利用工程菌株M18G攜帶質粒pME6032Phz生產吩嗪-1-羧酸的方法

專利名稱：利用工程菌株M18G攜帶質粒pME6032Phz生產吩嗪-1-羧酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物源殺菌劑的生產方法，尤其涉及一種利用促生拮抗菌衍 生菌株M18G，構建攜帶質粒pME6032Phz的基因工程菌株M18G/pME6032Phz，高效生產吩 嗪-l-羧酸的方法。屬于微生物源農藥生產技術領域。
背景技術：
農作物病害引起的損失幅度約占總產量的25 75%，以我國主要的糧食作物水 稻為例，每年種植面積約4億畝，按畝產量400公斤，水稻病害平均引起減產10%計，每年造 成經濟損失達300多億元人民幣之巨，嚴重威脅糧食作物的安全生產。目前，生產上控制植 物病害除了選用良種和改進栽培措施外，主要依靠噴灑化學殺菌劑。在生產上，目前使用的 大多化學殺菌劑對人體和動物具有不同程度的毒害作用，殘留在植物可食部分的有害成份 會對人體健康造成潛在威脅，已經引起政府和社會各階層的關注；不僅如此，有些化學農藥 難以分解，會長期地累積在生態系統中，造成對環境的污染，不利于社會和經濟的可持續發 展；而且，現有的化學農藥對某些植物病害并不完全有效。因此，在努力發展新一代高效、安 全、低毒、對環境相容性好的化學農藥的同時，還需要大力研究和發展生物源農藥。
1992年，世界環境與發展大會曾經提出，在新世紀之前，生物源農藥的使用量要達 到農藥使用總量60%的目標。然而，時至今日，作為發達國家的美國還只占15%左右，而我 國約占5% 。目前，與化學農藥相比，在生產上已經推廣使用的生物源農藥，其種類和數量都 較少，有些品種則由于使用年久，引起了植物病原菌的抗藥性，防治效果不夠理想。以水稻 紋枯病為例，該病害與稻瘟病、白葉枯病列為水稻作物生長過程中常年發生的三大主要病 害，防治該病害的藥劑主要依賴于老牌生物源農藥井崗霉素。但是，經過將近40年的長時 期地使用，部分水稻紋枯病菌的融合群已產生抗藥性；而且，井崗霉素僅對水稻紋枯病菌有 效，對其他病原菌沒有明顯的防治效果，使用范圍具有很大的局限性。 生物農藥促生拮抗菌M18，對植物病害具有高效、安全、廣譜的殺菌作用，與環境 相容性好，易于在環境中降解。該促生拮抗菌M18已于2000年6月27日在中國專利局 指定的保藏單位北京，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為 CGMCC NO. 0462。生物農藥促生拮抗菌M18的制備和應用，已經獲得國家發明專利，專利號為 00119857. 2。但是，生物農藥促生拮抗菌M18是一種活菌菌劑，其作用機理主要是通過M18 活菌合成抗植物病害的活性成分實現對農作物植物病源菌實施抑制作用，其合成的活性成 分含量容易受到環境條件的影響。因而，對植物病害的防治效果具有不穩定性的缺陷，難以 在農業生產中進行大規模的推廣應用。 已經查明，促生拮抗菌M18防治植物病害的主要活性成分是吩嗪-l-羧酸，從促生 拮抗菌M18的發酵液中提取吩嗪-l-羧酸，利用活性成分而不是活菌對農作物病害的防治 同樣具有高效、安全、廣譜、與環境相容性好等特征；同時，能克服利用促生拮抗菌M18防治 病害效果不穩定性的缺陷。但是，利用野生型促生拮抗菌株M18，發酵生產吩嗪-1-羧酸的
3產量僅為每升200-300毫克，活性成分的生產成本太高，不具備在農業生產中應用的價值。 近年來，已有運用分子生物學的技術，對促生拮抗菌M18合成吩嗪-1-羧酸的調控機制，開 展深入地研究。運用基因工程手段，對促生拮抗菌M18基因組中的雙組分調控基因gacA 開展了定向失活突變，獲得了 M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的產量，使其發 酵效價達到每升1500-1700毫克左右。該研究成果的技術方法已經于2004年在《微生物 學報》44巻第761 765頁公開，論文題目為《假單胞菌gacA插入突變對藤黃綠菌素和吩 嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調控》。 以吩嗪-l-羧酸為主要成分的微生物源殺菌劑，經我國農藥命名單位確認，定 名為申嗪霉素，獲得了農業部頒發的農藥臨時登記證(登記證號為LS20031381)。