一株產l-氨基酸氧化酶的重組菌株的構建方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明闡述了一株產L-氨基酸氧化酶的重組菌株的構建方法及其應用，屬于基因工程與酶學品領域，將重組產生的L-氨基酸氧化酶包涵體進行蛋白變性、復性和濃縮，使蛋白包涵體恢復活性;蛋白表達量最佳誘導條件為37℃，IPTG0.5mmol/L誘導5h；通過對重組酶的酶學性質研究，發現重組酶最適pH8.0，最適溫度45℃，外源添加FAD對酶活力沒有影響；結合酶學特征，將重組酶添加到含有10g/L的谷氨酸鈉pH8.0的緩沖液中，45℃轉化6h可以生成5.3g/L的α-酮戊二酸，轉化率達到50％以上。
【專利說明】一株產L-氨基酸氧化酶的重組菌株的構建方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程及酶學領域中一種生產L-氨基酸氧化酶的重組菌株及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002]L-氨基酸氧化酶是一種黃素蛋白酶，能立體特異性氧化L-氨基酸脫氨，生成對應的α -酮酸、氨和過氧化氫，并伴隨氧氣的消耗。能被應用于L-氨基酸的定量分析、DL-氨基酸的拆分和α-酮酸的制備。近年來，有文獻報道了 L-氨基酸氧化酶具有抗菌、殺蟲、抗病毒等生物活性，還具有與血小板相互作用、細胞毒性及誘導細胞凋亡的作用，其在生物醫藥領域具有廣闊的應用前景。
[0003]研究發現L-氨基酸氧化酶廣泛分布于蛇科動物中，后來發現在細菌Rhodococusopacus、Pseudoalteromonas luteoviolacea、Bacillus carotarum 及一些海洋微生物中，不同物種來源的L-氨基酸氧化酶底物差異性較大，有些作用于幾種甚至十幾種氨基酸，有些只作用于一種氨基酸，等電點、穩定性等理化性質不盡相同，基因序列也有差異，生理及生物活性不一樣，結構也不盡相同。
[0004]目前為止，只有很少的L-氨基酸氧化酶異源表達的報道，2003年，第一個L-氨基酸氧化酶細菌異源表達系統被報道，研究人員將渾濁紅球菌L-氨基酸氧化酶基因序列克隆到大腸桿菌中，發現在大腸桿菌表達系統中獲得了大量的包涵體。之后也有一些異源表達的報道，雖然L-氨基酸氧化酶的異源表達是一大挑戰，不過還是有成功潛力的，利用生物信息學方法儀器突變技術，選擇合適的表達載體與系統，有望極大的提高L-氨基酸氧化酶異源表達成功率。
[0005]L-氨基酸氧化酶催化L-氨基酸生成α -酮酸的開發是值得關注的，可以用L-氨基酸氧化酶的高選擇性來生產有較高生物醫藥價值的α -酮酸，酶法轉化法具有操作簡單、條件溫和、高選擇性、高效、無毒、無污染等優點。目前關于利用L-氨基酸氧化酶催化谷氨酸生產α-酮戊二酸的方法國內外尚無報道，因此利用這種方法生產α-酮戊二酸對環境不會有太大影響，具有很高的市場應用前景。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種重組生產L-氨基酸氧化酶菌株的構建方法，及重組酶的性質和應用。
[0007]本發明的技術方案:
[0008]1.將來自于Rhodococus opacus DSM43250菌株的L-氛基酸氧化酶基因(NCBI序列號:AY053450.1)提取出來與表達載體pET28a(重組蛋白形成于胞內)連接，導入E.coliBL21中構建一株重組菌株。
[0009]重組菌株構建方法:1)將PCR得到的LAAO目的基因與載體pET28a用Nco I和HindIII酶切2h，然后連接10h，用轉入大腸桿菌JM109中驗證。2)將構建好的重組質粒轉入表達菌株E.coli BL21中，得到重組菌株，轉化方法包括化學轉化法，電轉法，冷凍法及結合轉化法，并對構建好的菌株進行測序驗證。
[0010]2.將構建好的重組菌株，0.4mM IPTG誘導表達4_6h，發現重組產生酶的是包涵體沒有活性，蛋白大小為58KDa，蛋白經過復性，有30%的蛋白恢復了活性，蛋白電泳圖譜如圖1，蛋白復性過程如圖2所示。
[0011]3.蛋白包涵體有易純化、抵御胞內蛋白酶降解及減少雜質的優點，因此通過不同的誘導方法來提高誘導表達量，發現最佳培養溫度37°C，0D_為0.5-0.6時添加0.4mmol/L的IPTG誘導培養5h，此時目的蛋白表達量達到最大。
[0012]4.對復性得到的L-氨基酸氧化酶進行生物化學特性研究，該酶最適Ph8.0，pH7-pH9之間活力保持在90%以上；最適溫度45°C，在20-50°C下放置12h，酶活力在80%以上；重組酶底物特異性實驗發現最適底物為L-鳥氨酸其次是L-半胱氨酸和L-丙氨酸，外源添加FAD對該重組酶活性沒有影響。
