一種提高植物抗逆境能力的方法

一種提高植物抗逆境能力的方法
【專利摘要】本發明涉及一種提高植物抗逆境能力的方法。揭示一種對于提高植物抗逆境能力有用的方法，通過將楊樹CBL10多肽的編碼基因轉入植物中，進而提高植物的耐鹽性、耐熱性、耐干旱性，并促進植物生長、提高植物生物量。本發明的方法可應用于植物品種的改良。
【專利說明】一種提高植物抗逆境能力的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因技術和植物學領域，更特別地，本發明涉及鈣調神經素 B亞基類 似蛋白家族基因在植物中提高抗逆境能力的應用。

【背景技術】
[0002] 土壤的鹽漬化是一個世界性的資源問題和生態問題，它嚴重制約了現代農業的發 展。在我國所有的耕地中，鹽堿地面積約有1億畝，而中低產田高達10億畝，另外還有3億 畝鹽堿荒地可供人們開發和利用。大部分農作物與林木的耐鹽閾值低于0. 6%的鹽濃度，而 我國大面積的鹽堿地的含鹽量在1.0%左右。隨著現代社會的快速發展，人口不斷膨脹，環 境污染和生態惡化日益加劇，灌溉地區的次生鹽漬化土地面積也在逐年上升，造成農作物 產量銳減，引起了全世界的高度關注。長期以來人們一直在尋找解決的良策。隨著植物耐 鹽生理生化、分子生物學和基因組學研究的深入開展，科學家們逐漸確定了一部分植物在 耐鹽抗旱過程中起重要作用的蛋白，克隆了編碼它們的基因序列，并利用轉基因的手段使 某些耐鹽相關基因在植物體內過量表達，以使其獲得一定的耐鹽性。
[0003] 植物的耐鹽性是一個多基因控制的復雜性狀，其中涉及多種機制與信號通路共同 參與。涉及鹽脅迫的信號轉導過程比較復雜，往往還與干旱，冷凍以及氧化脅迫的信號途徑 相互交叉，因此對于非生物脅迫信號轉導途徑的解析一直是植物逆境研究領域中的熱點問 題。模式植物擬南芥中的SOS信號通路是植物響應鹽脅迫信號轉導方面的開創性工作。在 鹽脅迫下，過量的Na +使細胞質內的Ca2+濃度增加，激活了鈣結合蛋白S0S3, S0S3于是與 S0S2結合使其轉為活性狀態，暴露出催化部位而發揮激酶的功能，S0S2還被S0S3招募到質 膜附近，通過磷酸化作用激活了下游Na+/H +逆向轉運蛋白S0S1，從而提高了質膜Na+/H+逆 向轉運的能力，防止了 Na+在植物細胞內的過量積累。最近的研究表明，在單子葉禾本科的 水稻中也存在非常類似的SOS信號轉導途徑參與了水稻響應鹽脅迫反應過程。
[0004] 木本植物株型高大（涉及離子和營養物質長距離運輸），且一般是多年生（涉及次 生生長）。目前，人們對木本植物的耐鹽機理還知之甚少。另一方面，通過轉基因技術提高 林木耐鹽抗旱等抗逆性一直也是植物基因工程研究的難點之一，目前國內外成功的實例并 不多。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種提高植物耐鹽性的方法。
[0006] 在本發明的第一方面，提供一種提高植物抗逆境能力或制備抗逆境能力增強的轉 基因植物的方法，包括：將楊樹CBLlO多肽的編碼基因轉入到植物中。
[0007] 在一個優選例中，所述的楊樹CBLlO多肽選自：楊樹CBLlOA或楊樹PtCBLIOB。
[0008] 在另一優選例中，所述的楊樹CBLlOA包括：（a)如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列 的多肽；(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經過一個或多個（如1-20個；較佳地1-10 個；更佳地1-5個；更佳地1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a) 所述多肽的功能的由（a)衍生的多肽；（c)與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列同源性高于 70%(較佳地高于80%;更佳地高于90%;如95%，98%，99%)且具有（a)所述多肽的功能的由 (a)衍生的多肽；或
[0009] 所述的楊樹CBLlOB包括：（a'）如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的多肽；(b'） 將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經過一個或多個（如1-20個；較佳地1-10個；更佳地 1-5個；更佳地1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a'）所述多肽的 功能的由（a'）衍生的多肽；（c'）與SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列同源性高于70%(較 佳地高于80% ;更佳地高于90% ;如95%，98%，99%)且具有（a，）所述多肽的功能的由（a，） 衍生的多肽。
[0010] 在另一優選例中，所述的植物包括：木本植物或草本植物。
[0011] 在另一優選例中，所述的木本植物包括：楊柳科植物（如楊屬植物），桑科植物，桃 金娘科植物（如桉屬植物），松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科 植物，鍛樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物；或
[0012] 所述的草本植物包括：禾本科植物（如水稻、玉米、小麥），十字花科植物（如擬南 芥），茄科植物（如番茄）和豆科植物（如大豆）。
[0013] 在另一優選例中，所述的方法包括：
[0014] (1)將外源的楊樹CBLlO多肽的編碼基因轉入木本植物組織、器官或種子，獲得轉 化入所述基因的植物組織、器官或種子；和
