一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法和應用。本發明的試紙條按照連接順序依次包括樣品墊，膠體金墊，硝酸纖維素膜，吸水紙及位于下方的作為組裝平臺使用的PVC底板，所述膠體金墊是由吸附有膠體金標記的抗PEDV單克隆抗體的玻璃纖維素膜組成，所述硝酸纖維素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗體包被的質控線以及兔抗PEDV?S蛋白多克隆抗體包被的檢測線，其中，所述的抗PEDV單克隆抗體由保藏編號為CCTCC?C201392的雜交瘤細胞分泌產生。實驗證明，本發明的試紙條，具有特異性強，穩定性好等優點，并且操作簡單，無需對技術人員特殊培訓，無需特殊設備，檢測成本低，檢測快速，只需5～10分鐘即可讀取結果，適合現場檢測。
【專利說明】一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及檢測豬流行性腹瀉病毒的的試劑，尤其涉及一種利用膠體金免疫層析技術檢測豬流行性腹瀉病毒的試紙條，本發明屬于病毒檢測領域。
【背景技術】
[0002]流行性腹瀉病毒(PEDV)是豬流行性腹瀉(PED)的病原體。主要危害仔豬，患病哺乳仔豬出現水樣腹瀉和嘔吐癥狀，新生仔豬感染后常發生嚴重失水和死亡，斷奶豬和育肥豬患病后出現4?6天水樣腹瀉，康復后生長發育受到影響，育肥后期體重出現減損。由于該病病程短，傳播快，致使該病在我國以及世界各國的傳播非常廣泛，每年都造成嚴重的經濟損失。
[0003]豬流打性腹丨與病毒的王要結構蛋白包括N蛋白、M蛋白、S蛋白、sM蛋白，其中S蛋白暴露于病毒粒子外表面，具有較高的保守性、特異性。目前檢測PEDV常用的方法主要包括:病毒分離鑒定法，免疫熒光檢測法，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測法，PCR檢測法等方法。
[0004]病毒分離鑒定法是通過流行病學、病變和癥狀可做初步判斷，進一步確診需要實驗室分離培養鑒定病毒，分離鑒定病毒一般可采用乳豬接種試驗和細胞培養兩種方法。該方法是目前較為通用的方法，其特點是準確、操作簡單，但是需要時間較長，且結果誤差較大，人力物力花費較大，不適應實際應用中快速檢測的需要。免疫熒光檢測，通過熒光素標記二抗的結合，將信號進行放大，通過熒光顯微鏡觀察鑒定，這在一定程度上提高了檢測的靈敏度，但是免疫熒光法中常因為熒光抗體不夠穩定，且判定主觀性較強，易出現交叉反應，同時，該方法需要熒光顯微鏡等特殊設備，所以應用時有許多局限性。ELISA法是當前應用最廣泛的一種免疫學檢測方法，是一種可以做定性或半定量檢測的快速檢測方法，已發展了間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、競爭ELISA和阻斷ELISA等，雖然在一定程度上縮短了檢測時間，但仍然需要專門的儀器(如酶標儀)，操作過程仍較復雜。PCR檢測技術是通過設計PEDV基因組上保守序列的引物，再通過PCR擴增，進行檢測，該檢測方法靈敏度高，結果可靠，但測定方法繁瑣、費時，效率低、成本高，常受到樣品中糞便自身的成分和糞便中其他細菌、病毒干擾，需要有專門的檢測設備，同時操作人員需要經過專業培訓，難以普及。
[0005]免疫層析技術是近年來發展起來的一種簡易快速的免疫學檢測技術，是以膠體金為標記物的快速免疫結合試驗，抗原、抗體在NC膜上進行反應。該技術具有特異性強、靈敏度高、穩定性好、操作簡便、快速、結果直觀、無須儀器設備等優點，操作人員不需要進行專業培訓即可操作，減輕了勞動強度，具有廣泛應用價值。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法。[0007]為了達到所述的目的本發明采用了以下技術手段:
[0008]本發明的一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條，如圖1所示，所述試紙條按照連接順序依次包括樣品墊，膠體金墊，硝酸纖維素膜，吸水紙及位于下方的作為組裝平臺使用的PVC底板，所述硝酸纖維素膜與膠體金墊之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與吸水紙之間有搭接，所述膠體金墊是由吸附有膠體金標記的抗PEDV單克隆抗體的玻璃纖維素膜組成，所述硝酸纖維素膜上具有山羊抗鼠IgG包被的質控線，以及兔抗PEDV S蛋白多克隆抗體包被的檢測線，樣品墊提供了待測樣品加入的位置。其中，所述的抗PEDV單克隆抗體由雜交瘤細胞分泌產生，所述的雜交瘤細胞命名為雜交瘤細胞株OT7，保藏在中國典型培養物保藏中心，地址在湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心，其菌種保藏編號為:CCTCC C201392.，保藏日期為2013年7月6日。
