5’端位于P43啟動子的序列的3’端的下游，形成的新質粒命名為PBSA43。P43啟動子的PCR擴增所采用的引物參見序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，序列見序列表SEQ ID N0.7 ;SacB信號肽的PCR擴增所采用的引物參見序列表SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，序列參見序列表SEQ ID N0.8。重組質粒pBSA43_Bs816PNP的構建:采用PCR技術，將編碼嘌呤核苷磷酸化酶的基因pupG從枯草芽孢桿菌BS168基因組上克隆擴增，并與PBSA43質粒重組，使pupG序列的5’端位于sacB基因序列中編碼信號肽的序列的3’端的下游(此處注意保證閱讀框架的完整)，構建了高效表達嘌呤核苷磷酸化酶的重組質粒pBSA43-Bs816PNP。pupG的PCR擴增所采用的引物參見序列表SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，序列參見序列表SEQ ID N0.9。重組質粒的轉化:根據解淀粉芽孢桿菌具限制-修飾系統的特點，在構建質粒的時候盡量避免選用BamH I作為酶切位點，并且盡量保證質粒上不含有BamH I酶切位點。通過電擊轉化法，將重組質粒pBSA43-Bs816PNP轉化鳥苷生產菌解淀粉芽孢桿菌TA208，取I 10 μ L濃度為IOOng/ μ L重組質粒溶液加入到100 μ L感受態細胞中冰浴30min后轉移至2mm冰浴預冷過的電轉杯中，在1800V電壓下進行電擊轉化，電擊后立即加入900 μ L LB培養基，35°C振蕩培養2h，轉速為220r/min，進行復蘇培養。復蘇培養結束后取200 μ L培養液涂布至含10 μ g/L卡那霉素的LB平板上，35°C倒置培養18h，待長出菌落后挑取單菌落接種于裝有5ml LB培養基的搖管中35°C振蕩培養12h，轉速為220r/min，提質粒進行酶切驗證，結果見圖1。實施例2工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)質粒穩定性采用平板稀釋計數法。將凍存于_80°C甘油管中的工程菌(實施例1構建)在含10 μ g/L卡那霉素的LB平板上三區劃線，37°C培養16h，挑取單菌落接種于5ml液體選擇性培養基(LB/Knf)中，搖管培養12h后以I %的接種量轉入5ml液體非選擇性培養基(LB)，開始連續搖管培養試驗。每12h轉種一次，接種量為1%，連續傳代30次，每隔5次取樣進行平板稀釋檢測質粒的缺失程度。檢測時，取菌液Iml用無菌水逐級稀釋，取三個合適的梯度，本實驗選擇10_7、10_8、10_9三個梯度分別涂在固體選擇性培養基和非選擇性培養基平板上，每個處理三個重復。倒置在37°C培養箱中培養16h，計算各皿中的菌落數。將選擇性培養基中的菌落數與非選擇性培養基中菌落數進行比較， 即可根據公式計算出質粒的缺失率，見表I。表I工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)質粒結構穩定性
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌添加前體物TCA (1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)發酵法生產抗病毒藥物利巴韋林的生產工藝，即利用自行構建的兼具高效生產核苷和高效表達嘌呤核苷磷酸化酶這兩種特點的基因工程菌RBVM (pBSA43-Bs816PNP)通過發酵過程中添加前體物TCA實現發酵法生產利巴韋林，具體工藝包括: A.利用分子生物學技術以鳥苷生產菌解淀粉芽孢桿菌TA208作為宿主菌構建兼具高效表達嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP):即利用PCR技術從枯草芽孢桿菌BS168中擴增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因pupG，與經過改造的表達載體PBSA43連接，構建了具有較高表達效率和很高質粒穩定性的分泌型表達載體pBSA43-Bs816PNP 和工程菌 RBVM (pBSA43_Bs816PNP)； B.工程菌添加前體物發酵:將步驟A中獲得的經擴大培養的菌種RBVM(pBSA43-Bs816PNP)接入發酵培養基進行工程菌添加前體物發酵，發酵培養基中碳源含量應為8% 12%，氮碳比N: C應介于10:100 15:100之間，無機鹽含量應為0.1% 12%，發酵培養基的初始PH7.2 7.8，培養溫度33°C 35°C，振蕩培養或發酵罐培養60 80h，接種量為5% 10%V/V，發酵過程中，添加氨水調節發酵液的pH值維持在7.0 7.4，發酵開始 12-24h 添加 TCA。
2.根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于B步生產利巴韋林發酵采用的培養基:葡萄糖8% 12%，酵母膏0.8% 1.0%,豆濃1.6% 2%，玉米漿1% 2%，(NH3) 2S04 1% 1.5%, MgSO4.7H20 0.1% 0.15%, KH2PO4 0.1% 0.3%, FeSO4 2 4mg/L,自來水 96% 98%，發酵pH值控制在7.0 7.4，發酵開始12_24h添加TCA。
3.根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于B步生產利巴韋林發酵采用的控制工藝:發酵溫度33 3 5°C，溶氧維持在15 40%，發酵時間為60 80h。
全文摘要
一種解淀粉芽孢桿菌添加前體物TCA(1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺)發酵法生產抗病毒藥物利巴韋林的生產工藝。本發明首先構建了一個能在解淀粉芽孢桿菌細胞內穩定復制并高效分泌表達嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的重組質粒pBSA43-Bs816PNP，并將此質粒轉化鳥苷生產菌解淀粉芽孢桿菌TA208，得到一株兼具高效生產鳥苷和高效表達嘌呤核苷磷酸化酶這兩種特點基因工程菌RBVM(pBSA43-Bs816PNP)。采用該工程菌，以葡萄糖、酵母膏、豆濃、玉米漿、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和自來水為原料，添加前體物TCA進行發酵，添加前體物幾小時后便可在培養基中檢測到較高濃度的利巴韋林。本發明具有發酵周期短，產量高，糖苷轉化率高，工藝簡便，成本低，能耗低，污染小等優點。
文檔編號C12R1/125GK103146785SQ20131009783
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月25日 優先權日2013年3月25日
發明者陳寧, 馬躍超, 劉莉, 徐慶陽, 謝希賢, 張成林 申請人:天津科技大學