重組微生物的制作方法

專利名稱：：重組微生物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于產生有用的蛋白質或多肽的重組微生物，以及產生蛋白質或多肽的方法。
背景技術：
：使用微生物在工業上生產有用的物質被用于大范圍的物質，其類型包括食品，例如酒精飲料、大豆醬和醬油，以及氨基酸、有機酸、核酸相關物質、抗生素物質、碳水化合物、脂質、蛋白質等。這些物質的應用還擴展至更寬的領域，包括食品、藥品、洗滌劑、日用品例如化妝品，以及多種化學原料。關于這種通過微生物在工業上生產有用物質，一個重要的挑戰是提高生產率，并且作為其措施，已經進行了通過遺傳技術例如突變來培育生產性微生物。近年來，具體地，微生物遺傳學和生物技術的進展已經使人們可以使用遺傳重組技術和類似技術來更有效地培育生產性微生物。另外，近年來基因組分析技術的迅速進展使得能夠嘗試解讀目標微生物的基因組數據，并且更積極地在工業上利用獲得的信息。其基因組數據已公開的工業上有用的宿主微生物的實例包括枯草桿菌(5ac說wsSM&z7fs)Marburg168(非專利文獻1)、大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)K-12MG1655(非專利文獻2)、粒狀棒狀桿菌(Coiynebacteriumglutamicum)ATCC132032等等，并且已經使用這些基因組數據開發了進一步改良的微生物菌株。然而，盡管進行了這些努力，生產效率未必能令人滿意。對于某些類型的微生物，近年來已經構建了其中與芽孢形成早期相關的基因已被缺失或滅活的菌株，從而正在獲得提高蛋白質或多肽的生產率的效果。例如，已有報道稱，通過使用其中枯草桿菌的sigE基因、sigF基因、spoI正基因、spoIISB基因或sigG基因、或者從spoIVCB基因延伸至spoIIIC基因的區中包括的一組基因已缺失的宿主株，增加纖維素酶和類似物的分泌的生產率(專利文獻l)。此外，在枯草桿菌中操縱蛋白質易位系統的功能(Sec路線)由SecA分擔，其作用是作為將分泌的蛋白質排出至細胞外部的發動機，并且三種蛋白質，SecY、SecE和SecG構成易位(translocation)0通道(分泌的蛋白質經過此通道)的主要部分，以及SecDF是易位通道的輔因子，等等。尤其是，已報道有能夠過度表達編碼SecG蛋白質的secG基因的表達載體(專利文獻2)，或者其中已通過改變SecG基因的核糖體結合位點來改變secG基因的表達的革蘭氏陽性細菌(專利文獻3)。由此，顯示出在產生外源蛋白質期間SecG基因被破壞的枯草桿菌種屬的繁殖受到抑制。也有報道稱，在大腸埃希桿菌中，secY基因的變異抑制低溫下的繁殖或蛋白質的分泌(非專利文獻3)。然而，目前為止，過度表達secY基因、并且芽孢形成相關基因缺失或滅活的微生物還是未知的。JP-A-2003-47490JW-A-2001-510046US-A-2003/0157642Nature,3卯，249,1997Science,277,1453，1997Cell,32，789，1983。
發明內容本發明具有以下幾個方面。(1)一種重組微生物，其通過將對所需的蛋白質或多肽進行編碼的基因轉染到微生物株中而獲得，所述微生物株通過如下方法獲得以遺傳方式構建成過度表達枯草桿菌的secY基因或與所述secY基因對應的基因，并使選自芽孢形成相關基因和與所述芽孢形成相關基因對應的基因中的一種或多種基因從基因組中缺失或滅活。(2)—種產生如權利要求1所述的重組微生物的方法，其包括在微生物中，將在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點，導入至枯草桿菌的secY基因或與所述secY基因對應的基因的基因組的上游，或者導入至含有枯草桿菌的secY基因或對應基因的基因組上的操縱子的先導基因的上游；或者導入一基因片段，其中，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點連接在枯草桿菌的secY基因或與所述secY基因對應的基因的上游；使選自芽孢形成相關基因和與所述芽孢形成相關基因對應的基因的一種或多種基因缺失或滅活；和將對所需的蛋白質或多肽進行編碼的基因轉染到微生物株中。(3)—種使用重組微生物產生所需的蛋白質或多肽的方法。圖1是顯示使用通過SOE-PCR法制備的結合核酸片段的基因轉染的示意圖。圖2是說明在枯草桿菌中芽孢形成信號轉導的圖。圖3是顯示通過SOE-PCR制備用于產生secY表達增強的菌株的DNA片段的方法的示意圖。圖4是顯示使用SOE-PCR片段通過雙交換(doublecrossover)法使目標基因缺失的示意圖。具體實施例方式最佳實施方式本發明涉及蛋白質或多肽生產率提高的微生物，以及使用該微生物產生所需的蛋白質或多肽的方法。本發明的發明人已經在微生物基因組上編碼的多種基因當中搜索了影響有用的蛋白質或多肽的產生的基因，并發現，當對所需的蛋白質或多肽進行編碼的基因被轉染到其中枯草桿菌secY基因已被增強以過度表達枯草桿菌的SecY、以及芽孢形成相關基因被調控的微生物株中時，與改變之前的生產率相比，所需蛋白質或多肽的生產率提高。本發明的重組微生物對所需的蛋白質或所需的多肽具有很高的生產率。因此，當使用該重組微生物進行所需蛋白質或所需多肽的生產時，可以減少生產物質所需的時間或成本。本發明中的氨基酸序列和堿基序列的同一性通過Lipman-Pearson法(Science,227，1435(1985))計算。具體地，同一性通過使用遺傳數據處理軟件Genetyx-Win(SoftwareDevelopmentCo.,Ltd.)的同源性分析程序(同源性搜索)執行分析來計算，比較的單位大小(ktup)設定為2。在本說明書中，轉錄起始控制區是包括啟動子和轉錄起始點的區，核糖體結合位點是與Shine-Dalgamo(SD)序列對應的位點，上述Shine-Dalgamo(SD)序列與起始密碼子一起形成翻譯起始控制區(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71，1342(1974))。根據本發明，術語基因的上游和下游不是指關于復制起始點的位置，而是上游表示接著目的基因或區的5'-端的區，而下游表示接著目的基因或區的3'-端的區。用于構建本發明的微生物的親代微生物可以是具有枯草桿菌secY基因或與其對應的基因的任意微生物，并且這些微生物可以是野生型微生物以及突變的微生物。具體地，可以是芽孢桿菌屬的細菌、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)屬的細菌、酵母或類似微生物，并且其中優選芽孢桿菌屬細菌。而且，從下列角度來看更優選枯草桿菌微生物的全部基因組信息已被披露，由此構建了遺傳工程和基因組工程的相關技術，并且該微生物具有分泌和產生蛋白質至細菌細胞外部的能力。本說明書所述的枯草桿菌的各種基因和基因區的名稱均基于在Nature,390,249-256(1997)中報道、并且在日本站點JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BSORFDB)(2004年3月10日更新的1^://^(^11118#11011^.&(1.1/)上在互聯網中公布的枯草桿菌基因組數據進行描述。本發明的枯草桿菌secY基因是指具有SEQIDNO:1所示的堿基序列的基因。與枯草桿菌secY基因對應的基因是指功能與枯草桿菌secY基因基本相同的基因，例如，可以是主要通過基因組分析鑒定的各secY基因，以及在地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、Oceanobacillusiheyensis等中編碼SecY蛋白質的基因。此外，有許多情況下，在微生物諸如炭疽芽孢桿菌中鑒定出兩種類型的相應基因。作為與枯草桿菌secY基因對應的基因，可以是下列(1)至(4)的基因的任意者。(1)包括如下DNA的基因與SEQIDNO:l所示的堿基序列的同一性為至少90%、優選至少95%、且更優選至少99%，并且編碼與具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質功能相當的蛋白質。(2)包括如下DNA的基因在嚴格條件下與包括與SEQIDNO:1所示的堿基序列互補的堿基序列的DNA雜交，并且編碼與具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質功能相當的蛋白質。