[0009]在本發明中，通過雙抗體夾心ELISA檢測方法驗證，表明:1.本發明的抗PEDV單克隆抗體具有較高的靈敏性，最小病毒檢出量約為10_5個TCID50，與RT-PCR檢測方法靈敏度一致；2.該單克隆抗體具有較強的特異性，通過對引起豬病毒性腹瀉的常見病原體豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒進行檢測，均為發生交叉反應；3.該單克隆抗體具有較好的檢測穩定性，通過比較相同批次和不同批次間的檢測結果，經統計學分析差異不顯著；4.該單克隆抗體對不同地區的PEDV都可以較好的檢出，通過對國內三個不同地區的發病豬場樣品進行檢測，檢測結果均為陽性，因此可用于豬流行性腹瀉病毒的檢測。
[0010]在本發明中，優選的，所述的PEDFV S蛋白多克隆抗體是通過以下方法制備:將純化的PEDV S蛋白，分別經3次免疫家兔后采取抗血清。多克隆抗體經辛酸-飽和硫酸按法粗提，再經proteinA親和層析柱純化,經測定抗體純度達到95%。
[0011]在本發明中，優選的，所述的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體是通過以下方法制備:用純化的小鼠IgG免疫山羊，獲得高免血清后，純化得到山羊抗小鼠IgG多克隆抗體血清(山羊抗鼠二抗)。
[0012]在本發明中，優選的，所述的質控線是通過將山羊抗鼠IgG多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在硝酸纖維素膜上得到的；所述的檢測線是通過將兔抗PEDV S蛋白多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在在硝酸纖維素膜上得到的；檢測線和質控線間隔0.5cm。
[0013]進一步的，優選的，將包被后的硝酸纖維素膜于含1% (w/w)BSA,0.2% (v/v)Tween20、pH5.4 的 0.05mol/L Tris-HCl 溶液中室溫封閉 10_60min，再用 0.05moI/LNaH2PO3漂洗兩次后，4 °C干燥備用。
[0014]在本發明中，優選的，所述的膠體金墊是通過以下方法制備得到:
[0015](I)將所有玻璃器皿清洗干凈，然后浸泡在洗液中24h ;取出后用自來水沖洗8遍，蒸餾水沖洗3遍，烘干后將玻璃容器浸泡于含有5% (w/v)的二氯二鉀硅烷的氯仿溶液中Imin，然后用去離子水沖洗，再干燥備用；
[0016]其中，所述的洗液按照以下方法制備:重鉻酸鉀lOOOg，濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml，混勻；
[0017](2)向步驟(I)處理后的玻璃器皿中加入0.01% (w/w)氯金酸溶液IOOmL,在磁力攪拌器上攪拌加熱，迅速加入2.5mLl% (w/w)檸檬酸鈉溶液，繼續加熱煮沸5-10min，溶液顏色逐漸由深藍色轉為橙紅色，色澤鮮艷，停止煮沸，并回流至體積為100ml，然后用電鏡鏡檢，制備的膠體金溶液的金顆粒大小一致，均勻，顆粒直徑為20nm，4°C密閉避光保存備用；
[0018](3)用0.lmol/L的K2CO3將步驟(2)的膠體金溶液的pH值調至pH5.2，在避光條件下放到搖床上緩慢震蕩，取純化的抗PEDV單克隆抗體逐滴加入至終濃度為0.125mg/ml,繼續震蕩30min，靜置lOmin，加入BSA作為穩定劑，使其終濃度達到1% (w/w)，再緩慢震蕩30min,得到金標單抗溶液；
[0019](4)將金標單抗溶液以4°C、2000r/min離心IOmin除去其中的膠體金聚合物,然后取上清，再以4°C, 12000r/min離心60min,可見離心物分為3層，上清液含有尚未結合的單抗，最下面的深黑色斑點即為尚未結合的膠體金顆粒聚合物，中間呈紫紅色的絮狀沉淀即為結合良好的金標單抗復合物；
[0020](5)收集紫紅色絮狀沉淀，用與步驟(4)第一次離心后取得上清的相同體積的含1% (w/w) BSA 的 IOmmoI/L pH5.2PBS 懸浮，4°C避光保存備用；
[0021](6)先將玻璃纖維膜浸泡在pH5.2含3%(w/w)BSA、0.1%(v/v)Tween_80 的0.02mol/L Tris-HCl溶液中30min，4°C過夜干燥備用；按每條玻璃纖維膜的大小為0.7cm寬X7cm長計算，將0.7ml膠體金探針均勻噴灑在玻璃纖維上，在室溫下烘干。