在名 稱為"利用促生拮抗菌M18衍生菌株制備殺菌劑的方法"的中國發明專利中(專利號 200610023459. 9)，提供一種了利用促生拮抗菌M18衍生菌株M18G和M18R制備殺菌劑的方 法，利用微生物的代謝產物而非微生物活體制備殺菌劑，通過兩種衍生菌株的代謝產物的 復配，達到提高防治效果的目的，能更加穩定、有效的控制植物病害，對瓜菜經濟作物，特別 是對甜椒疫病和西瓜枯萎病的防治取得了顯著成就。但是，我國以及亞洲地區人群的最主 要的糧食作物稻米，是一種低附加值的商品，如果按目前的發酵水平生產申嗪霉素，用于防 治水稻作物病害的成本仍然偏高，仍然難以為糧農所接受并開展大面積的推廣應用。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術中存在的缺陷，提供一種利用工程菌株M18G攜 帶質粒pME6032Phz生產吩嗪-1-羧酸的方法，用以提高吩嗪-1-羧酸的產量，降低制備殺 菌劑申嗪霉素的成本，有效防治水稻病害。 為實現上述目的，本發明從促生拮抗菌M18基因組中，擴增出吩嗪-1-羧酸生物 合成的編碼基因片段phzAl-Gl，并將該基因片段插入表達質粒pME6032中，置于強啟動子 Ptac的控制下，構建成重組質粒pME6032Phz ;然后，將該重組質粒pME6032Phz導入促生拮抗 菌M18的衍生菌株M18G中，構建成基因工程菌株M18G/pME6032Phz。該工程菌株在擴增吩 嗪-l-羧酸生物合成的編碼基因的拷貝數的同時，實現編碼基因的高效穩定表達。最后，基 因工程菌株M18G/pME6032Phz在黃豆粉培養液中培養，高效穩定地生產吩嗪-l-羧酸，使吩 嗪-1-羧酸的產量達到每升5700 6600毫克的水平。
本發明的方法具體包括以下步驟 1、擴增吩嗪-1-羧酸生物合成的編碼基因片段(phzAl-Gl) 設計一對引物，引物的核苷酸序列如下 正向5' -ATATATGGTACCGCCAGCGAATAACCGATGCCGCGAGGGAA-3， 反向5' -TGCGTAAGATCTCGATGGGTTCGCTCATGGGTGCTTCCTTTT-3' 序列中下劃線為限制性內切酶Kpn I、Bgl II的酶切位點；然后以促生拮抗菌M18
基因組DNA為模板，利用DNA聚合酶LA Taq和設計的引物，擴增吩嗪_1_羧酸生物合成的
編碼基因，擴增產物通過瓊脂糖電泳檢測，回收長度為6. 8kb的基因片段phzAl-Gl。 2、構建重組質粒pME6032Phz 將回收的基因擴增片段phzAl-Gl，經限制性內切酶Kpn 1、Bgl II酶切，連接酶連 接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達質粒pME6032，并將吩嗪-1-羧酸生物合成編碼基因的表達置于強啟動子Pta。控制下，形成重組質粒pME6032Phz并轉化進入大腸桿菌；從大腸 桿菌中提取構建的基因重組質粒pME6032Phz。
3、構建基因工程菌株M18G/pME6032Phz 制備促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞，并將上述基因重組質粒 pME6032Phz轉化到M18G的感受態細胞中，在28 37。C條件下，培養1 2天，從中篩選出 基因工程菌株M18G/pME6032Phz。
4、基因工程菌株M18G/pME6032Phz的培養 將基因工程菌株M18G/pME6032Phz接種在甘油培養基的平板上，在26 3(TC下， 活化生長20 24小時，再次在甘油培養基的平板上劃菌塊，26 3(TC下活化10 12小 時，然后將活化的M18G/pME6032Phz菌塊轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250毫升 的三角瓶中，在26 3(TC的搖床中振蕩培養9 11小時，搖床轉速為160 180轉/分； 最后轉接到含有65毫升黃豆粉培養液、體積為250毫升的三角瓶中，進行放大發酵培養，溫 度和轉速不變，發酵時間為60 72小時，得到吩嗪-l-羧酸含量為每升5700 6600毫克。
