改良的grg23epsp合酶：組合物和使用方法

改良的grg23 epsp合酶：組合物和使用方法
【專利摘要】本發明提供了賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子除草劑抗性或耐性的組合物和方法。組合物包括編碼除草劑抗性或耐性多肽的多核苷酸、包含那些多核苷酸的載體以及包含所述載體的宿主細胞。本發明的核苷酸序列可以在DNA構建物或表達盒中使用，用于在生物體——包括微生物和植物——中轉化和表達。組合物也包括轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。具體而言，提供了編碼草甘膦抗性或耐性多肽的分離的多核苷酸。此外，也包括與多核苷酸對應的氨基酸序列。尤其是，本發明提供了分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQ?ID?NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35中示出的氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ?ID?NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中列出的核苷酸序列。
【專利說明】改良的GRG23 EPSP合酶:組合物和使用方法
[0001]本申請為分案申請，原申請的申請日為2007年11月20日，申請號為200780049630.6 (PCT/US2007/085164)，發明名稱為“改良的GRG23EPSP合酶:組合物和使
用方法”。
【技術領域】
[0002]本發明涉及植物分子生物學，特別是涉及新型EPSP合酶多肽，所述合酶多肽賦予增加的對除草劑草甘膦的抗性和耐性。
【背景技術】
[0003]N-膦酰甲基甘氨酸，一般稱為草甘膦，是重要的農學化學制品。草甘膦抑制將磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)轉化為5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。這種酶(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，本文稱為“EPSP合酶”或“EPSPS”)的抑制通過關閉莽草酸途徑，從而抑制芳香族氨基酸的生物合成來殺死植物細胞。
[0004]由于草甘膦類除草劑抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它們不僅殺死植物細胞，而且也對細菌細胞具有毒性。草甘膦抑制多種細菌EPSP合酶，因而對這些細菌具有毒性。然而，某些細菌EPSP合酶對草甘膦具有高的耐性。
[0005]可以通過轉化植物細胞以表達抗草甘膦的細菌EPSP合酶來產生抗草甘膦毒性的植物細胞。值得注意，來自根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的細菌基因已經被用于在植物中表達之后賦予植物細胞除草劑抗性。來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突變EPSP合酶賦予細菌細胞草甘膦抗性，并且賦予植物細胞草甘膦抗性(美國專利第4，535，060、4，769，061和5，094，945號)。
[0006]美國專利第6，040，497號報道了突變玉米EPSP合酶，其在102位具有蘇氨酸到異亮氨酸的置換并且在106位具有脯氨酸到絲氨酸的置換(“TIPS”突變)。這樣的改變賦予了玉米酶草甘膦抗性。來自鼠傷寒沙門氏菌菌株CT7的突變EPSP合酶賦予細菌細胞的草甘膦抗性，并且據報道賦予植物細胞草甘膦抗性(美國專利第4，535，060,4, 769，061和5，094，945 號)。He 等，((2001) Biochim et Biophysica Actal568:1-6)已經通過在大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒沙門氏菌EPSP合酶基因之間進行誘變和重組而開發了具有增加的草甘膦耐性的EPSP合酶，并且提出在位置42 (T42M)和位置230 (Q230K)的突變可能是造成觀測到的抗性的原因。后續工作(He 等，(2003) Biosc1.Biotech.Biochem.67:1405-1409)顯示，T42M突變(蘇氨酸到甲硫氨酸)足以提高大腸桿菌酶和鼠傷寒沙門氏菌酶兩者的耐性。由于除草劑抗性植物提供的許多優勢，除草劑抗性基因改善的抗草甘膦活性是期望的。
[0007]誘變的可選方法是“變換誘變(permutational mutagenesis)”方法,所述方法在2006年6月13日提交的美國專利申請第60/813,095號中被描述。

【發明內容】

[0008]提供了賦予抗性或耐性的組合物和方法。組合物包括抗草甘膦除草劑的EPSP合酶，以及編碼這種酶的核酸分子，包含那些核酸分子的載體和包含這些載體的宿主細胞。組合物包括編碼除草劑抗性多肽的核酸分子，其包括編碼包含SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、