另外，對于本文所用的"嚴格條件"，可以是，例如，分子克隆-實驗手冊第三版(MolecularCloning-ALABORATORYMANUALTHIRDEDITION)[JosephSambrook,DavidW.Russell,ColdSpringHarborLaboratoryPress]中所述的方法，例如，可以是如下雜交條件在含6xSSC(lxSSC的組成0.15M氯化鈉，0.015M擰檬酸鈉，pH7.0)、0.5%SDS、5xDenhardts和1.00mg/mL鯡精(herringsperm)DNA的溶液中，與探針一起在65'C下保持恒溫8-16小時。(3)包括如下DNA的基因編碼與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的同一性為至少卯％、優選至少95%、且更優選至少99%的氨基酸序列，并且編碼與具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質功能相當的蛋白質。(4)包括如下DNA的基因編碼在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個或兩個或更多個氨基酸的氨基酸序列，并且編碼與具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質功能相當的蛋白質。另外，如本文用，在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個或兩個或更多個氨基酸的氨基酸序列包括缺失、置換或添加一個或數個、優選1-10個氨基酸的氨基酸序列，并且所述添加包括在氨基酸序列的兩個末端上添加一個至數個氨基酸。另外，與具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質功能相當的蛋白質是指功能與secY基因編碼的蛋白質基本相同、并且能夠構成分泌的蛋白質所通過的易位通道的重要部分的蛋白質。術語枯草桿菌secY基因或與secY基因對應的基因的過度表達表示觀察到在枯草桿菌secY基因或與secY基因對應的基因的宿主中表達的量超過通常的表達量。用于過度表達枯草桿菌secY基因或與secY基因對應的基因的方式的實例包括將在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點，導入至枯草桿菌的secY基因或與secY基因對應的基因在基因組中的上游，或者導入至含有枯草桿菌的secY基因或與secY基因對應的基因的基因組上的操縱子的先導基因的上游；或者導入一基因片段，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點連接在枯草桿菌的secY基因或與secY基因對應的基因的上游。在此，在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點不特別地限制，只要該區是在用作宿主的微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點即可，但優選，例如，位于枯草桿菌spoVG基因或aprE基因或與這些基因的任意者對應的基因的上游的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點，并且更優選位于枯草桿菌spoVG基因或與spoVG基因對應的基因的上游的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點。作為枯草桿菌spoVG基因的轉錄起始控制區，可以是用于控制spoVG基因轉錄的區，spoVG基因是在JAFAN:JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BSORFDB)的互聯網站點(2004年3月10日更新的http://bacillus.genome.ad.jp/)中作為GeneNo.BG10112公開的基因。更具體地，可以是具有由SEQIDNO:9所示的堿基序列的38號堿基至210號堿基的堿基序列的DNA，或者包括與上述堿基序列同源的堿基序列、并且具有枯草桿菌spoVG基因的轉錄起始控制區的功能的DNA。此外，作為枯草桿菌spoVG基因的轉錄起始控制區-核糖體結合位點，可以是包括具有由SEQIDNO:9所示的堿基序列的38號堿基至230號堿基的堿基序列的DNA，或者包括與上述堿基序列同源的堿基序列、并且具有枯草桿菌spoVG基因的轉錄起始控制區-核糖體結合位點的功能的DNA。與由SEQIDNO:9所示的堿基序列的38號堿基至210號堿基的堿基序列同源的堿基序列或與由SEQIDNO:9所示的堿基序列的38號堿基至230號堿基的堿基序列同源的堿基序列的實例包括(A)包括與如下DNA在嚴格條件下雜交的DNA的堿基序列上述DNA包括與由SEQIDNO:9所示的堿基序列的38號堿基至210號堿基或38號至230號堿基的堿基序列互補的堿基序列；(B)與由SEQIDNO:9所示的堿基序列的38號堿基至210號堿基或38號堿基至230號堿基的堿基序列的同源性為至少卯％、優選至少95%、且更優選至少99%的堿基序列；和類似序列。另外，在此使用的術語"嚴格條件"可以如上所述的相同條件作為例子。術語"具有枯草桿菌spoVG基因的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的功能"表示當具有功能的DNA被導入至枯草桿菌secY基因或與secY基因對應的基因的上游，或導入至含有枯草桿菌secY基因或對應基因的基因組上的操縱子(枯草桿菌rpsJ基因)的先導基因的上游時，secY基因或與secY基因對應的基因被過度表達，從而導致所需的蛋白質或多肽的生產率提高，并且提高的程度還與在下列情況下獲得的提高相同其中枯草桿菌spoVG基因的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點被導入至枯草桿菌secY基因或與secY基因對應的基因的上游，或導入至含枯草桿菌secY基因或對應基因的基因組上的操縱子(枯草桿菌rpsJ基因)的先導基因的上游。轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點導入至secY基因或與secY基因對應的基因在基因組上的上游，或導入至含有枯草桿菌secY基因或對應基因的基因組上的操縱子(枯草桿菌rpsJ基因)的先導基因的上游，包括部分或全部地置換枯草桿菌secY基因或與secY基因對應的基因或含有枯草桿菌secY基因或對應基因的基因組上的操縱子的初始轉錄起始控制區，以及插入并同時保留初始轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點。轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的置換可以例如使用涉及同源重組的已知方法來進行。即，首先，通過已知的方法例如SOE(重疊延伸拼接，splicingbyoverlapextension)-PCR法(Gene,77，61，1989)，在含有該轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的DNA片段的上游，連接含有含secY基因的操縱子的初始轉錄起始控制區的上游區的DNA片段，以及藥物抗性基因片段，而在前述基因片段的下游，連接含有部分或全部的rpsJ基因的轉錄起始控制區和結構基因區(其為含有secY基因的操縱子的先導基因)，或者連接含有部分或全部的ipsJ基因的結構基因區的DNA片段。以這種方式，獲得DNA片段，其中含有含secY基因的操縱子的初始轉錄起始控制區的上游區的DNA片段、藥物抗性基因片段、含目標轉錄起始控制區或目標轉錄起始控制區結合核糖體的位點的DNA片段、以及含有部分或全部的rpsJ基因的轉錄起始控制區和結構基因區或含有部分或全部的rpsJ基因的結構基因區的DNA片段以該順序連接。接下來，當通過已知方法將該DNA片段轉染到親代微生物中時，在親代微生物基因組的兩點處發生雙交換同源重組，例如在含secY基因的操縱子的初始轉錄起始控制區的上游區，以及包括部分或全部的rpsJ基因的轉錄起始控制區和結構基因區或包括部分或全部的rpsJ基因的結構基因區的區。結果，可以使用藥物抗性基因作為標記物分離出如下轉化體其中初始轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點被目標轉錄起始控制區或目標轉錄起始控制區-核糖體結合位點置換。