本發明中，所述甘油培養基和甘油培養液中含有的組分重量百分比為蛋白胨 1. 8 2. 2%、甘油1. 3 1. 7%、硫酸鎂0. 05 0. 1%、磷酸二氫鉀0. 01 0. 05%、余量為 水，pH 6. 8 7. 2。 所述黃豆粉培養液的組分重量百分比為黃豆粉4. 5 5. 5%、玉米漿1. 4 1. 7%、葡萄糖1. 0 1. 4%、余量為水，pH 6. 5 7. 0。 本發明利用基因工程菌株M18G攜帶質粒pME6032Phz，生產吩嗪-l-羧酸的方法的 優點是 1、提高吩嗪-1-羧酸合成基因的拷貝數。將吩嗪-l-羧酸生物合成的編碼基因插 入質粒pME6032，導入菌株M18G中，提高了吩嗪-l-羧酸生物合成的編碼基因的拷貝數。由 于質粒能在染色體外穩定地獨立復制，原先每一個細胞的染色體僅攜帶2個拷貝的編碼基 因，現在由質粒攜帶后，每一個細胞內的質粒數可達8至10拷貝；因而，吩嗪-l-羧酸生物 合成編碼基因的拷貝數也增加了 8至10拷貝。 2、增強并穩定吩嗪-1-羧酸合成基因的表達量。在質粒中，吩嗪-l-羧酸生物合 成的編碼基因置于強啟動子Pta。的控制下，該啟動子的表達活性不受M18G細胞中各種阻抑 因子對吩嗪-1-羧酸合成編碼基因表達的控制，大大提高了編碼基因的表達量，而且使編 碼基因獲得了穩定的表達。 3、高效并穩定地合成吩嗪-1-羧酸。在多基因拷貝和高效穩定表達的雙重作用
下，基因工程菌株M18G/pME6032Phz經黃豆粉培養液中培養，吩嗪-l-羧酸的合成量達到每
升5700 6600毫克，與原先的衍生菌株M18G相比，發酵效價平均提高2. 6 3. 1倍。 4、降低吩嗪-1-羧酸的生產成本。與衍生菌株M18G生產吩嗪_1_羧酸的葡萄糖
培養液相比，在利用工程菌株M18G/pME6032Phz生產吩嗪_1_羧酸時，所采用的黃豆粉培養
液成分中，玉米漿取代了約三分之二的葡萄糖用量，并且，玉米漿的用量約為所取代葡萄糖
量的50%，同時，玉米漿價格僅為葡萄糖的90%。這樣，利用工程菌株M18G/pME6032Phz生
產吩嗪-l-羧酸，在提高發酵效價的前提下，還進一步降低了生產成本。 5、利用本發明構建的高產基因工程菌株生產吩嗪-1-羧酸，制備殺菌劑申嗪霉
素，用于對植物進行噴霧或灌根施用，可防治水稻紋枯病、白葉枯病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、棉花枯萎病、炭疽病、立枯病和各種腐霉和疫霉引起的植物病害。同時，因 大大降低了生產成本，達到應用于防治植物病害的農本要求，利于申嗪霉素在農業生產中 獲得大規模推廣應用。


圖1為本發明中質粒pME6032Phz的構建示意圖。
具體實施例方式
以下，通過附圖和具體的實施例對本發明的技術方案及技術效果作進一步描述。
以下實施例不構成對本發明的限定。
實施例1 1、擴增吩嗪-1-羧酸生物合成的編碼基因片段(phzAl-Gl) 設計一對引物，用以擴增吩嗪-1-羧酸生物合成的編碼基因片段(phzAl-Gl)，引 物的核苷酸序列如下 正向5' -ATATATGGTACCGCCAGCGAATAACCGATGCCGCGAGGGAA-3， 反向5' -TGCGTAAGATCTCGATGGGTTCGCTCATGGGTGCTTCCTTTT-3' 序列中的下劃線為限制性內切酶Kpn I、Bgl II的酶切位點。該引物委托上海生
工生物工程技術服務有限公司合成。 然后，以促生拮抗菌M18基因組DNA為模板，利用DNA聚合酶LA Taq和設計的引 物，擴增吩嗪-1-羧酸生物合成的編碼基因，產物通過0. 7%瓊脂糖電泳檢測，回收長度約 為6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)，基因片段的準確性經核苷酸測序驗證。其中，所述M18基 因組DNA的制備利用AxyPr印細菌基因組DNA試劑盒進行，基因片段的回收利用AxyPr印 DNA凝膠回收試劑盒進行，均由愛思進生物技術(杭州)有限公司提供，產品目錄號分別為 AP-MN-BT-GDNA-4和AP-GX-50 ;所述基因擴增反應的條件以及瓊脂糖電泳，分別按照J.薩 姆布魯克、D.W.拉塞爾編著，2002年科學出版社出版的《分子克隆實驗指南(第三版)》，第 8章第611 618頁和第5章第387 400頁中所述的方法進行。其中，所使用的DNA聚合 酶LA Taq和基因擴增試劑盒，購自TAKARA公司上海代理公司，產品目錄號DRR002AG。瓊 脂糖購自GENE TECH公司上海代理公司。基因片段(phzAl-Gl)的核苷酸測序驗證委托上 海英駿生物技術有限公司完成。