19、21、23、25、27、29、31、33 或 35 的多肽的那些核酸分子，以及 SEQ ID NO:6、8、10、12、14、
16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的多核苷酸序列。編碼序列可以在DNA構建物或表達盒中使用，用于在生物體一包括微生物和植物一中轉化和表達。組合物還包括轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子，它們通過將本發明的組合物引入到生物體的基因組中而具有草甘膦抗性。在所述生物體是植物時，序列的引入允許含草甘膦的除草劑應用到植物以選擇性地殺死對草甘膦敏感的雜草或其它未轉化的植物，但是不殺死轉化的生物體。該序列可以另外用作標記，用于選擇在草甘膦條件下生長的植物細胞。
[0009]另外提供了鑒定具有抗草甘膦活性的EPSP合酶的方法。所述方法包括在本發明的結構域存在的基礎上鑒定對草甘膦具有抗性的另外的EPSP合酶序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1 顯示 GRG23(acel) ( “M5”，SEQ ID NO: 10)在 37。。0 至 25 小時相比于野生型GRG23 ( “WTGRG23”，SEQ ID NO: 2)的酶促活性。
[0011]圖2示出了 GRG23和幾種變體對草甘膦的抗性，表示為抑制常數，或I。
[0012]圖3示出了 GRG23和GRG23變體在37°C的半衰期。
【具體實施方式】
[0013]現在本發明將在下文中參考附圖更充分地進行描述，其中，本發明的一些但不是全部實施方式被示出。實際上，這些發明可以以許多不同的形式加以體現并且不應該被解釋為限于本文提出的實施方`式；相反，這些實施方式被提供以使本公開滿足可適用的法律要求。在全文中同樣的數字是指同樣的要素。
[0014]本發明相關領域的技術人員在了解了前述描述和相關附圖中給出的教導的益處之后將會想到本文提出的發明的許多修改和其它實施方式。因此，應當理解，本發明不限于公開的【具體實施方式】并且修改和其它實施方式擬被包括在所附權利要求的范圍之內。雖然本文使用了具體術語，但它們只以一般性和描述性的意義被使用，并不用于限制的目的。
[0015]本發明涉及用于調節生物體、尤其是植物和植物細胞中的除草劑抗性的組合物和方法。所述方法包括用編碼本發明的抗草甘膦基因的核苷酸序列轉化生物體。本發明的核苷酸序列可用于制備對除草劑草甘膦顯示出增加的抗性的植物。因而，本發明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐性”基因意指 SEQ ID N0:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中列出的核苷酸序列及其片段和變體，所述片段和變體編碼草甘膦抗性或耐性多肽。同樣，本發明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐性”多肽是具有SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、19、
21、23、25、27、29、31、33或35列出的氨基酸序列的多肽及其片段和變體，所述片段和變體賦予宿主細胞草甘膦抗性或耐性。
[0016]A.分離的多核苷酸及其變體和片段
[0017]在一些實施方式中，本發明包括分離的、重組的或純化的多核苷酸。“分離的”“或“純化的”多核苷酸或多肽、或其生物學活性部分在通過重組技術產生時基本上不含其它的細胞材料或培養基，或在化學合成時基本上不含化學前體或其它化學制品。“生物學活性的”意指具有天然多肽的所需生物學活性，也就是說，保持抗除草劑活性。“分離的”多核苷酸可以不含這樣的序列(例如，蛋白質編碼序列)，所述序列天然地位于生物體的基因組DNA中的核酸側翼(即，位于所述核酸的5’和3’端的序列)，所述多核苷酸來源于所述生物體。對于本發明的目的，“分離的”當用于指多核苷酸時不包括分離的染色體。例如，在各種實施方式中，分離的草甘膦抗性編碼多核苷酸可以包含小于大約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其天然地位于細胞的基因組DNA中的多核苷酸的側翼，所述多核苷酸來源于所述細胞。[0018]本發明的多核苷酸包括編碼包含SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的草甘膦抗性多肽的那些多核苷酸，以及SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、
20、22、24、26、28、30、32或34的多核苷酸序列。
[0019]“草甘膦”意指N-膦酰甲基甘氨酸的任何除草劑形式(包括其任何鹽)和導致草甘膦陰離子在植物中(in planta)產生的其它形式。“除草劑抗性蛋白”或由“除草劑抗性編碼核酸分子”的表達產生的蛋白質包括這樣的蛋白質，其賦予細胞比不表達所述蛋白質的細胞耐受更高濃度的除草劑的能力，或賦予比不表達所述蛋白質的細胞耐受某一濃度的除草劑更長時間的能力。“草甘膦抗性蛋白”包括這樣的蛋白質，其賦予細胞比不表達所述蛋白質的細胞耐受更高濃度的草甘膦的能力，或者比不表達所述蛋白質的細胞耐受某一濃度的草甘膦更長一段時間的能力。“耐受”或“耐性”意指存活或以不容易與未處理細胞區別的方式進行基本的細胞功能，例如蛋白質合成和呼吸。