以這種方式，導入至基因組上含secY基因的操縱子的上游的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點可以穩定地得以遺傳保留。另外，作為用轉染用DNA片段轉染宿主微生物的已知方法，特別地可以是感受態細胞轉化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))、原生質體轉化法(Mol.Gen.Genet.168，111(1979))、電穿孔法(FEMSMicrobiol.Lett.55，135(1990))等，特別優選感受態細胞轉化法。具體地，在使用枯草桿菌作為本發明的宿主微生物的情況下，可使用Mol.Gen.Genet.，223,268(19卯)中所述的方法或類似方法，通過同源重組，進行從含secY基因的操縱子的初始轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點到目標轉錄起始控制區或目標轉錄起始控制區-核糖體結合位點的置換。如果適當地選擇要插入到需要插入的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的兩個末端的DNA片段的序列，可以通過如上述置換方法相同的方法，進行目標轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的插入。例如，在該轉錄起始控制區的上游，連接含有含secY基因的操縱子的初始轉錄起始控制區的上游區的DNA片段，以及藥物抗性基因，而在該轉錄起始控制區的下游，連接含有部分或全部的初始轉錄起始控制區的DNA片段。以這種方式，獲得DNA片段，其中含有含secY基因的操縱子的初始轉錄起始控制區的上游區的DNA片段、藥物抗性基因片段、目標轉錄起始控制區、以及含有部分或全部的初始轉錄起始控制區的DNA片段以該順序連接。隨后，將該DNA片段插入至宿主微生物中，然后可以使用藥物抗性基因作為標記物分離出轉化體。在由此分離的轉化體的基因組上，含secY基因的操縱子的初始轉錄起始控制區和目標轉錄起始控制區可以穩定地保留，同時二者相互鄰接，其間沒有任何空隙。另外可選地，當制備和使用其中含secY基因的上游區的DNA片段和藥物抗性基因連接在目標轉錄起始控制區的上游、而含部分或全部的secY基因的DNA片段連接在目標轉錄起始控制區的下游的DNA片段時，目標轉錄起始控制區可以穩定地保留，同時立即被導入至secY基因的上游。根據本發明，導入有在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的基因組的上游包括secY基因。上游不受特別的限制，只要該區在rpsJ基因(其為操縱子先導基因)的起始密碼子的上游側，或secY基因的起始密碼子的上游側即可，但優選為包括2000個相鄰堿基對的區，更優選包括500個堿基對的區，再更優選包括100個堿基對的區，再更優選包括50個堿基對的區。根據本發明，使用通過將目標轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的片段與secY基因或與secY基因對應的基因的片段連接獲得的基因片段，可以進行其中目標轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點連接在secY基因或與secY基因對應的基因的上游的基因片段的導入，上述片段已經通過已知的克隆方法獲得，例如使用PCR法，使用枯草桿菌以外的微生物的基因組作為模板，通過已知方法例如限制性內切酶法或SOE(重疊延伸拼接)-PCR法(Gene,77,61(1989))而獲得。可以根據已知的轉化方法，通過在導入至細胞中的核酸片段與染色體之間的同源重組，可以將這些片段導入染色體。要導入的secY基因或與secY基因對應的基因的堿基序列可以與微生物原始具有的secY基因或與該secY基因對應的基因的堿基序列不一致，只要它是secY基因或與secY基因對應的基因的堿基序列即可。此外，要導入的在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點(例如枯草桿菌spoVG基因的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點)的堿基序列，可以與微生物所具有的堿基序列不一致，只要它是目標堿基序列即可。將核酸片段導入至宿主中的方法的例子可以是感受態細胞轉化法、原生質體轉化法、電穿孔法等，并且特別優選感受態細胞轉化法。此外，這些片段也可以通過載體例如質粒導入至細胞質中。另外，如稍后所述的實施例中所示，由于在通過質粒的方式導入時，通過每個細菌細胞導入一個拷貝，這些片段對于所需蛋白質或多肽的產生發揮充分的效應，因此即使在生產和培養期間一些質粒丟失也幾乎不影響該片段。另外，至于允許導入在宿主中的染色體區，優選非必需基因的內在部分、或非必需基因上游的非基因區的內在部分。例如，可以是aprE基因、sacB基因、nprE基因、amyE基因和ybxG基因的內在部分，或這些基因上游的非基因區的內在部分，但優選amyE基因的內在部分、或ybxG基因上游的非基因區的內在部分。如本文所用，術語"非必需基因"是指即使當該基因被破壞時，至少在特定條件下具有該基因的宿主仍能存活的基因。另外，即使導入伴隨著非必需基因的缺失，或部分或全部的非必需基因上游的非基因區的缺失，仍不會由此產生任何問題。根據本發明，枯草桿菌的secY基因或與secY基因對應的基因的過度表達，以及與枯草桿菌的Sec途徑相關的另一基因(例如，secE基因等)的過度表達可以在不影響所需蛋白質或多肽的生產率的提高的范圍內進行，并且一種或兩種或多種基因的滅活或缺失也可以并行地實現。另外，基因的滅活或缺失包括基因中的部分或全部堿基的置換和缺失，以及將堿基插入至基因中。下文將更詳細地說明使用根據SOE(重疊延伸拼接)-PCR法(Gene，77,61(1989))制備的DNA片段，通過雙交換的方式將其中spoVG基因的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點連接在secY基因上游的基因片段導入至宿主基因組的方法。然而，根據本發明的導入方法并無意于局限于以下方法。用于本發明方法中的導入用DNA片段是如下的DNA片段其中在鄰近宿主基因組上的導入位點上游的大小為大約0.1-3kb、優選0.4-3kb的片段(下文中稱為片段(l))和鄰近導入位點下游的大小為大約0.1-3kb、優選0.4-3kb的片段(下文中稱為片段(2))之間，以如下順序插入有含有spoVG基因的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點的片段(下文中稱為片段(3))、secY基因片段(下文中稱為片段(4))、和藥物抗性標記基因例如氯霉素抗性基因的片段(下文中稱為片段(5))。首先，在第一輪PCR中制備片段(1)至片段(5)的5個片段。這時，使用如下設計的引物例如，片段(3)上游側上的10-30個堿基對的序列加入至片段(1)的下游端，片段(3)下游側上的10-30個堿基對的序列加入至片段(4)的上游端，片段(5)上游側上的10-30個堿基對的序列加入至片段(4)的下游端，并且片段(5)下游側上的10-30個堿基對的序列加入至片段(2)的上游(圖l)。隨后，使用在第一輪中制備的5種類型的PCR片段作為模板，并使用位于片段(1)上游的引物和位于片段(2)下游的引物進行第二輪PCR。從而，片段(3)在加入至片段(1)下游端的片段(3)的序列中發生退火，片段(3)在加入至片段(4)上游端的片段(3)的序列中發生退火，片段(5)在加入至片段(4)下游端的片段(5)的序列中發生退火，并且片段(5)在加入至片段(2)上游的片段(5)的序列中發生退火。由此，作為PCR擴增的結果，可以得到其中片段(l)至片段(5)的五個片段以(1)、(3)、(4)、(5)和(2)的順序連接的DNA片段(圖1)。在此進行的PCR反應可以在文獻(PCRProtocols.CurrentmethodsandApplications,B.A.White主編，HumanaPress,pp.251,1993;Gene,77,61(1989))中所述的常規條件下，使用表1所示的引物組，并使用常規PCR用酶試劑盒例如PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzoCo.，Ltd.)而有利地進行。