專利名稱：一種快速提取高純度質粒dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速提取高純度質粒DNA的方法，屬于核酸純化技術領域。
背景技術：
質粒DNA的提取和純化是分子生物學的基本步驟之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治療和各種基因重組等領域。從原核生物中提取和純化質粒DNA的經典步驟為:菌體裂解、質粒分離和純化。目前菌體裂解最常用的方法有:一步法質粒提取法和堿裂解法。一步法質粒提取法是由德國Eppendorf公司發明。它是一種基于溶菌酶裂解細菌的提取方法。該方法使用含有溶菌酶和去污劑的裂解液裂解細胞，裂解產物澄清無粘性，裂解后無需離心可直接與過濾膜進行結合，然后通過快速離心的清洗和洗脫得到超螺旋的質粒DNA。該提取方法雖然方便，快捷和重復性好，但不適合于低拷貝質粒的提取和豐富培養基培養大腸桿菌質粒的提取。堿裂解法質粒DNA純化技術是1979年由Birnboim&Doly發明。該方法仍是分子克隆研究中最常用的方法之一，其操作包括三種溶液處理，一般需要20分鐘左右的時間才能完成質粒的提取。該提取方法適用面較廣，重復性好，但實驗周期相對較長，影響了研究者的實驗進程。
發明內容
本發明的目的是提出一種快速提取高純度質粒DNA的方法，基于已有的堿裂解法，采用一種新的快速沉淀緩沖液，并對整個質粒提取流程進行優化，以使整個質粒提取過程大大縮短。本發明提出的快速提取高純度質粒DNA的方法，包括以下各步驟:
(I)對I 3毫升培養12 16小時的大腸桿菌菌液進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離的時間為I分鐘，取出離心分離的沉淀物；(2)向步驟(I)的沉淀物中加入75微升懸浮液，懸浮液的成分為:50毫摩爾葡萄糖、25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和10毫摩爾乙二胺四乙酸，渦旋振蕩至沉淀完全溶解，得到第一溶液；(3)向上述第一溶液中加入75微升堿裂解液，堿裂解液的成分為:200毫摩爾氫氧化鈉和重量體積比為1%的十二烷基硫酸鈉，上下翻轉6 8次，使步驟(2)中所得到的菌體充分裂解，得到第二溶液；(4)向第二溶液中加入210微升快速沉淀緩沖液，上下翻轉6 8次，充分混勻，對混合物進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離時間為I分鐘；所述的快速沉淀緩沖液中各組分的質量為:異硫氰酸胍3 5克
鹽酸胍8 12克
乙酸鉀4 6克
月桂酰基肌氨酸鈉 0.1 0.25克 乙酸2 4毫升 將上述各組分稱重后混合，加去離子水，得到混合液，并使混合液體積為100毫升;(5)將步驟(4)中離心分離得到的上清液轉入硅膜吸附柱中，進行吸附離心，吸附離心的轉速為13000轉/分鐘，吸附離心時間為30秒，倒去廢液；(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽以及體積百分比為75%的無水乙醇，漂洗液的pH值為7.5，進行脫鹽離心，脫鹽離心的轉速為13000轉/分鐘，脫鹽離心時間為30秒，倒去廢液；(7)在步驟(6)的硅膜吸附柱中加入50 100微升洗脫緩沖液，洗脫緩沖液為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，洗脫緩沖液的PH值為8，進行洗脫離心，洗脫離心的轉速為13000轉/分鐘，洗脫離心時間為30秒，得到高純度質粒DNA。本發明提出的快速提取質粒DNA的方法，其優點是:1、本發明提出的快速提取質粒DNA的方法，使用了一種新的快速沉淀緩沖液，并對整個質粒提取流程進行優化，快速沉淀緩沖液一方面中和氫氧化鈉；另一方面提高體系中的鹽濃度，使蛋白質、基因組DNA和RNA發生鹽析沉淀。加入快速沉淀緩沖液后，大部分蛋白質、基因組DNA和RNA都以不溶物狀態存在，離心I分鐘后即可將所有不溶物沉淀到管底，上清即可進行下一步操作。因此使質粒總核糖核酸的提取過程具有高效、快速、簡潔的特點，可以直接從大腸桿菌培養液中分離純化總核糖核酸，例如本發明方法的實施例1和實施例2中從I 3暈升大腸桿菌培養液中提取總核糖核酸，由傳統的20分鐘縮短到6分鐘左右。2、使用本發明方法提取質粒核糖核酸，具有高效、快速、簡潔的特點，純化的質粒核糖核酸可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉化、文庫篩選、體外翻譯、轉染一些常規的傳代細胞等。3、本發明的提取質粒DNA方法，不僅能用于高拷貝和低拷貝質粒的提取，也適用于不同培養基培養大腸桿菌質粒的提取，大大節省了實驗研究者的時間，提高了實驗效率。