[0015] (2)將步驟（1)獲得的轉入了所述基因的植物組織、器官或種子再生成植物。
[0016] 在另一優選例中，所述的方法包括：
[0017] (si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有外源的楊樹CBLlO多肽的 編碼基因；
[0018] (s2)將植物組織、器官或種子與步驟（si)中的農桿菌接觸，從而使外源的楊樹 CBLlO多肽的編碼基因轉入植物。
[0019] 在另一優選例中，所述的方法還包括：（S3)選擇出轉入了外源的楊樹CBLlO多肽 的編碼基因的植物組織、器官或種子；以及（s4)將步驟（s3)中的植物組織、器官或種子再 生成植物。
[0020] 在另一優選例中，所述的逆境包括：高鹽環境、熱環境、干旱環境、氧化環境、滲透 環境。
[0021] 在另一優選例中，所述的提高植物抗逆境能力包括：
[0022] 提高植物存活率；
[0023] 增加植物株高；
[0024] 增加植物生物量；
[0025] 促進植物生長。
[0026] 在本發明的另一方面，提供楊樹CBLlO多肽或其編碼基因的用途，用于提高植物 抗逆境能力。
[0027] 在一個優選例中，所述的楊樹CBLlO多肽選自：楊樹CBLlOA或楊樹PtCBLIOB。
[0028] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1、楊樹中兩個PtCBLlO核苷酸和氨基酸序列。
[0030] 圖2、楊樹中兩個PtCBLlO蛋白與PtSOS的序列比對。
[0031] 圖3、楊樹PtCBLlOA與PtCBLlOB的基因表達模式分析。⑷毛果楊中PtCBLlOA 與PtCBLlOB的基因表達；（B)銀中楊中PtCBLlOA與PtCBLlOB的基因表達；（C)PtCBLlOA 與PtCBLlOB基因在根部與地上部分的相對表達量，設定根中表達量的為l，Pt代表毛果楊， Pab代表銀中楊；(D)PtCBLlOA與PtCBLlOB受鹽誘導表達情況。
[0032] 圖4、楊樹PtCBLlOA與PtCBLlOB可以互補擬南芥突變體cbl 10地上部分鹽敏感表 型。擬南芥野生型植株、CbllO突變體與不同的互補植株在MSO(A)與含有60mM NaCl (B)、 120mM NaCl(C)三種培養基上的生長情況；(D)根長的統計結果；(E)鮮重的統計結果；D、E 兩圖為三次獨立試驗統計結果，誤差線代表SE ; (F)轉基因植株的RT-PCR分子鑒定
[0033] 圖5、PtCBLlOA與PtCBLlOB的亞細胞定位。（A)楊樹原生質體瞬時轉化的結果； (B)農桿菌注射煙草葉片瞬時表達的結果
[0034] 圖6、植物表達載體圖。
[0035] 圖7、轉基因楊樹的PCR檢測和⑶S染色檢測。（A) RT-PCR分析；(B)⑶S染色。LA 是PtCBLlOA轉基因植株的簡稱；LB是PtCBLlOB轉基因植株的簡稱。
[0036] 圖8、轉基因楊樹的耐鹽表型。WT為未轉基因對照株系，其余為轉基因株系。分別 用OmM NaCl (A)和IOOmM NaCl⑶處理六周大的楊樹，三周后拍照；（C)轉PtCBLlOA基因 的轉基因株系的相對表達量分析；(D)轉PtCBLlOB基因的轉基因株系的相對表達量分析； (E)株高的統計結果；(F)地上部鮮重的統計結果；E、F兩圖為三次獨立試驗統計結果，誤差 線代表SE，*表示在相同的處理條件下與對照株系相比t-test差異顯著（P〈0. 05)。
[0037] 圖9、將PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中組成型表達，顯著提高番爺的抗鹽性。 其中a，c，e為處理組，b，d為對照組。（a，b)處理前2苗齡大的番茄；（c) 200mM NaCl處理 1周；（d)為B的對照；（e) c中用淡水沖洗后恢復1周。WT為野生型，L19, LI, L2為三個不 同的轉基因株系。
[0038] 圖10、將PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中組成型表達，顯著提高番爺的抗旱性。 其中b，c為處理組，a，d為對照組。（a)處理前2周苗齡大的番茄；(b)控水9天后的表型； (c)為B中處理復水2天的表型；（d)為相當于C的苗齡的未控水處理的正對照（2周苗+9 天+2天）。WT為野生型，L19, LI, L2為三個不同的轉基因株系。
[0039] 圖11、將PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中組成型表達，顯著提高番爺的抗熱性。 其中b，c為處理組，a，d為對照組。（a)處理前2周苗齡大的番茄；(b)42°C高溫處理6小 時后在26°C恢復1天后的表型；（c)恢復2天后的表型；（d)為相當于C的苗齡的未控水處 理的正對照（2周苗+2天）。WT為野生型，L19, LI, L2為三個不同的轉基因株系。

【具體實施方式】
[0040] 本發明人經過廣泛的研究，揭示一種對于提高植物抗逆境能力有用的方法，通過 將楊樹CBLlO多肽的編碼基因轉入植物中，進而提高植物的耐鹽性、耐熱性、耐干旱性。本 發明的方法可極好地應用于植物品種的改良，為運用轉基因等分子育種技術培育植物新品 種提供了非常有價值的基因資源。
[0041] 本發明中，所述的植物（或作物）是適合進行基因轉化操作的植物，如各種農作 物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：雙子葉植物、單子葉植物、 或裸子植物。較佳地，所述的植物是木本植物或草本植物。