當由此獲得的轉染用DNA片段通過感受態法或類似方法轉染到細胞中時，在細胞內，在基因組上導入位點的上游和下游存在同一性的同源區中發生基因重組，并且通過基于藥物抗性標記物的選擇，可以分離出用如下基因片段轉染的細胞其中SPOVG基因的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合位點連接在secY基因的上游。基于藥物抗性標記物的選擇可以通過以下方法有利地進行分離在含氯霉素的瓊脂培養基上生長的集落，然后選擇基因組上的導入通過PCR法使用該基因組作為模板而得到確認的細胞，等等。另外，藥物抗性標記基因不受特別的限制，只要它可以用于使用通用的抗生素物質的選擇即可，但除氯霉素抗性基因以外，還可以是例如紅霉素抗性基因、新霉素抗性基因、壯觀霉素(spectinomycin)抗性基因、四環素抗性基因和滅瘟素S抗性基因的藥物抗性標記基因。在本發明的重組微生物中，除了由secY基因增強引起的SecY過度表達以外，還實現了從基因組中使一種或多種芽孢形成相關基因和與其對應的基因缺失或滅活。如實施例2和3所示，基因的缺失或滅活是抑制芽孢形成的變化。根據本發明，芽孢形成相關基因的實例包括加速芽孢形成的多組基因，由此這些基因的每一種的缺失或滅活導致芽孢形成的過程基本上被抑制，例如，編碼對芽孢形成各期有特異性的sigma因子的一組基因，或者與sigma因子基因的表達和sigma因子的活化相關的一組基因。此外，還包括由相應的sigma因子轉錄并且參與加速芽孢形成的一組基因。在芽孢桿菌屬細菌中，對于枯草桿菌，己經鑒定出17種sigma因子，并且已知存在有如下sigma因子從SigA開始，SigA是參與營養生長期中生長所必需的基因的轉錄的主要sigma因子(看家sigma因子)，SigH、SigF、SigE、SigG和SigK是控制芽孢形成過程的sigma因子，SigD是控制鞭毛形成或細胞壁消化的sigma因子，SigL是控制某些類型氨基酸或糖的代謝的sigma因子，SigB是控制對環境變化的響應的sigma因子，稱為ECFsigma因子的sigma因子等(BacillussubtilisandItsClosestRelatives:FromGenestoCells,A丄.Sonenshein主編，AmericanSocietyforMicrobiology,289頁(2002))。其中，己知控制芽孢形成過程的sigma因子根據芽孢形成過程的進程而相繼地表達和活化，如圖2所示。換句話說，當枯草桿菌進入營養饑餓狀態時，首先經由涉及多種蛋白質的多級磷酸鹽轉導系統(稱為磷酸中繼系統)發生SpoOA(其為芽孢形成起始控制因子)的磷酸化(Cell,64,545(1991))。更具體地，由于營養饑餓導致細胞質中存在的KinA以及細胞膜中存在的KinB和KinC發生自磷酸化，并且磷酰基經由SpoOF和SpoOB轉移至SpoOA，從而產生磷酸化的SpoOA(磷酸化SpoOA)。此外，在涉及KinB的芽孢形成過程的活化過程中需要KapB(Mol.Microbiol.，26，1097(1997))，同時KipA與KipI(其為KinA的自磷酸化抑制劑)結合，以避免其芽孢形成抑制作用(GenesDev.,11，2569(1997))。另外，PhrA抑制RapA的功能，RapA是磷酸化SpoOF的去磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,8612(1997))。KinA、KinB、KinC、SpoOF、Spo0B、Spo0A、KapB、Kipl、KipA、RapA和PhrA分別由基因kinA、kinB、kinC、spo0F、spoOB、spo0A、kapB、kipl、kipA、rapA和phrA編碼。伴隨著磷酸化SpoOA濃度的增加，抑制SigH的結構基因(sigH)表達的阻抑物AbrB的誘導受到抑制，因此，sigH的轉錄以依賴于SigA的方式被誘導(J.Bacterio1.，173,521(1991))。另外，在磷酸化SpoOA轉錄調節功能被參與染色體分離的Soj抑制的同時，也參與染色體分離的SpoOJ抑制Soj的該作用(J.Bacteriol.，182,3446，2000)。Soj和Spo0J分別由soj基因和spoOJ基因編碼。在SigH活化后，不對稱隔膜的形成將枯草桿菌的細胞質分隔為母細胞側和子細胞側。隨后，在子細胞側，磷酸化SpoOA和SigH接合，以誘導含有SigF的結構基因(sigF)的操縱子(spoIIAA-spoIIAB-sigF)的表達(Gene，101，113(1991)),并且在母細胞側，磷酸化Spo0A和SigA接合，以誘導含SigE前體的結構基因(sigE)的操縱子(spoIIGA-sigE)的轉錄(J.Bacteriol.，169，3329(1987))。存在有兩級抑制，其中SigF被抗sigma因子SpoIIAB在功能上抑制，而抗-抗sigma因子SpoIIAA抑制SpoIIAB的作用。艮P，如SigF的功能缺失的情況一樣，SpoIIAA的功能缺失導致芽孢形成的抑制，己知SpoIIAB的功能缺失也能抑制芽孢形成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,9221(1990);J.Bacteriol.，173,6678(1991))。而且，活化由SpoIIE控制，Spol正是SpoIIAA的去磷酸化酶(GenesCells,1，881(1996))，并且活化的SigF誘導SpoIIR(其為信號轉導蛋白質)的結構基因的轉錄。據設想，從子細胞側分泌的SpoIIR活化SpoIIGA，SpoIIGA是位于母細胞側上的不對稱隔膜中的SigE前體活化蛋白酶，并且由此發生SigE的活化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，2012(1995))。SpoIIAA、SpoIIAB、SpoIIE、SpoIIR和SpoIIGA分別由spoIIAA、spoIIAB、spol正、spoIIR和SpoIIGA基因編碼。此外，在子細胞側，SigF誘導SigG的結構基因(sigG)的轉錄，并且在母細胞偵U，SigE誘導SigK的結構基因(spoIIIC基因和spoIVCBgene)的轉錄。然而，在母細胞側上的SigE活化后，在子細胞側上發生SigG的活化，并且此后在母細胞側上發生SigK的活化(Mol.Microbiol.，31，1285(1999))。從圖2中很顯然，在上述的基因中，當缺失或滅活時抑制芽孢形成過程的基因是kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC和spoIVCB基因。在本發明中要缺失或滅活的芽孢形成相關基因優選地選自屬于枯草桿菌的這些基因，并且更優選地選自枯草桿菌的sigF基因、sigE基因和phrA基因。sigF基因是編碼sigma因子的基因，其負責在芽孢形成階段期間從II期開始在枯草桿菌細胞中形成不對稱隔膜處的子細胞側中發生的基因表達，而sigE基因是編碼sigma因子的基因，其負責在芽孢形成階段期間從II期開始在枯草桿菌細胞中形成不對稱隔膜處的母細胞側中發生的基因表達。此外，phrA基因是涉及感受外部生長環境中的變化并以各種方式對其響應所需要的細胞間信息傳輸的機制中的基因之一，并且基因產物暫時分泌至細胞外。據報道，在細胞外被加工后，該基因作為五肽被攝取至細胞中，并且與RapA蛋白質結合，RapA控制用于傳輸芽孢形成起始信號的磷-中繼系統中的Spo0F的磷酸化，從而參與芽孢形成起始信號的轉導(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94,8612(1997))。上述基因的每一種基因的基因編號和功能總結于表6。與芽孢形成相關基因諸如kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC和spoIVCB對應的基因是功能與上述基因的任一種基本相同的基因，并且例如，可以是來自另一微生物的基因，優選來自芽孢桿菌屬細菌的基因，其堿基序列與這些基因的任一種的堿基序列的同一性為至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、再更優選至少95%、再更優選至少98%。另外，堿基序列的同一性在此根據Lipman-Pearson法計算(Science,227,1435(1985))。這些基因的缺失或滅活可以是前述各種基因當中單個基因的缺失或滅活，或可以是其兩種或多種的組合的缺失或滅活。此外，目標基因之外的基因的增強或缺失或滅活也可以并行地進行。