專利名稱：高致病性豬繁殖與呼吸征病毒nasba-elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NASBA-ELISA檢測裝置，特別是一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒。
背景技術：
高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒是由變異型豬繁殖與呼吸綜合病毒引起豬的一種繁殖障礙和呼吸道疾病的急性高致死性疫病。自2006年下半年以來，由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的“高熱病”，造成了大量的豬群發病死亡，成為影響我國養豬業發展的巨大絆腳石。目前，檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒有多種，如病毒分離、 RT-PCR和實時熒光RT-PCR技術。病毒分離敏感度不高，而且操作煩瑣，成本較高，周期較長，對病料的要求較高；目前，廣泛應用的常規RT-PCR檢測方法簡單、方便、快速，但仍存在假陽性和PCR污染的問題；實時熒光RT-PCR ( real-time RT-PCR)技術雖然靈敏度較高，但儀器設備和技術含量都要求較高，不適合基層獸醫部門的診斷。依賴核酸序列的擴增(nucleuic acid sequence based amplification , NASBA)是在 PCR 基礎上發展起來的一種新技術，該項技術由I對帶有T7啟動子序列的引物引導的連續、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術，反應在41°C條件下進行，可在2 h內將模板RNA擴增109倍，比常規PCR 法高103倍，而且不需特殊儀器，是一種快速、簡便、特異的擴增技術，具有敏感性高、特異性好、操作簡單等特點，很適合基層獸醫部門推廣應用。當前，雖然梁海霞[1]等報道建立了高致病性豬生殖和呼吸綜合征病毒NASBA-ELISA檢測方法，但該方法存在以下缺陷1、 方法應用了兩種特異性探針，致使方法敏感性不高，僅能檢測到101·83TCID5ciAiI的病毒；2、 方法僅限于對高致病性豬生殖與呼吸綜合征病毒的檢測，未用于檢測臨床病料，無法知道其實際的應用效果。
發明內容
本發明目的在于克服現有技術的不足之處，而提供一種快速、簡便、敏感性高、特異性強的能解決基層獸醫部門診斷和防控高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒困難的問題， 減少豬群的發病率和死亡率，提聞養殖效益，促進養豬業持續、聞效和健康發展的聞致病性豬繁殖與呼吸征病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒。一種高致病性豬繁殖與呼吸征病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒，該試劑盒包括如下組分構成2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12mMMgCl2, 20%DMS0 (二甲基亞砜)，5mM DTT，0. 2mM上下游各引物，8URNA酶H，40URNA聚合酶，12U AMV酶，BSA， 上游引物為 Pl :5、-ACATGACGAGCTGCT-3 ,，下游引物 P2 :5、- CTAATACGACTCACTATAGGGA GAAGGGTCCACATCCACACCATC-3 '，其中“CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG”為 T7 啟動子序列；生物素探針5 ' - biotin-GATGTCGCCGCGGGAGTCT-3 ^，鏈霉親和素包被的ELISA板條、由 30%甲酰胺，6XSSC，0. 1%SDS, I Xdenhardt, O. lng/ml變性鮭魚精DNA構成的雜交液、地高辛抗體-P0D、底物POD、2M硫酸、TBST洗滌液、陽性對照、陰性對照；
所述的陽性對照、陰性對照為以酶標儀測定OD49tol的值，陽性對照OD49tol均值在O. 6以上。當樣品OD49tlnm彡2. I*陰性對照的OD49tlnm值時，結果判定為陽性；當樣品OD49tol < 2. I* 陰性對照的OD49tlnm值時，結果判定為陰性。以下說明本發明高致病性豬繁殖與呼吸征病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒組分的選用理由及其具體操作方法
(一)病毒RNA提取RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent說明書進行。( 二)NASBA反應體系及反應條件的建立
I、反應體系共25μ1 5μ1的RNA產物，20μ1的擴增試劑(包含4mMNTP, 2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12mMMgcl2, DMSO (二甲基亞砜)20%，5mM DTT,0. 2mM 上下游各引物，加入DEPC水處理過的PCR管中，65 °C 5min，42 V冷卻5min，快速加上混合酶 5μ1 (包含 8URNA 酶 H，40URNA 聚合酶，12U AMV 酶，2. 6PgBSA)，緩慢混勻，41°C 100 min, -20°C終止反應。2、特異性測定
提取經典 PRRSV-VR2332、高致病性 PRRSV-FJ07A、CSFV, PCV2, PRV 等病毒的 RNA 或 DAN 分別進行NASBA擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，結果只高致病性PRRSV-FJ07A有擴增出目的條帶，其他為陰性。(圖I)。3、DMSO濃度優化
DMSO按5%、10%、15%、20%、25%系列濃度加入NASBA反應體系中進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其產物，結果反應體系中最佳的DMSO濃度為20%，該濃度時條帶清晰。(圖2)
4、Mg2+濃度[D1]
MgCl2按4mM、7mM、IOmM, 12mM濃度加入NASBA反應體系中進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其產物，結果反應的最佳Mg2+濃度為12mM。(圖3)。5、反應溫度優化