[0022]進一步的，本發明還提出了所述的免疫膠體金試紙條在制備檢測豬流行性腹瀉病毒試劑中的應用。
[0023]本發明的試劑條可以直接采取發病豬的糞便作為檢測樣品，取少量糞便溶解在ImLl.00.1mol/mL PBS中，取50 y L溶液即可進行檢驗。
[0024]結果判斷:陽性結果，質控線、檢測線均呈現紅色條帶，說明有PEDV存在。陰性結果，檢測線不出現紅色條帶，質控線呈現紅色條帶，說明樣本中沒有PEDV存在。如果檢測線、質控線均不出現紅色條帶或僅有檢測線出現紅色條帶，則說明產品失效。
[0025]本發明與目前常見檢測方法比較具有下列優點:
[0026]本發明制備的抗PEDV單克隆抗體，經特性試驗表明，該單抗具有靈敏性高，特異性強，穩定性好等特點。
[0027]本發明的檢測PEDV的免疫膠體金試紙條，具有特異性強，與常見引起豬腹瀉的病毒無反應；穩定性好，批次內和批次間制備的膠體金試紙條都有很好的檢出效果。
[0028]本發明的免疫膠體金試紙條具有操作簡單，克服傳統檢測方法中對樣品進行反復凍融，離心的復雜的前期處理工藝，對技術人員無需特殊培訓，無需特殊設備要求檢測成本低。
[0029]本發明的免疫膠體金試紙條檢測快速，只需5?10分鐘即可讀取結果，適合現場檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為試紙條正視圖及正面各區段說明；
[0031]1.PVC底板、2.吸水紙、3.質控線、4.檢測線、5.硝酸纖維素膜、6.膠體金墊、7.樣
品塾；
[0032]圖2為試紙條側視圖及各區段說明；
[0033]1.PVC底板、2.吸水紙、3.質控線、4.檢測線、5.硝酸纖維素膜、6.膠體金墊、7.樣
品塾；[0034]圖3為試紙條檢測結果說明；
[0035]圖4為利用本發明所得到的單克隆抗體進行雙抗體夾心ELISA檢測與PCR檢測方法靈敏度的比較結果；
[0036]A為利用本發明所得到的單克隆抗體進行雙抗體夾心ELISA檢測的結果；B為RT-PCR對不同滴度病毒的檢測結果；
[0037]M =DNA分子量標準，I:2倍稀釋，2:22倍稀釋，3:23倍稀釋，4:24倍稀釋，5:25倍稀釋，6:26倍稀釋，7:27倍稀釋，8:28倍稀釋，9:29倍稀釋
[0038]圖5為膠體金免疫層析試紙條特異性試驗結果；
[0039]1.試紙條對TGEV檢測結果；2.試紙條對CRSV檢測結果；3.試紙條對PPV檢測結果;
[0040]圖6為膠體金試紙條重復性試驗結果；
[0041]1、2分別兩個批次制備的膠體金試紙條分別對PEDV細胞培養物進行檢測；
[0042]圖7為雙抗體夾心ELISA檢測方法的檢測結果；
[0043]1.2.雙抗體夾心ELISA檢測方法對陽性樣品的檢測結果3.4.雙抗體夾心ELISA檢測方法對陰性樣品的檢測結果；
[0044]圖8為對應于圖7的采用本發明的免疫膠體金試紙進行檢測的符合度檢測結果。
[0045]1.免疫膠體金對陰性樣品的檢測結果；2.免疫膠體金對陽性樣品檢測結果。 【具體實施方式】
[0046]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0047]實施例1PEDV S蛋白抗原制備
[0048]1、重組大腸桿菌pGEX-6P_Ps420/DH5a的構建
[0049]以陽性重組質粒pMD18-T_PPs420為模板，進行PCR擴增，將PCR產物Ps420與表達載體pGEX-6P-l連接，并轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆并測序。將構建的陽性表達質粒分別轉入表達宿主菌DH5 a中，選單克隆。具體制備方法記載在《中國獸醫科學》2009年07期，題為“豬流行性腹瀉病毒S基因片段的原核表達及其表達產物的反應原性” 一文中。
[0050]2、將重組大腸桿菌？6￡乂-6?-?8420/1)冊0，接種于液體培養基(含氨芐青霉素50 u g/mL)中，230r/m, 37°C培養12h活化。將活化菌體按1:100的比例接種于液體培養基的三角瓶中(含氨節青霉素50ii g/mL)，230r/m，37°C培養，待培養至150min時加入IPTG至其終濃度為0.61mmol/L進行誘導，繼續培養150min時結束誘導表達。經SDS-PAGE電泳分析目的帶表達后，進行大量上樣，用KCl染液染色，將目的條帶切下，碾碎后用PBS反復凍融，使蛋白溶于其中，將反復凍融的膠粒離心，取上清適量，加等量SDS上樣緩沖液，充分混勻，煮沸5分鐘，以誘導后菌體為對照，在12%SDS-PAGE上進行電泳分析純化結果。