[0042] 本發明中，所述的"木本植物"指根和莖因增粗生長形成大量的木質部、而細胞 壁也多數木質化的堅固的植物；且所述的木本植物天然基因組中含有CBLlO多肽的編碼 基因。例如，所述的"木本植物"可以是：楊柳科（Salicaceae)、桑科（Moraceae)、桃金娘 科（Myrtaceae)、石松科（Lycopodiaceae)、（Selaginellaceae)、銀杏科（Ginkgoaceae)、 松科（Pinaceae)、蘇鐵科（Cycadaceae)、天南星科（Araceae)、毛莫科（Ranunculaceae)、 懸鈴木科（Platanaceae)、愉科（Ulmaceae)、胡桃科（Juglandaceae)、禪科（Betulaceae)、 稱猴桃科（Actinidiaceae)、錦奏科（Malvaceae)、梧桐科（Sterculiaceae)、鍛樹科 (Tiliaceae)、徑柳科（Tamaricaceae)、舊薇科（Rosaceae)、景天科（Crassulaceae)、 蘇木科（Caesalpinaceae)、蝶形花科（Fabaceae)、石植科（Punicaceae)、拱桐科 (Nyssaceae)、山萊英科（Cornaceae)、八角諷科（Alangiaceae)、衛矛科（Celastraceae)、 冬青科（Aquifoliaceae)、黃楊科（Buxaceae)、大戟科（Euphorbiaceae)、小盤木科 (Pandaceae)、鼠李科（Rhamnaceae)、葡萄科（Vitaceae)、漆樹科（Anacardiaceae)， 撤攬科（Burseraceae)、梧梗科（Campanulaceae)、紅樹科（Rhizophoraceae)、檀香科 (Santalaceae)、木渾科（Oleaceae)或玄參科（Scrophulariaceae)的植物。
[0043] 作為本發明的優選方式，所述的木本植物是指楊柳科（如楊屬，更特別如楊樹）或 桑科（如構樹屬，更特別如光葉楮）、桃金娘科（如桉屬，更特別如桉樹）的木本植物。
[0044] 本發明中，所述的"草本植物"是一類植物的總稱，其植物體木質部較不發達 至不發達，莖多汁，較柔軟。例如，所述的"草本植物"可以是：禾本科（Gramineae)， 露兜樹科（Pandanaceae)，黑三棱科（Sparganiaceae)，水雍科（Aponogetonaceae)， 眼子菜科（Potamogetonaceae)，茨藻科（Najadaceae，冰沼草科（Scheuchzeriaceae)， 澤瀉科（Alismataceae)花蔚科（Butomaceae)，水瞥科（Hydrocharitaceae)，霉草 科（Triuridaceae)，莎草科（Cyperaceae)，掠桐科（模柳科）（Palmae (Arecaceae))， 天南星科（Araceae)，浮萍科（Lemnaceae)，須葉藤科（Flagellariaceae)，帚燈草 科（Restionaceae)，刺鱗草科（Centrolepidaceae)，黃眼草科（Xyridaceae)，谷精 草科（Eriocaulaceae)，鳳梨科（Bromeliaceae)，鴨妬草科（Co_elinaceae)，雨久 花科（Pontederiaceae)，田蔥科（Philydraceae)，燈心草科（Juncaceae)，百部科 (Stemonaceae)，百合科（Liliaceae)，石蒜科（Amaryllidaceae)，茜 If 薯科（箭根薯 科）（Taccaceae)，暮葡科（Dioscoreaceae)，鸞尾科（Iridaceae)，色蓮科（Musaceae)， 姜科（Zingiberaceae)，美人蓮科（annaceae)，竹芋科（Marantaceae)，水玉替科 (Burmanniaceae)或蘭科的植物。
[0045] 作為本發明的優選方式，所述的草本植物是：茄科植物，例如茄科茄屬的番茄。
[0046] 本發明中，"轉基因"，系指通過任何方法導入植物個體一段外源的雙鏈脫氧核糖 核苷酸（DNA)片段，可以是游離在染色體外，也可以整合到受體植物染色體的基因組上；可 以通過生殖過程傳遞到后代，也可以不傳遞到后代。外源基因可以從生物基因組中克隆，也 可以人工合成或用PCR在體外擴增。
[0047] 本發明還包括楊樹CBLlO多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片 段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的楊樹CBLlO多肽相同的生物學功能或 活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個或多個保守或非保守 性氨基酸殘基（優選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以 是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多 肽，或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前導序列或分泌序列 或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根據本文的定義這些片段、衍生物 和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