將反應溫度分別設置在30°C、35°C、4rC進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其產物，結果反應的最佳溫度為41°C (圖4)。綜上所述建立NASBA檢測方法的最佳反應體系和條件是反應體系共25μ1 5μ1 的 RNA 產物，20μ1 的擴增試劑(包含 4mMNTP, 2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12111^%(312，01^0(二甲基亞砜)20%，51111 DTT，0. 2mM 上下游各引物，加入 DEPC 水處理過的PCR管中，650C 5min, 42°C冷卻5min，快速加上混合酶5μ1 (包含8URNA酶H，40URNA 聚合酶，12U AMV酶，2. 6PgBSA)，緩慢混勻，41 °C 100 min, _20°C終止反應。(三)建立ELISA檢測方法。目的是檢測NASBA產物
I、鏈霉親和素包被的ELISA板條制備①用含25 Pg/mL鏈霉親和素的O. 05mol/ L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)包被96孔板，每孔ΙΟΟμΙ，室溫孵育過夜。②用含3% BSA的
0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)封閉96孔板，每孔ΙΟΟμΙ，37°C孵育2 h，TBST洗滌3 次，一 20°C保存備用。2、NASBA擴增產物ELISA檢測(I)在霉親和素包被的微孔板，每孔加入44μ1雜交液， μ 生物素探針，5μ1 NASBA擴增產物(95°C加熱2mim)，共50μ1，輕微振蕩混勻，42°C孵育2h。TBST洗板3次。(2)每孔加入ΙΟΟμΙ抗地高辛抗體(I :1000稀釋)，37°C作用30min, TBST洗板6次。(3)每孔加入ΙΟΟμΙ P0D，37°C避光顯色IOmin后，每孔加入2M硫酸ΙΟΟμΙ終止顯色。(4)酶標儀測定OD49tlnm的值。(5)判斷標準陽性對照OD49tol均值在0. 6以上。當樣品OD49tlnm≥2. I*陰性對照的OD49tol值時，結果判定為陽性；當樣品OD49tlnm < 2. I*陰性對照的OD49tol值時，結果判定為陰性。該判定標準是通過檢測20份陽性樣品和20份陰性樣品，采用統計學軟件分析得到
O3、特異性測定
利用建立的NASBA方法，對高致病性PRRSV-FJ07A、經典PRRSV VR-2332、CSFV, PRV, PCV2、陽性品及MC-145細胞的RNA或DNA進行NASBA擴增，同時設定水為模板進行NASBA產物為陰性對照，產物采用ELISA檢測，結果見表I。結果顯示高致性PRRSV-F J07A為陽性， 其他RNA或DNA病毒為陰性，由此表明本試驗建立的NASBA-ELISA方法具有很好的特異性。 表I. NASBA-ELISA的特異性試驗
權利要求
1.一種高致病性豬繁殖與呼吸征病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒，該試劑盒包括如下組分構成2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12mMMgCl2, 20%DMS0 (二甲基亞砜)，5mM DTT，0. 2mM上下游各引物，8URNA酶H，40URNA聚合酶，12U AMV酶，BSA，上游引物為 Pl :5、-ACATGACGAGCTGCT-3 ,，下游引物 P2 :5、- CTAATACGACTCACTATAGGGAGA AGGGTCCACATCCACACCATC-3 ^，其中“CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG”為 T7 啟動子序列；生物素探針5 ' - biotin-GATGTCGCCGCGGGAGTCT-3 '，鏈霉親和素包被的ELISA板條、由30% 甲酰胺，6XSSC，0. 1%SDS, I Xdenhardt, O. lng/ml變性鮭魚精DNA構成的雜交液、地高辛抗體-P0D、底物POD、2M硫酸、TBST洗滌液、陽性對照、陰性對照；所述的陽性對照、陰性對照為以酶標儀測定OD49tol的值，陽性對照OD49tol均值在O. 6以上，當樣品OD49tlnm ^ 2. I*陰性對照的OD49tol值時，結果判定為陽性；當樣品OD49tol < 2. I* 陰性對照的OD49tlnm值時，結果判定為陰性。
全文摘要
本發明公開了一種高致病性豬繁殖與呼吸征病毒NASBA-ELISA檢測試劑盒，其包括2mMdNTP,2.46n MDig-11-UTP，10mMKcl，40mMTris-Hcl，12mMMgCl2,20%DMSO(二甲基亞砜)，5mMDTT，0.2mM上下游各引物，8URNA酶H，40URNA聚合酶,12UAMV酶,BSA，上游引物為P15ˋ-ACATGACGAGCTGCT-3ˊ，下游引物P25ˋ–CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCCACATCCACACCATC-3ˊ，其中“CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG”為T7啟動子序列；生物素探針5ˋ-biotin-GATGTCGCCGCGGGAGTCT-3ˊ，鏈霉親和素包被的ELISA板條、由30%甲酰胺，6×SSC，0.1%SDS，1×denhardt，0.1ng/ml變性鮭魚精DNA構成的雜交液、地高辛抗體-POD、底物POD、2M硫酸、TBST洗滌液、陽性對照、陰性對照。其提供了一種快速、簡便、敏感性高、特異性強的能解決基層獸醫部門診斷和防控高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒困難的問題，減少豬群的發病率和死亡率，提高養殖效益，促進養豬業持續、高效和健康發展。
文檔編號C12Q1/68GK102586482SQ201210046548
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者吳學敏, 周倫江, 莊向生, 王隆柏, 車勇良, 陳如敬, 魏宏 申請人:吳學敏, 周倫江, 莊向生, 王隆柏, 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所, 車勇良, 陳如敬, 魏宏