圖1是本發明方法的實施例1，從1.5毫升大腸桿菌培養液中提取高拷貝質粒pBS的電泳檢測圖。其中，泳道1:脫氧核糖核酸分子量標準(Marker IV)。泳道2:使用本發明方法純化的總核糖核酸。圖2是本發明方法的實施例2，從1.5毫升大腸桿菌培養液中提取低拷貝質粒PBR322的電泳檢測圖。其中，泳道1:脫氧核糖核酸分子量標準(Marker IV)。泳道2:使用本發明方法純化的總核糖核酸。
具體實施例方式本發明提出的快速提取高純度質粒DNA的方法，包括以下各步驟:(I)對I 3毫升培養12 16小時的大腸桿菌菌液進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離的時間為I分鐘，取出離心分離的沉淀物；(2)向步驟(I)的沉淀物中加入75微升懸浮液，懸浮液的成分為:50毫摩爾葡萄糖、25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和10毫摩爾乙二胺四乙酸，渦旋振蕩至沉淀完全溶解，得到第一溶液；(3)向上述第一溶液中加入75微升堿裂解液，堿裂解液的成分為:200毫摩爾氫氧化鈉和重量體積比為1%的十二烷基硫酸鈉，上下翻轉6 8次，使步驟(2)中所得到的菌體充分裂解，得到第二溶液；(4)向第二溶液中加入210微升快速沉淀緩沖液，上下翻轉6 8次，充分混勻，對混合物進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離時間為I分鐘，所述的快速沉淀緩沖液中各組分的質量為:
異硫氰酸胍3 5克
鹽酸胍8 12克
乙酸鉀4 6 克
月桂酰基肌氨酸鈉 0.1 0.25克 乙酸2 4毫升將上述各組分稱重后混合，加去離子水，得到混合液，并使混合液體積為100毫升;(5)將步驟(4)中離心分離得到的上清液轉入硅膜吸附柱中，進行吸附離心，吸附離心的轉速為13000轉/分鐘，吸附離心時間為30秒，倒去廢液；(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽以及體積百分比為75%的無水乙醇，漂洗液的pH值為7.5，進行脫鹽離心，脫鹽離心的轉速為13000轉/分鐘，脫鹽離心時間為30秒，倒去廢液；(7)在步驟(6)的硅膜吸附柱中加入50 100微升洗脫緩沖液，洗脫緩沖液為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，洗脫緩沖液的PH值為8，進行洗脫離心，洗脫離心的轉速為13000轉/分鐘，洗脫離心時間為30秒，得到高純度質粒DNA。以下介紹本發明方法的實施例:實施例1:從大腸桿菌培養物中提取高拷貝質粒pBS。(I)對2毫升培養15小時的大腸桿菌菌液進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離的時間為lmin，取出離心分離的沉淀物；(2)向上述沉淀物中加入75微升懸浮液，懸浮液的組成為:50毫摩爾葡萄糖，25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，以及10毫摩爾乙二胺四乙酸；渦旋振蕩至沉淀完全溶解，得到第一溶液；
(3)向上述第一溶液中加入75微升堿裂解液，堿裂解液的組成為:200毫摩爾氫氧化鈉和重量/體積為1%的十二烷基硫酸鈉，溫和地上下翻轉6 8次使菌體充分裂解，得到第二溶液；(4)向上述第二溶液中加入210微升快速沉淀緩沖液，立即溫和地上下翻轉6 8次，充分混勻。然后對該混合物進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離時間為I分鐘。其中的快速沉淀緩沖液，其制備方法是:將異硫氰酸胍4克、鹽酸胍10克、乙酸鉀4g、月桂酰基肌氨酸鈉0.2克和乙酸3毫升混合，加去離子水，得到混合液，并使混合液體積為100毫升。(5)將步驟(4)中上清液轉入硅膜吸附柱中，進行吸附離心，離心吸附的轉速為13000轉/分鐘，離心吸附時間為30秒，倒去廢液；(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽以及體積百分比為75%的無水乙醇，漂洗液的pH值為7.5，進行脫鹽離心，脫鹽離心的轉速為13000轉/分鐘，脫鹽離心時間為30秒，倒去廢液。(7)在步驟(6)的硅膜吸附柱中加入60微升洗脫緩沖液，洗脫緩沖液為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，洗脫緩沖液的PH值為8，進行洗脫離心，洗脫離心的轉速為13000轉/分鐘，洗脫離心時間為30秒，得到高純度質粒DNA。