2、構建重組質粒pME6032Phz 將步驟1中回收的基因擴增片段(phzAl-Gl)，經限制性內切酶Kpn I、 Bgl II酶 切，連接酶連接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達質粒pME6032，并將吩嗪-l-羧酸生物合 成編碼基因的表達置于強啟動子Pta。控制下，形成重組質粒pME6032Phz并轉化進入大腸桿 菌。最后，從大腸桿菌中提取構建的基因重組質粒pME6032Phz并驗證。
構建的基因重組質粒pME6032Phz如圖1所示，含有吩嗪_1_羧酸的生物合成編碼 基因的片段經限制性酶Kpn 1、Bgl 1I酶切后，插入質粒pME6032中，并置于強啟動子P^ 的控制下，構建成重組質粒pME6032Phz。圖中9816bp表示質粒pME6032的長度，為9816 個堿基對；phzAl-Gl為吩嗪-l-羧酸的生物合成編碼基因片段；phzM為上游修飾基因；〃 為基因縮短片段的符號；Kpn I、Bgl II為限制性內切酶位點；圖中的數字分別表示基因中
6的核苷酸序號，+1為phzAl-Gl生物合成編碼基因的轉錄起始位點。TetA和TetR為質粒 pME6032中的選擇標記基因；P^為啟動子；T4_32 term為終止子；pl5A origin為質粒的復 制起始位點；LacIQ r印ressor所標志的基因為阻遏蛋白編碼基因。 上述基因片段定向插入質粒、感受態大腸桿菌的制備、轉化以及重組質粒的提取 和驗證分別按照J.薩姆布魯克、D.W.拉塞爾編著，2002年科學出版社出版的《分子克隆實 驗指南(第三版)》，第1章第68 71頁和第96 99頁及第8章第663 666頁中所述 的方法進行。其中質粒pME6032由瑞士洛桑大學微生物學系Dieter Haas博士提供。限制 性內切酶和插入用的連接酶均購自深圳中晶生物技術有限公司。大腸桿菌中重組質粒的提 取，采用B型少量質粒快速提取試劑盒，由北京博大泰克生物基因技術有限責任公司提供， 產品目錄號MK014-2。重組質粒的驗證所使用的限制性酶、DNA聚合酶LA Taq和基因擴增 試劑盒，均購自TAKARA公司上海代理公司，產品目錄號DRR002AG。瓊脂糖購自GENE TECH 公司上海代理公司。 3、構建基因工程菌株M18G/pME6032Phz 制備促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞，并將上述重組質粒pME6032Phz 轉化到M18G的感受態細胞中，在28t:條件下，培養2天，從中篩選出基因工程菌株M18G/ pME6032Phz。 促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞的制備方法、重組質粒pME6032Phz 轉化到M18G的感受態細胞以及高效生產吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz 的篩選方法，均按照J.薩姆布魯克、D.W.拉塞爾編著，2002年科學出版社出版的《分子克 隆實驗指南(第三版)》，第1章第96 99頁中所述的方法進行。
4、基因工程菌株M18G/pME6032Phz的培養 將基因工程菌株M18G/pME6032Phz接種在甘油培養基平板上，在26。C下活化生 長24小時，然后再次在甘油培養基的平板上劃菌塊，26t:下活化10小時，然后，將活化的 M18G/pME6032Phz菌塊轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250毫升的三角瓶中，在 26t:的搖床中振蕩培養9小時，搖床轉速為160轉/分；最后轉接到含有65毫升黃豆粉培 養液、體積為250毫升的特殊三角瓶中，進行放大發酵培養，溫度和轉速不變，發酵時間為 60小時，在發酵液中，獲得吩嗪-1-羧酸含量為每升6200毫克。 其中，所述甘油培養基和甘油培養液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8%、 甘油1. 3%、硫酸鎂0. 07%、磷酸二氫鉀0. 03%、余量為水，pH7. 0。 所述黃豆粉培養液的組分重量百分比為黃豆粉4.5%、玉米漿1.4%、葡萄糖 1. 0%、余量為水，pH 6. 5。 在此配方下的吩嗪-l-羧酸產量，與促生拮抗菌的衍生菌株M18G的產量相比，提
高了約2.9倍。 實施例2 1、采用與實施例1相同的方法擴增吩嗪-l-羧酸生物合成的編碼基因，產物通過 1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。