[0051]實施例2抗PEDV單克隆抗體的制備
[0052]1、雜交瘤細胞的制備[0053]將PEDV VERO細胞培養物反復凍融三次后，以IOOOrpm離心，出去細胞碎片。取離心上清，加入PEG-6000溶解，3500rpm離心60min，棄上清取沉淀以STE溶解。在超速離心管內自上至下依次加入病毒溶液和30%，45%，60%的蔗糖溶液，IO5g離心5h，取病毒層溶液，去蔗糖后通過紫外分光光度測定病毒溶液濃度。
[0054]取純化的PEDV病毒，分3次免疫Balb/C小鼠，免疫劑量Img/次，免疫間隔14d，取免疫后小鼠的脾臟進行細胞融合，獲得能夠穩定分泌抗PEDV單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經western-blotting、免疫突光鑒定獲得單克隆抗體。經測定,次單克隆抗體特異性高、分泌穩定，亞類為IgGl。
[0055]所述的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株OT7，保藏在中國典型培養物保藏中心，地址在湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心，其菌種保藏編號為:CCTCCC201392.，保藏日期為2013年7月6日。
[0056]2、單克隆抗體的大量制備及提純:
[0057]取若干只6-8周齡健康BABL/c小鼠，腹腔注射0.5ml/只滅菌石蠟油作為致敏齊IJ，10日后再向腹腔注入105個生長良好的菌種保藏編號為CCTCC C201392雜交瘤細胞，12-15日后小鼠腹部腫脹，收取腹水，以4°C，3000r/min離心15min，取離心后上清用微孔濾膜過濾，除去較大的凝塊及脂肪滴，再以4°C、10000r/min離心15min除去細胞殘渣及小顆粒物質。首先采用辛酸-飽和硫酸按法對腹水進行粗提，向ImL腹水中加入2mL的乙酸緩沖液(0.06mol/L、PH5.0)，用鹽酸調PH至4.5，在室溫攪拌下在30min內逐滴加入33 y L辛酸，4°C靜置2h, 12000r/min離心30min,棄沉淀取上清,在上清中加入1/10體積的0.1mol/L PB (PH7.4,8.5%NaCI)，并用 lmol/L 的 NaOH 調 PH 至 7.4，在 4°C 冰浴下于 30min 內加入
0.277g/ml的硫酸按，至45%飽和度，靜置Ih以上，4°C下12000r/min離心30min，棄上清，沉淀溶于0.0lmoI/LPB, PH7.0，對100倍的上述PB于4°C透析過夜，0.5mol/L氯化鋇溶液檢測不出BaS04。然后采用蛋白G (GEHealthCare公司)親和層析方法進一步純化單抗,經測定抗體純度達到95%。
[0058]3、單克隆抗體特性檢測
[0059]3.1靈敏性實驗
[0060]將PEDV細胞培養物進行2倍比稀釋，利用本發明所得到的單克隆抗體通過建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法進行檢測，來驗證建本發明所述單克隆抗體的靈敏度，根據結果可知利用本發明所得到的單克隆抗體進行檢測，其最小病毒檢出滴度為:10_5_4，結果如圖4A所示。將相同滴度的病毒細胞培養物再通過提取病毒基因組RNA，進行RT-PCR方法進行檢測，其最小病毒檢出量為:10_5_4，結果如表4B所示。說明利用本發明所得到的單克隆抗體進行檢測和采用R T-PCR的方法進行的檢測具有相同的檢測靈敏度。
[0061]3.2特異性檢測
[0062]以能夠引起仔豬病毒性腹瀉的常見病原體TGEV、PPV、PRV、CSFV作為檢測原采用本發明的單克隆抗體進行ELISA檢測，結果如表I所示，結果表明本發明的單克隆抗體不與TGEV, PPV、PRV、CSFV反應，具有很強的特異性。
[0063]表I雙抗體夾心ELISA檢測方法特異性檢測結果
【權利要求】
1.一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述試紙條按照連接順序依次包括樣品墊，膠體金墊，硝酸纖維素膜，吸水紙及位于下方的作為組裝平臺使用的PVC底板，所述硝酸纖維素膜與膠體金墊之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與吸水紙之間有搭接，所述膠體金墊是由吸附有膠體金標記的抗PEDV單克隆抗體的玻璃纖維素膜組成，所述硝酸纖維素膜上包被有山羊抗鼠IgG多克隆抗體包被的質控線，以及兔抗PEDVS蛋白多克隆抗體包被的檢測線，樣品墊提供了待測樣品加入的位置； 其中，所述的抗PEDV單克隆抗體由雜交瘤細胞分泌產生，所述的雜交瘤細胞保藏在中國典型培養物保藏中心，其菌種保藏編號為=CCTCC C201392。