[0020]本發明進一步考慮本文描述的多核苷酸的變體和片段。多核苷酸的“片段”可以編碼多肽的生物學活性部分，或其可以是采用本文其它地方公開的方法可用作雜交探針或PCR引物的片段。取決于意圖的用途，多核苷酸——其是多核苷酸的片段——包括至少大約
15、20、50、 75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、I100、I150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950個連續核苷酸，或可達存在于本文公開的全長多核苷酸的核苷酸數(例如包含SEQ ID NO:1的EPSP合酶多核苷酸)。“連續”核苷酸意指彼此緊鄰的核苷酸殘基。
[0021]本發明的多核苷酸片段一般將編碼保持全長草甘膦抗性蛋白的生物學活性——即抗除草劑活性——的多肽片段。“保持抗除草劑活性”意指所述片段將具有本文公開的如SEQ ID N0:2、3或5的全長草甘膦抗性蛋白的至少大約30%，至少大約50%、至少大約70%、至少大約 80%、85%、90%、95%、100%、110%、125%、150%、175%、200%、250%、至少大約 300% 或以上的抗除草劑活性。測量抗除草劑活性的方法在本領域內是熟知的。參見，例如，美國專利第4，535，060和5，188，642號，其每一個通過引用以其全部并入本文。
[0022]編碼本發明多肽的生物學活性部分的多核苷酸片段將編碼至少大約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400個連續氨基酸，或可達存在于本發明的全長多肽中的氨基酸的總數。
[0023]本發明也包括變體多核苷酸。多核苷酸的“變體”包括編碼本文公開的多肽但由于遺傳密碼的簡并性而保守地不同的那些序列，以及足夠相同的那些序列。
[0024]術語“足夠相同的”意指采用標準參數，應用比對程序之一，與參考序列相比具有至少大約60%或65%的序列同一性、大約70%或75%的序列同一性、大約80%或85%的序列同一性、大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽或多核
苷酸序列。本領域普通技術人員將會認識到這些值可以適當調整以通過考慮密碼簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等來確定由兩個多核苷酸編碼的多肽的對應同一性。
[0025]細菌基因很經常具有多個靠近開放閱讀框起點的甲硫氨酸起始密碼子。通常，在一個或多個這些起始密碼子的翻譯起始將導致功能蛋白質的產生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。然而，細菌如芽孢桿菌(Bacillus sp.)也識別密碼子GTG作為起始密碼子，并且在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質包含在第一個氨基酸處的甲硫氨酸。而且，經常不能先驗確定這些密碼子中的哪個在細菌中天然使用。因而，應理解的是，可選的甲硫氨酸密碼子之一的使用可導致賦予除草劑抗性的變體產生。這些除草劑抗性蛋白被包括在本發明中并且可以在本發明的方法中使用。
[0026]可以應用熟知的分子生物學技術，如下面概述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術，鑒定天然發生的等位基因變體。變體多核苷酸也包括合成來源的多核苷酸，其通過例如采用定點誘變或其它誘變策略產生，但是仍然編碼具有期望的生物學活性的多肽。
[0027]技術人員將進一步理解，可以通過進一步突變本發明的多核苷酸從而導致所編碼的多肽的氨基酸序列的進一步改變但不改變所述多肽的生物學活性來引入改變。因而，分離的變體多核苷酸可以通過引入一個或多個額外的核苷酸置換、添加或缺失到編碼本文公開的EPSP合酶結構域的相應多核苷酸中而產生，以使一個或多個氨基酸置換、添加或缺失被引入到所編碼的多肽中。進一步的突變可以通過標準技術如定點誘變和PCR介導的誘變或基因改組(gene shuffling)技術引入。這種變體多核苷酸也被本發明包括。
[0028]變體多核苷酸可以通過沿著全部或部分編碼序列隨機引入突變，如通過飽和突變來制備，并且可以篩選得到的突變體賦予抗除草劑活性的能力，以鑒定保持活性的突變體。
[0029]基因改組或有性PCR (sexual PCR)法(例如，Smith(1"4)Nature370:3M-325 ;美國專利第5,837,458,5,830`, 721,5,811,238和5，733，731號，其每一篇通過引用被并入本文)可以被用于進一步修飾或增強具有本發明的EPSP合酶結構域的多核苷酸和多肽(例如，賦予草甘膦抗性的多肽)。基因改組包括幾種突變DNA的隨機斷裂，然后通過PCR將它們重裝配成全長分子。各種基因改組法的例子包括但不限于，DNase處理后的裝配、交錯延伸法(staggered extension process, STEP)和體外隨機引發重組(random priming invitro recombination)。在DNase介導的方法中，用DNaseI將從陽性突變體庫分離的DNA區段切割成隨機片段并且在未添加引物的情況下進行多輪PCR。