另外，基因的缺失或滅活包括基因中的部分或全部堿基的置換或缺失，以及將堿基插入至基因中。對于一組基因或單個基因的缺失或滅活的順序，可以是有意地缺失或滅活目標基因(靶基因)的方法，以及通過缺失或滅活使隨機基因突變、然后進行蛋白質生產率的評價并通過適當方法進行遺傳分析的方法。為了使靶基因缺失或滅活，例如，可以使用涉及同源重組的方法。即，可以將通過將含有部分靶基因的DNA片段克隆到適當的質粒中獲得的環狀重組質粒，轉染到親代微生物的細胞中，使得親代微生物的基因組上的靶基因被靶基因的某些區中的同源重組分開，從而使靶基因滅活。另外可選地，如圖3所示，根據PCR法或類似方法，通過構建經由突變例如堿基置換或堿基插入而滅活的靶基因，或者構建含有靶基因的上游和下游區但不含有靶基因的線性DNA片段，并將所得物轉染到親代微生物細胞中，從而在親代微生物的基因組上的靶基因內突變位點外的兩個位點處，或者在靶基因的上游側和下游側上，引起雙交換同源重組，也可以用缺失或滅活的基因片段置換基因組上的耙基因。具體地，在使用枯草桿菌作為構建本發明的微生物的親代微生物的情況下，已經有幾個關于通過同源重組缺失或滅活靶基因的方法的報道(Mol.Gen.Genet.，223，268(1990)等)，由此通過重復這些方法可以獲得本發明的宿主微生物。隨機基因的缺失或滅活也可以通過誘導同源重組的方法進行，例如使用隨機克隆DNA片段的上述方法，或者通過用放射照射親代微生物的方法進行。下文將更具體地解釋使用根據SOE(重疊延伸拼接)-PCR法(Gene,77，61(1989))制備的缺失用DNA片段通過雙交換進行缺失的方法，但本發明中的基因缺失方法并不限于以下方法。本發明中使用的缺失用DNA片段是通過將藥物抗性標記基因片段插入在鄰接于要被缺失基因上游的大小為大約0.1-3kb、優選0.4-3kb的片段和鄰接于要被缺失基因下游的大小為大約0.1-3kb、優選0.4-3kb的片段之間而制備的片段。首先，通過第一輪PCR制備三個片段要被缺失基因的上游片段和下游片段，以及藥物抗性標記基因片段，這時，使用如下設計的引物例如，藥物抗性標記基因上游側上的10-30個堿基對的序列加入至上游片段的下游端，反過來，藥物抗性標記基因下游側上的10-30個堿基對的序列加入至下游片段的上游端(圖4)。隨后，使用在第一輪中制備的三種類型的PCR片段作為模板，并使用上游片段的上游側引物和下游片段的下游引物進行第二輪PCR。從而，藥物抗性標記基因片段在加入至上游片段的下游端和下游片段的上游端的藥物抗性標記基因序列中發生退火，并且作為PCR擴增的結果，可以得到藥物抗性標記基因插入在上游側片段和下游側片段之間的DNA片段(圖4)。在使用氯霉素抗性基因作為藥物抗性標記基因的情況下，通過在文獻(PCRProtocols.CurrentmethodsandApplications,B.A.White主編，HumanaPress，pp.251,1993;Gene,77,61(1989))中所述的常規條件下，使用表1所示的引物組，并使用常規PCR用酶試劑盒例如PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzoCo.,Ltd.)來進行SOE-PCR，獲得用于缺失各種基因的DNA片段。當由此獲得的缺失用DNA片段通過感受態法或類似方法轉染到細胞中時，在細胞內，在要缺失的基因的上游和下游的存在同一性的同源區中發生基因重組，并且通過基于藥物抗性標記物的選擇，可以分離出其中所需基因已經被藥物抗性基因置換的細胞。即，當使用表l所示的引物組制備的缺失用DNA片段被轉染時，可以分離在含氯霉素的瓊脂培養基上生長的集落，并通過使用基因組作為模板的PCR法或類似方法，確認基因組上的所需基因被氯霉素抗性基因置換。本發明的微生物可以通過將編碼所需蛋白質或所需多肽的基因轉染到由此產生的微生物中而獲得。在此，術語"所需蛋白質或多肽"是指目的之一是生產或純化的蛋白質或多肽。另外，關于"具有編碼所需蛋白質或多肽的基因的微生物"，其中的基因意在包括微生物原本具有的基因，以及該微生物原本不具有的基因，即外源基因。所需蛋白質或所需多肽不受特別的限制，其實例包括在洗滌劑、食品、纖維、飼料、化學品、藥物、診斷等中使用的各種工業酶或生理活性肽，并且優選工業酶。此外，就工業酶的功能而言，包括氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、連接酶/合成酶等，并且可以優選為水解酶，例如纖維素酶、？淀粉酶和蛋白酶。對于蛋白酶，可以是來自微生物的蛋白酶，優選來自芽孢桿菌屬細菌的蛋白酶，更優選來自克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)KSM-K16株(FERMBP-3376)的蛋白酶。來自克勞氏芽孢桿菌KSM-K16株的堿性蛋白酶的更具體的實例包括來自芽孢桿菌屬細菌的堿性蛋白酶，其包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的1號氨基酸至380號氨基酸的氨基酸序列，或者是包括與上述氨基酸序列的同一性為至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、再更優選至少95%、再更優選至少98%的氨基酸序列的蛋白酶。對于纖維素酶，可以是屬于多糖水解酶類別中第5家族的纖維素酶(Biochem,J"280，309(1991))，并且其中，可以是來自微生物的纖維素酶，尤其是來自芽孢桿菌屬細菌的纖維素酶。例如，可以是來自芽孢桿菌屬KSM-S237株(FERMBP-7875)和芽孢桿菌屬KSM-64株(FERMBP-2886)的纖維素酶，并且其合適的實例包括來自芽孢桿菌屬細菌的堿性纖維素酶，其包括SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的1號氨基酸至795號氨基酸的氨基酸序列，或者是包括SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的1號氨基酸至793號氨基酸的氨基酸序列的堿性纖維素酶，或者是包括與上述氨基酸序列的同一性為至少70%、優選至少80%、更優選至少90°/。、再更優選95%、再更優選至少98%的氨基酸序列的纖維素酶。此外，對于Y-淀粉酶，可以是來自微生物的Y-淀粉酶，優選來自芽孢桿菌屬細菌的，淀粉酶，并且更優選來自芽孢桿菌屬KSM-K38株的Y-淀粉酶。合意地，要轉染到本發明的微生物中的所需蛋白質或所需多肽的基因與上游的一個或多個區以適當的順序連接，該一個或多個區選自以下區與基因的轉錄、翻譯和分泌有關的控制區，即，含有啟動子和轉錄起始點的轉錄起始控制區；含核糖體結合位點和起始密碼子的翻譯起始控制區；以及分泌信號肽區。具體地，優選具有三個結合區，包括轉錄起始控制區、翻譯起始控制區和分泌信號肽區的基因，另外，合意地，分泌信號肽區來自芽孢桿菌屬細菌的纖維素酶基因，而轉錄起始控制區和翻譯起始控制區是纖維素酶基因上游的大小為0.6-1kb的區，并且這些區適當地與所需蛋白質或所需多肽的基因連接。例如，合意地，來自芽孢桿菌屬細菌(即KSM-S237株(FERMBP-7875)或KSM-64株(FERMBP-2886))的纖維素酶基因以及該纖維素酶基因的轉錄起始控制區、翻譯起始控制區和分泌信號肽區適當地與所需蛋白質或所需多肽的結構基因連接。更具體地，合意地，包括SEQIDNO:5所示的堿基序列的1號堿基至659號堿基的堿基序列的DNA片段，或包括SEQIDNO:7所示的堿基序列的1號堿基至696號堿基的堿基序列的DNA片段，或者包括與上述堿基序列的同一性為至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、再更優選至少95%、再更優選至少98%的堿基序列的DNA片段，或包括由任意上述堿基序列的一部分的缺失、置換或添加得到的堿基序列的DNA片段，適當地與所需蛋白質或所需多肽的結構基因連接。另外，如本文所用，包括由任意上述堿基序列的一部分的缺失、置換或添加得到的堿基序列的DNA片段是指其中任意上述堿基序列的一部分被缺失、置換或添加，但保留了與基因的轉錄、翻譯和分泌相關的功能的DNA片段。編碼所需蛋白質或所需多肽的這些基因的導入可以通過如下方法進行例如，(1)通過載體導入，或(2)插入到基因組中。在(1)通過載體導入的情況下，可以通過適當的轉化法，例如感受態細胞轉化法、原生質體轉化法或電穿孔法，導入含有以下基因的載體該基因編碼所需蛋白質或所需多肽，并且在上游與選自與基因的轉錄、翻譯和分泌相關的控制區(即含啟動子和轉錄起始點的轉錄起始控制區)、含核糖體結合位點和起始密碼子的翻譯起始控制區和分泌信號肽區的一個或多個區以適當的形式連接。