[0013]5.將純化獲得的有活性的L-氨基酸氧化酶進行轉化實驗，以10g/L谷氨酸鈉為轉化底物，PH8.0磷酸鹽緩沖液中45°C轉化6h，可以得到α -酮戊二酸5.3g/L。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1誘導表達的重組谷氨酸氧化酶蛋白電泳圖譜。
[0015]圖2蛋白復性流程 圖。
[0016]圖3重組酶最適pH測定結果。
[0017]圖4重組酶最適溫度測定結果。
[0018]圖5重組酶溫度穩定性測定結果。
[0019]圖6不同底物濃度對重組酶轉化測定結果。
【具體實施方式】:
[0020]1.重組菌株的構建:
[0021]I)用引物 1:5 ' CATGCCATGGCATTGGCATTCACACGTAGATCTTT3 '和引物 2:5' CCCAAGCTTGGGCTTCCTGGGCCACGC3'將來自于Rhodococus opacus DSM43250 的基因組進行PCR擴增:體系中加入EX taq酶，95°C預處理3min，95°C解鏈30s，60°C退火30s，72°C延伸1.8min，30個循環;
[0022]2)用限制性內切酶Nco I和HindIII將目的基因和表達載體pET28a37°C酶切2h ；
[0023]3)用T4連接酶將酶切后的目的基因和質粒pET28al6°C連接IOh用化學轉化法轉入表達菌株E.coli BL21中，并涂布于含卡納青霉素的LB平板中培養12h ；
[0024]4)將平板中長出的菌落進行PCR及酶切驗證，將含有目的基因的質粒進行測序驗證，選出目的基因完全正確的一株菌株；將菌株接種于含有相應抗生素的LB培養基中37°C誘導5h，進行蛋白電泳，發現目的條帶大小在58KDa如圖1所示，并形成的是包涵體，沒有活性。
[0025]2.包涵體的復性:
[0026]將構建好的重組菌株接種于LB培養基中，0D_為0.5-0.6之間時，加入0.4mmol/L IPTG37°C誘導5h，收集菌體超聲破碎30min ;破碎后的細胞8000rpm離心30min，沉淀用緩沖液 20mM Tris-HCl, 2M urea, 2mM EDTA, ρΗ8.0 洗漆兩次,8000rpm 離心 30min 倒掉上清液；沉淀用緩沖液20mM Tris-HCl,8M urea, IOuM FAD,50mM DTT溶解，4°C放置 15h ；8000rpm離心30min取上清液用緩沖液20mM Tris-HCl, 8M urea, IOuM FAD，50mMDTT稀釋至蛋白濃度小于0.lmg/mL后，取20mL加入透析袋中，用緩沖液20mM Tris-HCl, IM NaCl于4°C流速
0.4mL/min逐步稀釋40h ;將復性好的蛋白用超濾管濃縮至1_1.5mL，得到有活性的重組氨基酸氧化酶。
[0027]3.蛋白表達量實驗
[0028]通過對誘導時間、誘導溫度和IPTG添加量進行優化，發現最佳誘導條件為:IPTG0.5mmol/L、溫度37°C誘導5h，目的蛋白表達量為1.36mg/mL，占到菌體總蛋白23%。
【權利要求】
1.一株產L-氨基酸氧化酶的重組菌株的構建方法，其特征如下: 1)將L-氨基酸氧化酶基因與質粒pET28a重組構建重組質粒，表達于E.coli BL21中構建一株重組菌株，具有產生L-谷氨酸氧化酶能力； 2)該菌株蛋白表達量經過優化最佳條件為溫度30-37°C，添加IPTG0.3-0.5mmol/L誘導4-6h，目的蛋白含量達到總蛋白20%以上； 3)該菌株生產的L-氨基酸氧化酶是包涵體，沒有活性。
2.根據權利要求1所述重組菌株產生的L-氨基酸氧化酶包涵體，經過蛋白變性，復性，濃縮，使30%以上的蛋白包涵體恢復活性。
3.根據權利要求2得到的具有活性的L-氨基酸氧化酶，其酶學性質如下: 1)最適pH范圍為7.0-9.0 ； 2)最適溫度為35-45°C，重組酶在20-50°C放置12h，酶的比活力保持在70%以上； 3)重組酶底最適底物為L-鳥氨酸其次是L-賴氨酸、L-丙氨酸,該重組酶底物范圍較廣； 4)外源添加FAD對重組酶的活力沒有影響。
4.根據權利要求1和2得到的有活性的重組酶可以將L-谷氨酸和谷氨酸鈉轉化生成α -酮戊二酸，轉化率大于50%，轉化 條件:底物谷氨酸鈉濃度為7.5-12.5g/L，pH7.0-9.0，35-45 °C 轉化 6-8h。
【文檔編號】C12P7/50GK103555642SQ201310309931
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月12日 優先權日:2013年10月12日
【發明者】劉立明, 牛盼清, 董曉翔 申請人:江南大學