當PCR循環進行時，隨機片段的長度接近未切割的區段的長度，導致在不同的克隆中的突變混合在一起并且在一些得到的序列中累積。多個循環的選擇和改組已經導致幾種酶的功能增強(Stemmer(1994)Nature370:389-391 ;Stemmer (1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751 ；Crameri等，(1996) Nat.Biotechnol.14: 315-319 ;Zhang 等，(1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509 ;和 Crameri 等，(1997)Nat.Biotechnol.15:436-438)。可以例如對編碼具有本發明的序列結構域的多肽的多核苷酸進行這類方法，以產生賦予草甘膦抗性的多肽。
[0030]應用方法如PCR、雜交等，相應除草劑抗性序列可以通過尋找本發明的EPSP合酶結構域來鑒定。見，例如，Sambrook 和 Russell (2001)，Molecular Cloning: A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)和 Innis 等，(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press, NY)。
[0031]B.分離的蛋白質及其變體和片段
[0032]除草劑抗性多肽也被包括在本發明之內。基本上不含細胞材料(cellularmaterial)的除草劑抗性多肽包括具有小于大約30%、20%、10%或5% (按干重計)的非除草劑抗性多肽(本文也稱為“污染蛋白質”)的多肽制劑。在本發明中，“除草劑抗性蛋白”意指具有本發明的序列結構域的EPSP合酶多肽。片段、生物活性部分、及其變體也被提供，并且可以被用于實踐本發明的方法。
[0033]“片段”或“生物活性部分”包括多肽片段，其含有編碼除草劑抗性蛋白的氨基酸序列的一部分并保持抗除草劑活性。除草劑抗性蛋白的生物學活性部分可以是多肽，所述多肽的長度為例如10、25、50、100個或更多的氨基酸。這種生物學活性部分可以通過重組技術制備并且可以評價抗除草劑活性。
[0034]“變體”意指具有這樣的氨基酸序列的蛋白質或多肽，所述氨基酸序列與具有本發明的EPSP合酶結構域的EPSP合酶多肽具有至少大約60%、65%、大約70%、75%、大約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。本領域普通技術人員將會意識到這些值可以被適當調整以通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等來確定由兩個多核苷酸編碼的多肽的對應同一丨I"生。
[0035]例如，可以在一個或多個非必需氨基酸殘基處進行保守氨基酸置換。“非必需的”氨基酸殘基是可以在多肽的野生型序列中加以改變而不改變生物學活性的殘基，而“必需的”氨基酸殘基對于生物學活性是必需的。“保守氨基酸置換”是這樣的置換，其中氨基酸殘基用具有相似側鏈的氨基酸殘基置換。具有相似側鏈的氨基酸殘基家族在本領域中已經被定義。這些家族包括具有堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、無荷電極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3 -支 化側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。氨基酸置換可以在保持功能的非保守區進行。一般而言，將不會對保守的氨基酸殘基或對位于保守基序中的氨基酸殘基一其中這類殘基對于多肽活性是必需的——進行這樣的置換。然而，本領域普通技術人員將會理解，功能變體可以在保守殘基中具有不重要的保守或非保守改變。
[0036]本發明的多肽或其變體或片段的抗體也被包括。產生抗體的方法在本領域是熟知的(參見，例如，Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:ALaboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY;美國專利第 4，196，265 號)。
[0037]C.多核苷酸構建物
[0038]編碼本發明的EPSP合酶多肽的多核苷酸可以被修飾以獲得或增強在植物細胞中的表達。編碼本文鑒定的多肽的多核苷酸可以被提供于表達盒中，所述表達盒用于在目標植物中表達。“植物表達盒”包括DNA構建物——包括重組DNA構建物，其能夠導致多核苷酸在植物細胞中的表達。所述盒可以包括以5’-3’的轉錄方向、可操作地連接到一個或多個感興趣多核苷酸的轉錄起始區(即，啟動子，特別是異源啟動子)、和/或植物中發揮功能的翻譯和轉錄終止區(即，終止區)。所述盒可以額外包含至少一個將被引入到生物體的額外多核苷酸，如選擇性標記基因。可選地，額外的多核苷酸(一個或多個)可以被提供在多個表達盒上。這種表達盒被提供有多個限制性位點，用于插入所述多核苷酸(一個或多個)，使之受調節區的轉錄調節。