在此，載體不受特別的限制，只要它是用于將所需基因轉染到宿主中以便增殖并表達該基因的合適的載體核酸分子即可，并且，載體可以是質粒，也可以是，例如，人工染色體，例如YAC和BAC，使用轉座子的載體，黏端質粒等等。質粒的實例包括pUB110和pHY300PLK。此外，(2)插入至基因組中可以使用例如涉及同源重組的方法進行。即，具有用于誘導與編碼所需蛋白質或所需多肽的基因連接的導入的染色體區的一部分的DNA片段，可以通過將該DNA片段轉染到微生物的細胞中、并在染色體區的一些部分中誘導同源重組而結合至基因組中。在此，用于誘導導入的染色體區不受特別的限制，但優選非必需基因區或非必需基因區上游的非基因區。使用本發明的重組微生物產生所需的蛋白質或多肽可以通過如下方法進行將細菌菌株接種至含有可同化碳源、氮源和其他必需組分的培養基中，通過常規微生物培養方法培養菌株，并且培養完成后，收集和純化蛋白質或多肽。如在后述的實施例中所述，與使用基因未被改變的微生物的情況相比，所需蛋白質或多肽的生產率得到提高。下文將詳細地描述構建本發明的重組微生物的方法，以及使用重組微生物產生纖維素酶和淀粉酶的方法。實施例在以下實施例中用于擴增DNA片段的聚合酶鏈式反應(PCR)中，使用GeneAmpPCR系統(AppliedBiosystems，Inc.)并使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio，Inc.)和輔助試劑來進行DNA擴增。通過加入1HL適當稀釋的模板DNA、20pmol各正義引物和反義引物、以及2.5uPyrobestdna聚合酶，并將反應溶液的總量調節至50mL，制備PCR反應溶液的組合物。在下列反應條件下進行PCR:重復30輪在98。C下10秒、在55匸下30秒和在72'C下l-5分鐘(根據所需的擴增產物調節。大致標準是1分鐘/1kb)的三階段溫度變化，然后反應在72-C下繼續進行5分鐘。此外，在下列實施例中，基因的上游和下游不是指從復制起始點開始的位置，而是，上游表示在各種操作和過程中緊接著基因或目的區域的5'-端的區域，而下游表示在各種操作和過程中緊接著基因或目的區域的3'-端的區域。此夕卜，在下列實施例中各種基因和基因區的名稱基于在Nature，390:249國256(1997)中報道、并在日本站點JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BSORFDB)(http://bacillus.genome.ad.JP/，2004年3月10日更新)上在互聯網上公布的枯草桿菌基因組數據進行描述。枯草桿菌的轉化以下列方式進行。具體地，將枯草桿菌株在SPI培養基(0.20%硫酸銨、1.40%磷酸氫二鉀、0.60%磷酸二氫鉀、0.10%檸檬酸三鈉二水合物、0.50%葡萄糖、0.02%酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories,Inc.)、5mM硫L酸鎂、0.25jjM氯化錳和50ng/mL色氨酸)中在37'C下振蕩培養，直至生長度值(OD600)達到大約1。在振蕩培養后，將一些培養溶液接種至9倍量的SPII培養基(0.20%硫酸銨、1.40°/。磷酸氫二鉀、0.60%磷酸二氫鉀、0.10%梓檬酸三鈉二水合物、0.50%葡萄糖、0.01%酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories,Inc.)、5mM硫酸鎂、0.40pM氯化錳和5pg/mL色氨酸)中，并將細胞進一步振蕩培養，直至生長度值(OD600)達到大約0.4。由此，制備枯草桿菌的感受態細胞。隨后，向100nL由此制備的感受態細胞懸液(SPII培養基中的培養溶液)中加入5mL含各種dna片段的溶液(soe-pcr反應溶液等)，將混合物在37X:下振蕩孵育1小時，并且將全部的量涂在含適當藥物的LB瓊脂培養基(1%色氨酸、0.5%酵母提取物、lc/。NaCl和1.5Q/。瓊脂)上。在37'C下靜止培養后，分離出生長的集落作為轉化體。提取所獲得的轉化體的基因組，并使用該基因組作為模板通過PCR確認實現了所需的基因組結構的改變。將編碼所需蛋白質或多肽的基因轉染到宿主微生物中遵循下列的任一種方法進行感受態細胞轉化法(J.Bacteriol.，93，1925(1967))、電穿孔法(FEMSMicrobiol.Lett.，55，135(1990))和原生質體轉化法(Mol.Gen.Genet"168，111(1979))。對于用于通過重組微生物產生蛋白質的培養，使用LB培養基(1%色氨酸、0.5%酵母提取物和l%NaCl)、2xYT培養基(1.6%色氨酸、1%酵母提取物和0.5%NaCl)、2xL-麥芽糖培養基(2%色氨酸、1%酵母提取物、l%NaCl、7.5。/。麥芽糖和7.5ppm硫酸錳四水合物或五水合物)或CSL發酵培養基(2%酵母提取物、0.5%玉米浸出液(CSL)、0.05%氯化鎂七水合物、0.6%尿素、0.2°/丄-色氨酸、10%葡萄糖、0.15%磷酸二氫鈉和0.35%磷酸氫二鈉，pH7.2)。實施例1構建過度表達secY基因的菌株如下進行過度表達secY基因的變異體的構建(見圖3)。使用從枯草桿菌168株中提取的基因組DNA作為模板，并使用PVG-FW和PVG-R，以及secY/PVG-F和secY/Cm-R引物組，通過PCR擴增含spoVG基因的轉錄起始控制區和核糖體結合位點的0.2kb片段(A)和含spoVG基因的1.3kb片段(B)。此夕卜，使用質粒pC194(J.Bacteriol.，150(2),815(1982))作為模板，并使用表1所示的catf和catr引物組，通過PCR擴增含氯霉素(Cm)抗性基因的0.9kb片段(C)。接下來，通過使用獲得的三個片段(A)、(B)和(C)的混合物作為模板，并使用表1所示的PVG-FW2和catr2引物組進行SOE-PCR，獲得大小為2.2kb的DNA片段(D)，其中三個片段(A)、(B)和(C)以該順序連接，spoVG基因的轉錄起始控制區和核糖體結合位點連接在secY基因的上游(連接成secY基因的起始密碼子位于spoVG基因的起始密碼子的位置處)，并且Cm抗性基因結合在其下游。隨后，使用從枯草桿菌168株提取的基因組數據作為模板，并使用表1所示的amyEfw2和amyE/PVG2-R以及amyE/Cm2-F和amyErv2引物組，通過PCR擴增含amyE基因的5'-端上的區的1.0kb片段(E)，和含amyE基因的3'-端上的區的1.0kb片段(F)。隨后，通過使用獲得的三個片段(E)、(F)和(D)的混合物作為模板，并使用表1所示的amyEfWl和amyErvl引物組進行SOE-PCR，獲得總堿基長度為4.2kb的DNA片段(G)，其中三個片段(E)、(D)和(F)以該順序連接，secY基因連接在spoVG基因的轉錄起始控制區和核糖體結合位點的下游，并且在其下游連接有氯霉素抗性基因的大小為2.2kb的DNA片段插入至amyE基因的中央。使用獲得的4.2kb的DNA片段(G)，通過感受態細胞法將枯草桿菌168株轉化，并分離出在含(10pg/mL)的LB瓊脂培養基上生長的集落作為轉化體。通過使用從獲得的轉化體提取的基因組DNA作為模板，并使用表1所示的amyEfw2和secY/Cm-R以及secY/PVG-F和amyErv2引物組，通過PCR確認大小分別為2.5kb和3.1kb的DNA片段的擴增,并且確認其中secY基因連接在spoVG基因的轉錄起始控制區和核糖體結合位點的下游的DNA片段在枯草桿菌168株的基因組上的amyE基因位點處被插入。由此獲得的菌株稱為secY-K株。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例2用藥物抗性基因置換基因組中的sigF基因用藥物抗性基因置換基因組中的sigE基因的方法將基于圖4進行說明。使用從枯草桿菌168株提取的基因組DNA作為模板，使用表1所示的sigF-FW和sigF/Sp-R引物組，通過PCR擴增鄰近基因組中sigE基因上游的1.0kb片段(A)。另外，使用上述基因組DNA作為模板，使用sigF/sp-F和sigF-RV引物組，通過PCR擴增鄰近基因組中sigF基因下游的1.0kb片段(B)。此外，使用質粒pDG1727(Gene，167,335(1995))DNA作為模板，并使用表1所示的spf和spr引物組，通過PCR制備大小為1.2kb的壯觀霉素(Sp)抗性基因區(C)。