2、將回收的基因擴增片段(phzAl-Gl)，經限制性內切酶Kpn 1、Bgl II酶切，連接 酶連接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達質粒pME6032，并將吩嗪-1-羧酸生物合成編碼 基因的表達置于強啟動子P^控制下，形成重組質粒pME6032Phz并轉化進入大腸桿菌。最
7后，從大腸桿菌中提取重組質粒并驗證。 3、制備促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞，并將上述重組質粒 pME6032Phz轉化到M18G的感受態細胞中，在3(TC條件下，培養1天，從中篩選出基因工程 菌株M18G/pME6032Phz。 4、將基因工程菌株M18G/pME6032Phz接種在甘油培養基的平板上，在28°C下活 化生長22小時，然后再次在甘油培養基的平板上劃菌塊，28t:下活化11小時，然后將活化 的M18G/pME6032Phz菌塊轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250毫升的三角瓶中，在 2『C的搖床中振蕩培養10小時，搖床轉速為170轉/分；最后轉接到含有65毫升黃豆粉培 養液、體積為250毫升的三角瓶中，進行放大發酵培養，溫度和轉速不變，發酵時間為66小 時，在發酵液中，得到吩嗪-1-羧酸含量為升每6600毫克。 其中，所述甘油培養基中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.2%、甘油1.7%、硫 酸鎂0. 05%、磷酸二氫鉀0. 01%、余量為水，pH 7. 2。 所述黃豆粉培養液的組分重量百分比為黃豆粉5.0%、玉米漿1.6%、葡萄糖 1. 2%、余量為水，pH 6. 8。 在此配方下的吩嗪-1-羧酸產量，相比促生拮抗菌的衍生菌株M18G，提高了約3. 1 倍。 實施例3 1、采用與實施例1相同的方法擴增吩嗪-l-羧酸生物合成的編碼基因，產物通過 1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。
2、將回收的基因擴增片段(phzAl-Gl)，經限制性內切酶Kpnl、Bgl II酶切，連接 酶連接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達質粒pME6032，并將吩嗪-1-羧酸生物合成編碼 基因的表達置于強啟動子P^控制下，形成重組質粒pME6032Phz并轉化進入大腸桿菌。最 后，從大腸桿菌中提取重組質粒并驗證。 3、制備促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞，并將上述重組質粒 pME6032Phz轉化到M18G的感受態細胞中，在32。C條件下，培養2天，從中篩選出高效生產 吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz。 4、將利用基因工程技術構建的工程菌株M18G/pME6032Phz，接種在甘油培養基的 平板上，在3(TC下活化生長20小時，然后再次在甘油培養基的平板上劃菌塊，3(TC下活化 12小時，然后將活化的M18G/pME6032Phz菌株轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250 毫升的三角瓶中放大，在3(TC的搖床中振蕩培養11小時，搖床轉速為180轉/分；最后轉 接到含有65毫升黃豆粉培養液、體積為250毫升的三角瓶中，進行放大發酵培養，溫度和轉 速不變，發酵時間為72小時，在發酵液中，得到吩嗪-1-羧酸產量為每升5700毫克。
其中，所述甘油培養基中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.0%、甘油1.5%、硫 酸鎂O. 1%、磷酸二氫鉀0. 05X、余量為水，pH6. 8 ; 所述黃豆粉培養液的組分重量百分比為黃豆粉5.5%、玉米漿1.7%、葡萄糖 1. 4%、余量為水，pH 7. 0。 在此配方下利用工程菌株M18G/pME6032Phz發酵生產吩嗪_1_羧酸，與促生拮抗 菌衍生菌株M18G的產量相比，提高了約2. 6倍。