2.如權利要求1所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述的質控線是通過將山羊抗鼠IgG多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在硝酸纖維素膜上得到的；所述的檢測線是通過將兔抗PEDV S蛋白多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在在硝酸纖維素膜上得到的；檢測線和質控線間隔0.5cm。
3.如權利要求2所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，將包被后的硝酸纖維素膜于含 1% (w/w) BSA,0.2% (v/v) Tween20、pH5.4 的 0.05mol/L Tris-HCl 溶液中室溫封閉10-60min，再用0.05mol/L NaH2PO3漂洗兩次后，4°C干燥備用。
4.如權利要求1所述 的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述的膠體金墊是通過以下方法制備得到: (1)將所有玻璃器皿清洗干凈，然后浸泡在洗液中24h;取出后用自來水沖洗8遍，蒸餾水沖洗3遍，烘干后將玻璃容器浸泡于含有5% (w/v)的二氯二鉀硅烷的氯仿溶液中lmin，然后用去離子水沖洗,再干燥備用； 其中，所述的洗液按照以下方法制備:重鉻酸鉀lOOOg，濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml，混勻； (2)向步驟(I)處理后的玻璃器皿中加入0.01%(w/w)氯金酸溶液IOOmL,在磁力攪拌器上攪拌加熱，迅速加入2.5mLl% (w/w)檸檬酸鈉溶液，繼續加熱煮沸5-10min，溶液顏色逐漸由深藍色轉為橙紅色，色澤鮮艷，停止煮沸，并回流至體積為100ml，然后用電鏡鏡檢，制備的膠體金溶液的金顆粒大小一致，均勻，顆粒直徑為20nm，4°C密閉避光保存備用； (3)用0.lmol/L的1(20)3將步驟(2)的膠體金溶液的pH值調至pH5.2，在避光條件下放到搖床上緩慢震蕩，取純化的抗PEDV單克隆抗體逐滴加入至終濃度為0.125mg/ml，繼續震蕩30min，靜置lOmin，加入BSA作為穩定劑，使其終濃度達到1% (w/w),再緩慢震蕩30min，得到金標單抗溶液； (4)將金標單抗溶液以4°C、2000r/min離心IOmin除去其中的膠體金聚合物,然后取上清，再以4°C, 12000r/min離心60min,可見離心物分為3層,上清液含有尚未結合的單抗,最下面的深黑色斑點即為尚未結合的膠體金顆粒聚合物，中間呈紫紅色的絮狀沉淀即為結合良好的金標單抗復合物； (5)收集紫紅色絮狀沉淀，用與步驟(4)第一次離心后取得上清的相同體積的含1%(w/w) BSA的10mmol/L pH5.2PBS懸浮，4°C避光保存備用； (6)先將玻璃纖維膜浸泡在pH5.2 含 3% (w/w)BSA,0.1% (v/v)Tween-80 的 0.02mol/L Tris-HCl溶液中30min，4°C過夜干燥備用；按每條玻璃纖維膜的大小為0.7cm寬X 7cm長計算，將0.7ml膠體金探針均勻噴灑在玻璃纖維上，在室溫下烘干。
5.權利要求1-4任一項所述的免疫膠體金試紙條在制備檢測豬流行性腹瀉病毒試劑中的應用。
6.一種穩定分泌抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于所述的雜交瘤細胞保藏在中國典型培養物保藏中心，其菌種保藏編號為:CCTCCC201392。
7.抗豬流行性腹瀉病毒的單克隆抗體，其特征在于由權利要求6所述的雜交瘤細胞株分泌產生。
8.權利要求7所述的單克隆抗體在制備檢測豬 流行性腹瀉病毒試劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/91GK103454419SQ201310317343
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年7月25日 優先權日:2013年7月22日
【發明者】李一經, 唐麗杰, 喬薪瑗, 尹紀元, 王鏨彧 申請人:東北農業大學