隨后，如圖4所示，使用獲得的1.0kb片段(A)、l.Okb片段(B)和Sp抗性基因區(C)三個片段的混合物作為模板，并使用表1所示的sigF-FW2和sigF-RV2引物組，根據SOE-PCR法獲得其中以1.0kb片段(A)、Sp抗性基因區(C)和l.Okb片段(B)的順序含有以上三個片段的2.8kb的DNA片段(D)。然后，使用獲得的DNA片段(D)，根據感受態細胞轉化法進行168株的轉化。轉化后，分離出在含壯觀霉素(100pg/mL)的LB瓊脂培養基上生長的集落作為轉化株。提取獲得的轉化體的基因組DNA，并通過PCR確認sigF基因被Sp抗性基因置換。這樣，構建缺失sigF基因的菌株(AsigF株)。此外，使用在實施例1中構建的secY-K株通過在轉化中用此株更換枯草桿菌168株，構建其中在secY-K株的基因組中sigF基因被Sp抗性基因置換的菌株(secYKAsigF株)。實施例3用藥物抗性基因置換基因組中的sigE基因和phrA基因以在實施例2中所示的用藥物抗性基因置換sigE基因相同的方式，進行用壯觀霉素抗性基因置換168株基因組中的sigE基因和phrA基因，從而構建缺失sigE基因的菌株(AsigE株)和缺失phrA基因的菌株(AphrA株)。對于各菌株的構建，使用表l所示的引物，并且各引物與構建AsigF株中使用的引物的對應關系顯示于表2。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>通過用壯觀霉素抗性基因置換實施例1中構建的secY-K株的基因組上的sigE基因或phrA基因，構建secYKAsigE株和secYKAphrA株。實施例4評價堿性蛋白酶的分泌和產生實施例1-3中獲得的secY-K株、secYKAsigF株、secYKAsigE株和secYKAphrA株的異源蛋白質生產率的評價如下進行使用來自芽孢桿菌屬細菌的堿性蛋白酶的生產率作為指標，上述蛋白酶包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。作為對照，對枯草桿菌168株、AsigF株、AsigE株和AphrA株也進行評價。即，使用從克勞氏芽孢桿菌KSM-K16株(FERMBP-3376)中提取的基因組DNA作為模板，并使用表1所示的S237pKAPpp-F和KAPter-R(BglII)引物組，通過PCR擴增大小為1.3kb的編碼具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的堿性蛋白酶的DNA片段(W)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，43,473(1995))。另夕卜，使用從枯草桿菌KSM-S237株(FERMBP-7875)中提取的基因組DNA作為模板，并使用表1所示的S237ppp-F2(BamHI)和S237pKAPpp-R引物組，通過PCR擴增大小為0.6kb的含堿性纖維素酶基因的啟動子區(JP-A第2000-210081號)的DNA片段(X)。隨后，使用獲得的兩個片段(W)和(X)的混合物作為模板，并使用表1所示的S237ppp-F2(BamHI)和KAPter-R(BglII)等引物組進行SOE-PCR，獲得大小為1.8kb的DNA片段(Y)，其中堿性蛋白酶基因連接在堿性纖維素酶基因的啟動子區下游。將得到的1.8kb的DNA片段(Y)插入在穿梭載體pHY300PLK(YakultHonshaCo.，Ltd.)的BamHI-Bgin限制性酶切位點處，以構建用于評價堿性蛋白酶產量的質粒pHYKAP(S237p)。將根據原生質體轉化法構建的質粒pHYKAP(S237p)轉染到各菌株中。獲得的各重組株在37'C下在lOmLLB培養基中振蕩培養過夜，將0.05mL該培養溶液接種至50mL2xL-麥芽糖培養基(2%胰蛋白質胨、1%酵母提取物、l%NaCl、7.5%麥芽糖、7.5ppm硫酸錳四水合物或五水合物和15ppm四環素)中，在3(TC下振蕩培養3天。培養后，測定通過離心去除細菌細胞的培養溶液的上清液的堿性蛋白酶活性，以確定培養期間分泌和產生至細菌細胞外的堿性蛋白酶的量。培養上清液中蛋白酶活性的測定如下進行。具體地，向50nL用2mMCaCl2溶液適當稀釋的培養上清液中，加入含7.5mM琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸對硝基苯胺(STANA,PeptideInstitute,Inc.)作為底物的100nL75mM硼酸-KCl緩沖溶液(pH10.5)并混合。當反應在30'C下進行時，脫離的對硝基苯胺量的定量通過測量420nm處的吸光度(OD420nm)的變化來進行。在1分鐘內使1一mol對硝基苯胺脫離的酶量作為1U。如表3所示，作為堿性蛋白酶活性的測定結果，當使用secY-K株作為宿主時，堿性蛋白酶的生產率等于對照168株(野生型)的生產率，并且特別地，觀察不到生產率的提高。另一方面，觀察到secYKAsigF株、secYKAsigE株和secYKAphrA株的生產率顯著提高，在這些菌株中結合了芽孢形成相關基因的缺失。對于沒有進行secY基因表達增強的導入的AsigF株、AsigE株和AphrA株也觀察到生產率的提高超過了168株的提高；然而，與secY基因表達的增強相結合，由這些基因的缺失所引起的生產率提高作用的表現顯然是增加的。換句話說，設想當首先增加SecY蛋白質(其為分泌機構)的量，然后使芽孢形成相關基因例如sigF、sigE和phrA缺失時，在異源蛋白質生產率的提高方面獲得了協同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例5評價堿性纖維素酶的分泌和產生其他異源蛋白質生產率的評價如下進行使用來自芽孢桿菌屬細菌的包括SEQIDNO:6所示氨基酸序列的堿性纖維素酶的生產率作為指標。具體地，使用表1所示的237UB1和237DB1引物組，擴增來自芽孢桿菌屬KSM-S237株(FERMBP-7875)的堿性纖維素酶基因(JP-A第2000-210081號)的片段(3.1kb)，然后用BamHI限制性內切酶處理，以將該片段插入在穿梭載體pHY300PLK的BamHI限制性酶切位點處。根據原生質體轉化法將由此獲得的重組質粒pHY-S237轉染到各菌株中。由此獲得的各重組株在與實施例4相同的條件下振蕩培養3天。測定離心去除細菌細胞的培養溶液的上清液的堿性纖維素酶活性，以確定培養期間分泌和產生至細菌細胞外的堿性纖維素酶的量。對于纖維素酶活性的測定，向50mL用1/7.5M磷酸鹽緩沖液(pH7.4，WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)適當稀釋的樣品溶液中加入50HL0.4mM對硝基苯基-p-D-纖維三糖苷(SeikagakuCorporation)并混合，并且通過測量420nm處吸光度(OD420nm)的變化，當反應在3(TC下進行時進行脫離的對硝基苯酚量的定量。在1分鐘內使1p-mol對硝基苯酚脫離的酶量作為1U。如表4所示，作為堿性纖維素酶活性的測定結果，當使用secY-K株作為宿主時，與對照168株(野生型)相比，觀察到較高的堿性纖維素酶的分泌和產生。另外，觀察到secYKAsigF株、secYKAsigE株和secYKAphrA株的生產率進一步顯著提高，在這些菌株中結合了芽孢形成相關基因的缺失。對于沒有進行secY基因表達增強的導入的AsigF株、AsigE株和AphrA株，也觀察到生產率的提高超過了168株的提高；然而，與secY基因表達的增強相結合，由這些基因的缺失所引起的生產率提高作用的表現顯然是增加的。換句話說，設想當首先增加SecY蛋白質(其為分泌機構)的量，然后使芽孢形成相關基因例如sigF、sigE和phrA缺失時，在生產率的提高方面獲得了協同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>比較例l用藥物抗性基因置換rsiX基因以與實施例2所示的用壯觀霉素抗性基因置換sigF基因相同的方式，用氯霉素抗性基因置換枯草桿菌168株的基因組上的rsiX基因，從而構建ArsiX株。使用的引物顯示于表l，并且使用的各引物與構建AsigF株使用的引物的對應關系顯示于表2。另外，以相同的方式用氯霉素抗性基因置換實施例2中構建的AsigF株的基因組上的rsiX基因，從而構建AsigFArsiX株。