圖1所示是實施例1中從1.5毫升大腸桿菌培養液中提取高拷貝質粒pBS的電泳檢測圖，圖中泳道1:脫氧核糖核酸分子量標準(Marker IV)，泳道2:使用本發明方法純化的質粒DNA。實施例2:從大腸桿菌培養物中提取低拷貝質粒pBR322。(I)對3毫升培養1 3小時的大腸桿菌菌液進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離的時間為lmin，取出離心分離的沉淀物；(2)向上述沉淀物中加入75微升懸浮液，懸浮液的組成為:50毫摩爾葡萄糖，25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽以及10毫摩爾乙二胺四乙酸，渦旋振蕩至沉淀完全溶解，得到第一溶液；(3)向上述第一溶液中加入75微升堿裂解液，裂解液的組成為:200毫摩爾氫氧化鈉和重量/體積為1%的十二烷基硫酸鈉，溫和地上下翻轉6 8次使菌體充分裂解，得到第二溶液；(4)向上述第二溶液中加入210微升快速沉淀緩沖液，立即溫和地上下翻轉6 8次，充分混勻。然后對該混合物進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離時間為I分鐘。其中的快速沉淀緩沖液，其制備方法是:將異硫氰酸胍4克、鹽酸胍10克、乙酸鉀4g、月桂酰基肌氨酸鈉0.2克和乙酸3毫升混合，加去離子水，得到混合液，并使混合液體積為100毫升。(5)將步驟(4)中上清液轉入硅膜吸附柱中，進行吸附離心，離心吸附的轉速為13000轉/分鐘，離心吸附時間為30秒，倒去廢液；(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽以及體積百分比為75%的無水乙醇，漂洗液的pH值為7.5，進行脫鹽離心，脫鹽離心的轉速為13000轉/分鐘，脫鹽離心時間為30秒，倒去廢液。(7)在步驟(6)的硅膜吸附柱中加入80微升洗脫緩沖液，洗脫緩沖液為10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，洗脫緩沖液的pH值為8，進行洗脫離心，洗脫離心的轉速為13000轉/分鐘，洗脫離心時間為30秒，得到高純度質粒DNA。圖2所示是實施例1中從1.5毫升大腸桿菌培養液中提取低拷貝質粒PBR322的電泳檢測圖，圖中泳道1:脫氧核糖核酸分子量標準(Marker IV)，泳道2:使用本發明方法純化的 質粒DNA。
權利要求
1.一種快速提取高純度質粒DNA的方法，其特征在于該方法包括以下各步驟: (1)對I 3毫升培養12 16小時的大腸桿菌菌液進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離的時間為I分鐘，取出離心分離的沉淀物； (2)向步驟(I)的沉淀物中加入75微升懸浮液，懸浮液的成分為:50毫摩爾葡萄糖、25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和10毫摩爾乙二胺四乙酸，渦旋振蕩至沉淀完全溶解，得到第一溶液； (3)向上述第一溶液中加入75微升堿裂解液，堿裂解液的成分為:200毫摩爾氫氧化鈉和重量體積比為1%的十二烷基硫酸鈉，上下翻轉6 8次，使步驟(2)中所得到的菌體充分裂解，得到第二溶液； (4)向第二溶液中加入210微升快速沉淀緩沖液，上下翻轉6 8次，充分混勻，對混合物進行離心分離，離心分離的轉速為13000轉/分鐘，離心分離時間為I分鐘， 其中的快速沉淀緩沖液中各組分的質量為:
全文摘要
本發明涉及一種快速提取高純度質粒DNA的方法，屬于核酸純化技術領域。首先向大腸桿菌沉淀物中加入懸浮液，渦旋振蕩至沉淀完全溶解，然后加入堿裂解液，混勻后加入快速沉淀緩沖液，再混勻后進行離心分離1分鐘，取上清轉入硅膜吸附柱中，進行吸附離心，加入漂洗液進行脫鹽離心，加入無核糖核酸酶的水洗脫離心，得到質粒核糖核酸溶液。本發明方法具有高效、快速、簡潔的特點，純化的質粒DNA可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉化、文庫篩選、體外翻譯、轉染一些常規的傳代細胞等。
文檔編號C12N15/10GK103205417SQ20131014226
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月23日 優先權日2013年4月23日
發明者韓典霖, 俞萍, 李曉晨, 孫克非 申請人:天根生化科技(北京)有限公司