實施例4
1、采用與實施例1相同的方法擴增吩嗪-l-羧酸生物合成的編碼基因，產物通過
1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。 2、將第a步驟中回收的基因擴增片段(phzAl-Gl)，經限制性內切酶KpnI、 Bgl II
酶切，連接酶連接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達質粒pME6032，并將吩嗪-l-羧酸生物
合成編碼基因的表達置于強啟動子Pta。控制下，形成重組質粒pME6032Phz并轉化進入大腸
桿菌。最后，從大腸桿菌中提取重組質粒并驗證。 3、制備促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞，并將上述重組質粒 pME6032Phz轉化到M18G的感受態細胞中，在35。C條件下，培養1天，從中篩選出高效生產 吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz。 4、將利用基因工程技術構建的工程菌株M18G/pME6032Phz，接種在甘油培養基的 平板上，在3(TC下活化生長20小時，然后再次在甘油培養基的平板上劃菌塊，3(TC下活化 12小時，然后將活化的M18G/pME6032Phz菌株轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250 毫升的三角瓶中放大，在28t:的搖床中振蕩培養11小時，搖床轉速為180轉/分；最后轉 接到含有65毫升黃豆粉培養液、體積為250毫升的三角瓶中，進行放大發酵培養，溫度和轉 速不變，發酵時間為72小時，在發酵液中，得到吩嗪-l-羧酸產量為每升6400毫克。;其中， 所述甘油培養基中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.0%、甘油1.5%、硫酸鎂0. 1%、磷 酸二氫鉀0. 05%、余量為水，pH6. 8 ; 所述黃豆粉培養液的組分重量百分比為黃豆粉5.0%、玉米漿1.7%、葡萄糖 1. 4X、余量為水，pH 6. 8。在此配方下利用工程菌株M18G/pME6032Phz發酵生產吩嗪-l-羧 酸，與促生拮抗菌衍生菌株M18G的產量相比，提高了約3. 0倍。
實施例5 1、采用與實施例1相同的方法擴增吩嗪-l-羧酸生物合成的編碼基因，產物通過 1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。
2、將第a步驟中回收的基因擴增片段(phzAl-Gl)，經限制性內切酶Kpn I、Bgl II 酶切，連接酶連接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達質粒pME6032，并將吩嗪-l-羧酸生物 合成編碼基因的表達置于強啟動子Pta。控制下，形成重組質粒pME6032Phz并轉化進入大腸 桿菌。最后，從大腸桿菌中提取重組質粒并驗證。構建的基因重組質粒pME6032Phz。
3、制備促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞，并將上述重組質粒 pME6032Phz轉化到M18G的感受態細胞中，在37。C條件下，培養1天，從中篩選出高效生產 吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz。 4、將利用基因工程技術構建的工程菌株M18G/pME6032Phz，接種在甘油培養基平 板上，在2『C下活化生長20小時，然后再次在甘油培養基的平板上劃菌塊，28t:下活化12 小時，然后將活化的M18G/pME6032Phz菌株轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250毫 升的三角瓶中放大，在3(TC的搖床中振蕩培養11小時，搖床轉速為180轉/分；最后轉接 到含有65毫升黃豆粉培養液、體積為250毫升的三角瓶中，進行放大發酵培養，溫度和轉速 不變，發酵時間為72小時，在發酵液中，得到吩嗪-l-羧酸產量為每升6000毫克。