此外，rsiX基因是編碼抑制SigX功能的抗sigma因子(抗-SigX)的基因，SigX是屬于枯草桿菌的ECF(胞質外功能)家族的sigma因子之一。SigX在細胞周圍環境在熱應激或類似情況下發生變化時受到活化，并且具有通過誘導具有識別該活化作用的啟動子的基因的轉錄或操縱子的轉錄來應付環境變化的功能(J.Bacteriol.，179,2915(1997))。比較例2評價堿性蛋白酶的分泌和產生比較例1中構建的AsigFArsiX株的堿性蛋白酶的分泌生產率的評價以與實施例4相同的方式進行。作為對照，對枯草桿菌168株、實施例1中構建的ArsiX株和AsigF株進行相同的評價。結果，如表5所示，盡管rsiX基因缺失的ArsiX株的蛋白酶生產率高于野生株的生產率，但其中結合有sigF基因的缺失的AsigFArsiX株的生產率則低于AsigF株的生產率。換句話說，確認對于rsiX基因的缺失，沒有觀察到表現出當與芽孢形成相關基因的缺失結合時的產生異源蛋白質的協同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>比較例3用藥物抗性基因置換yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因通過實施例2所示的用壯觀霉素抗性基因置換sigF基因的相同方式，用氯霉素抗性基因置換枯草桿菌168株的基因組上的yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因，從而分別構建AyacP株、AyvdE株、AyurK株、AyhdQ株和AglcT株。使用的引物顯示于表1,并且使用的各引物與構建AsigF株使用的引物的對應關系顯示于表2。另外，通過用氯霉素抗性基因置換實施例2中構建的AsigF株的基因組上的yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因，分別構建AsigFAyacP株、AsigFAyvdE株、AsigFAyurK株、AsigFAyhdQ株和AsigFAglcT株。關于與本發明相關的基因，基因編號及其功能在表6中給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>比較例4評價堿性纖維素酶的分泌和產生在比較例3中構建的AyacP株、AyvdE株、AyurK株、AyhdQ株和AglcT株的堿性纖維素酶的分泌生產率的評價通過與實施例5相同的方式進行。作為對照，對枯草桿菌168株也進行評價。結果，如表7所示，觀察到AyacP株、AyvdE株、AyurK株和AglcT株的生產率高于野生株的生產率，而AyhdQ株的生產率則稍有下降。而且，在比較例3中構建的AsigFAyacP株、AsigFAyvdE株、AsigFAyurK株、AsigFAyhdQ株和AsigFAglcT株的堿性纖維素酶的分泌生產率的評價通過與實施例5相同的方式進行。作為對照，對枯草桿菌158株和實施例1中構建的AsigF株也進行評價。結果，如表8所示，任何構建的菌株的纖維素酶生產率均低于AsigF株的生產率。換句話說，有力地表明，當與芽孢形成相關基因的缺失結合時表現出產生異源蛋白質的協同作用，是與增強secY基因的表達結合的特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>[表8]<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>權利要求1.一種重組微生物，其通過將對所需的蛋白質或多肽進行編碼的基因轉染到微生物中而獲得，所述微生物通過如下方法獲得以遺傳方式構建成過度表達枯草桿菌(Bacillussubtilis)的secY基因或與所述secY基因對應的基因，并使選自芽孢形成相關基因和與所述芽孢形成相關基因對應的基因中的一種或多種基因從基因組中缺失或滅活。2.—種重組微生物，其通過將對所需的蛋白質或多肽進行編碼的基因轉染到微生物株中而獲得，所述微生物株通過如下方法獲得將在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點導入至枯草桿菌的secY基因或與所述secY基因對應的基因的基因組的上游，或者導入至含有枯草桿菌的secY基因或對應基因的基因組上的操縱子的先導基因的上游；或者所述微生物株通過如下方法獲得導入一基因片段，并使選自芽孢形成相關基因和與所述芽孢形成相關基因對應的基因的一種或多種基因缺失或滅活，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點連接在枯草桿菌的secY基因或與所述secY基因對應的基因的上游。3.根據權利要求2所述的重組微生物，其中所述在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點來源于枯草桿菌的spoVG基因或與所述spoVG基因對應的基因。4.根據權利要求1-3中任意一項所述的重組微生物,其中所述芽孢形成相關基因和與所述芽孢形成相關基因對應的基因是選自kinA基因、kinB基因、kinC基因、spoOF基因、spoOB基因、spoOA基因、kapB基因、kipA基因、phrA基因、spoOJ基因、sigH基因、sigF基因、sigE基因、spoIIAA基因、spoIIAB基因、spol正基因、spoIIR基因、spoIIGA基因、sigG基因、spoIIIC基因、spoIVCB基因和與這些基因對應的基因的一種或多種基因。5.根據權利要求1-4中任意一項所述的重組微生物，其中所述芽孢形成相關基因和與所述芽孢形成相關基因對應的基因是選自sigF基因、sigE基因、phrA基因和與這些基因對應的基因的一種或多種基因。6.根據權利要求1-5中任意一項所述的重組微生物，其中所述微生物是芽孢桿菌(Bacz7/w)屬的細菌。7.根據權利要求6所述的重組微生物，其中所述芽孢桿菌屬的細菌是枯草桿菌。8.根據權利要求1-7中任意一項所述的重組微生物，其中選自轉錄起始控制區、翻譯起始控制區和分泌信號區的任何一個或多個區連接在對所需的蛋白質或多肽進行編碼的基因的上游。9.根據權利要求8所述的重組微生物，其中連接有所述轉錄起始控制區、翻譯起始控制區和分泌信號區這三個區。10.根據權利要求8或9所述的重組微生物，其中所述分泌信號區來自芽孢桿菌屬的細菌的纖維素酶基因，并且所述轉錄起始控制區和所述翻譯起始控制區來自所述纖維素酶基因上游的大小為0.6-1kb的區。11.根據權利要求8-10中任意一項所述的重組微生物，其中所述轉錄起始控制區、翻譯起始控制區和分泌信號區這三個區形成包括一定堿基序列的DNA片段，或者形成包括任意的所述一定堿基序列的一部分己缺失的堿基序列的DNA片段，其中所述一定堿基序列為具有由SEQIDNO:5所示的堿基序列的纖維素酶基因的1號堿基至659號堿基的堿基序列、具有由SEQIDNO:7所示的堿基序列的纖維素酶基因的1號堿基至696號堿基的堿基序列、或與任意所述堿基序列的同源性為至少70%的堿基序列。12.—種產生如權利要求1所述的重組微生物的方法，其包括在微生物中，將在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點，導入至枯草桿菌的secY基因或與所述secY基因對應的基因的基因組的上游，或者導入至含有枯草桿菌的secY基因或對應基因的基因組上的操縱子的先導基因的上游；或者導入一基因片段，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的轉錄起始控制區或轉錄起始控制區-核糖體結合的位點連接在枯草桿菌的secY基因或與所述secY基因對應的基因的上游；使選自芽孢形成相關基因和與所述芽孢形成相關基因對應的基因的一種或多種基因缺失或滅活；和將對所需的蛋白質或多肽進行編碼的基因轉染到微生物株中。13.—種使用根據權利要求1-11中任意一項^f述的重組微生物產生所需的蛋白質或多肽的方法。全文摘要本發明提供了一種蛋白質或多肽生產率提高的重組微生物，以及使用該重組微生物產生蛋白質或多肽的方法。該重組微生物通過將編碼所需的蛋白質或多肽的基因轉染到微生物株中而獲得，上述微生物株通過如下方法獲得遺傳構建以過度表達枯草桿菌secY基因或與secY基因對應的基因，并使選自芽孢形成相關基因和基因組中與芽孢形成相關基因對應的基因的一種或多種基因缺失或滅活。文檔編號C12N1/20GK101652468SQ200880011110公開日2010年2月17日申請日期2008年4月8日優先權日2007年4月10日發明者劉生浩,荒勝俊,遠藤圭二申請人:花王株式會社