[0048] 在本發明中，術語"楊樹CBLlO多肽"指具有提高植物抗逆境能力的SEQ ID NO:2 序列（楊樹CBL10A)或SEQ ID N0:4序列（楊樹CBL10B)的多肽。該術語還包括具有提高 植物抗逆境能力的、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4序列的變異形式。這些變異形式包括（但 并不限于）：若干個（通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更 佳如1-8個或1-5個）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或 缺失一個或數個（通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內）氨基酸。例 如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又 比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術 語還包括楊樹CBLlO多肽的活性片段和活性衍生物。
[0049] 多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突 變體、在高或低的嚴緊度條件下能與楊樹CBLlO多肽DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發 明還提供了其他多肽，如包含楊樹CBLlO多肽或其片段的融合蛋白。
[0050] "楊樹CBLlO多肽保守性變異多肽"指與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4的氨基酸序 列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相 似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換 而產生。
[0051] 表 1
[0052]

【權利要求】
1. 一種提高植物抗逆境能力或制備抗逆境能力增強的轉基因植物的方法，其特征在 于，包括：將楊樹CBL10多肽的編碼基因轉入到植物中。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的楊樹CBL10多肽選自：楊樹CBL10A或 楊樹 PtCBLIOB。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的楊樹CBL10A包括：（a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨 基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)所述多肽的功能的由（a)衍生的多肽； (c)與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列同源性高于70%且具有（a)所述多肽的功能的由（a) 衍生的多肽；或 所述的楊樹CBL10B包括：(a'）如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的多肽；(b'）將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具 有（a'）所述多肽的功能的由（a'）衍生的多肽；（c'）與SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列 同源性高于70%且具有（a'）所述多肽的功能的由（a'）衍生的多肽。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括：木本植物或草本植物。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的木本植物包括：楊柳科植物，桑科植 物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科植物，椴 樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物；或 所述的草本植物包括：禾本科植物，十字花科植物，茄科植物和豆科植物。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括： (1) 將外源的楊樹CBL10多肽的編碼基因轉入木本植物組織、器官或種子，獲得轉化入 所述基因的植物組織、器官或種子；和 (2) 將步驟（1)獲得的轉入了所述基因的植物組織、器官或種子再生成植物。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，包括： (si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有外源的楊樹CBL10多肽的編碼 基因； (s2)將植物組織、器官或種子與步驟（si)中的農桿菌接觸，從而使外源的楊樹CBL10 多肽的編碼基因轉入植物。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的逆境包括：高鹽環境、熱環境、干旱環 境、氧化環境、滲透環境。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提高植物抗逆境能力包括： 提高植物存活率； 增加植物株高； 增加植物生物量； 促進植物生長。
10. 楊樹CBL10多肽或其編碼基因的用途，其特征在于，用于提高植物抗逆境能力。
11. 如權利要求10所述的用途，其特征在于，所述的楊樹CBL10多肽選自：楊樹CBL10A 或楊樹PtCBLIOB。
【文檔編號】C12N15/29GK104278040SQ201310293835
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2013年7月12日
【發明者】張洪霞, 唐仁杰, 楊陽 申請人:中國科學院上海生命科學研究院