其中，所述甘油培養基中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.0%、甘油1.5%、硫 酸鎂O. 1%、磷酸二氫鉀0. 05X、余量為水，pH6. 8 ; 所述黃豆粉培養液的組分重量百分比為黃豆粉4.8%、玉米漿1.5%、葡萄糖1. 4%、余量為水，pH 7. 0。 在此配方下利用工程菌株M18G/pME6032Phz發酵生產吩嗪_1_羧酸，與促生拮抗 菌衍生菌株M18G的產量相比，提高了約2. 8倍。
權利要求
一種利用工程菌株M18G攜帶質粒pME6032Phz生產吩嗪-1-羧酸的方法，其特征在于包括如下步驟1)設計一對引物，引物的核苷酸序列如下正向5’-ATATATGGTACCGCCAGCGAATAACCGATGCCGCGAGGGAA-3’反向5’-TGCGTAAGATCTCGATGGGTTCGCTCATGGGTGCTTCCTTTT-3’序列中下劃線為限制性內切酶Kpn I、Bal II的酶切位點；然后以促生拮抗菌M18基因組DNA為模板，利用DNA聚合酶LA Taq和設計的引物，擴增吩嗪-1-羧酸生物合成的編碼基因，擴增產物通過瓊脂糖電泳檢測，回收長度為6.8kb的基因片段phzA1-G1；2)將回收的基因擴增片段phzA1-G1，經限制性內切酶Kpn I、Bgl II酶切，連接酶連接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達質粒pME6032，并將吩嗪-1-羧酸生物合成編碼基因的表達置于強啟動子Ptac控制下，形成重組質粒pME6032Phz并轉化進入大腸桿菌；從大腸桿菌中提取構建的基因重組質粒pME6032Phz；3)制備促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受態細胞，并將上述基因重組質粒pME6032Phz轉化到M18G的感受態細胞中，在28～37℃條件下，培養1～2天，從中篩選出基因工程菌株M18G/pME6032Phz；4)將基因工程菌株M18G/pME6032Phz接種在甘油培養基的平板上，在26～30℃下，活化生長20～24小時，再次在甘油培養基的平板上劃菌塊，26～30℃下活化10～12小時，然后將活化的M18G/pME6032Phz菌塊轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250毫升的三角瓶中，在26～30℃的搖床中振蕩培養9～11小時，搖床轉速為160～180轉/分；最后轉接到含有65毫升黃豆粉培養液、體積為250毫升的三角瓶中，進行放大發酵培養，溫度和轉速不變，發酵時間為60～72小時，得到吩嗪-1-羧酸含量為每升5700～6600毫克；其中，所述甘油培養基和甘油培養液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸鎂0.05～0.1％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、余量為水，pH 6.8～7.2；所述黃豆粉培養液的組分重量百分比為黃豆粉4.5～5.5％、玉米漿1.4～1.7％、葡萄糖1.0～1.4％、余量為水，pH 6.5～7.0。
全文摘要
本發明涉及一種利用工程菌株M18G攜帶質粒pME6032Phz生產吩嗪-1-羧酸的方法，從促生拮抗菌M18基因組中擴增出吩嗪-1-羧酸生物合成的編碼基因片段phzA1-G1，并將該基因片段插入表達質粒pME6032中，置于強啟動子Ptac的控制下，構建成重組質粒pME6032Phz；然后將該重組質粒導入促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G中，構建成基因工程菌株M18G/pME6032Phz。該工程菌株在擴增吩嗪-1-羧酸生物合成編碼基因的拷貝數的同時，實現編碼基因的高效穩定表達。最后將基因工程菌株M18G/pME6032Phz在黃豆粉培養液中培養，高效穩定地生產吩嗪-1-羧酸，大幅提高吩嗪-1-羧酸的產量。利用本發明的高產基因工程菌株制備吩嗪-1-羧酸，其生產成本能達到應用于防治水稻紋枯病的農本要求，可用于殺菌劑申嗪霉素的制備，大規模地防治植物病害。
文檔編號C12R1/01GK101705265SQ20091019866
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月12日 優先權日2009年11月12日
發明者周泉, 許煜泉 申請人:上海交通大學