[0039]“異源的”一般是指這樣的多核苷酸或多肽，其對于細胞而言不是內源的或對于它存在的天然基因組中的位置而言不是內源的，并且其通過感染、轉染、顯微注射、電穿孔、顯微投影等被加入到細胞中。“可操作地連接”意指兩個多核苷酸之間的功能連接。例如，當啟動子可操作地連接到DNA序列時，該啟動子序列起始并且調節所述DNA序列的轉錄。已經認識到，可操作地連接的多核苷酸可以相鄰或可以不相鄰，并且在用于指兩個多肽編碼區的接合時，所述多肽在同一閱讀框中表達。
[0040]啟動子可以是在選擇的植物細胞、植物部分或植物中顯示出轉錄活性的任何多核苷酸序列。啟動子對于植物宿主和/或對于本發明的DNA序列可以是天然的或類似的，或者外源的或異源的。在啟動子對于植物宿主是“內源的”或“類似的”時，意指該啟動子在其被引入的天然植物中被找到。當啟動子對于本發明的DNA序列是“外源的”或“異源的”時，意指該啟動子對于本發明的可操作連接的DNA序列而言不是天然的或天然發生的啟動子。啟動子可以是誘導型或組成型。它可以是天然發生的，可以由各種天然發生的啟動子部分組成，或可以是部分或全部合成的。啟動子設計指導由啟動子結構的研究提供，如Harley和Reynolds (1987)Nucleic Acids Res.15:2343-2361中的指導。同樣，啟動子相對于轉錄起始的位置可以被優化。見，例如，Roberts 等，(1979)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 76:760-764。許多用于植物的合適啟動子在本領域中是熟知的。
[0041]例如，適合用于植物的組成型啟動子包括:來自植物病毒的啟動子，如花生褪綠條死病花椰菜花葉病毒組(peanut chlorotic streak caulimovirus (PClSV))啟動子(美國專利第5,850,019號);來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(Odell等，(1985)Nature313:810-812);小球`藻病毒甲基轉移酶基因啟動子(美國專利第5，563，328號)和來自玄參花葉病毒(FMV)的全長轉錄啟動子(美國專利第5，378，619號)；來自基因如水稻肌動蛋白(McElroy 等,(1990)Plant Cell2:163-171 )、泛素(Christensen 等,(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632 和 Christensen 等，(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)、pEMU(Last 等，(1991)Theor.Appl.Genet.81:58h588)、MAS(Velten 等，(1984)EMB0J.3:2723-2730)、玉米 H3 組蛋白(L印etit 等，(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285 和Atanassova 等，(1992)Plant J.2 (3): 291-300)、油菜(Brassica napus) ALS3 (PCT 申請W097/41228)的啟動子；以及各種農桿菌屬(Agrobacterium)基因的啟動子(見，美國專利第 4，771，002,5, 102，796,5, 182，200 和 5，428，147 號)。
[0042]適合用于植物的誘導型啟動子包括:來自對銅作出反應的ACEl系統的啟動子(Mett等，(1993)PNAS90:4567-4571);對苯磺酰胺除草劑安全劑作出反應的玉米In2基因的啟動子(Hershey 等，(1991)Mol.Gen.Genetics227:229-237 和 Gatz 等，(1994)Mol.Gen.Genetics243:32-38);和來自 TnlO 的 Tet 阻抑子的啟動子(Gatz 等，(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237)。另外的用于植物的誘導型啟動子是對誘導劑作出反應的啟動子，植物通常對所述誘導劑不作出反應。這種類型的示例性誘導型啟動子是來自類固醇激素基因的誘導型啟動子，其轉錄活性被糖皮質類固醇激素誘導(Schena等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421)或通過嵌合轉錄激活劑XVE的最近應用來誘導，用于通過雌二醇活化的基于雌激素受體的誘導型植物表達系統(Zuo等，(2000)Plant J.，24:265-273)。其它的用于植物的誘導型啟動子在EP332104、PCT W093/21334和PCT W097/06269中被描述，其通過引用以其全部并入本文。也可以使用由其它啟動子部分組成的啟動子以及部分或全部合成的啟動子。見，例如，Ni等，(1995)Plant J.7:661-676和PCT W095/14098，它們描述了用于植物的這類啟動子。
[0043]啟動子可以包括，或被修飾以包括，一個或多個增強子元件。在一些實施方式中，啟動子可以包括多個增強子元件。與不包含增強子元件的啟動子相比，包含增強子元件的啟動子提供了更高水平的轉錄。用于植物的合適增強子元件包括PClSV增強子元件(美國專利第5，850，019號)、CaMV35S增強子元件(美國專利第5，106，739和5，164，316號)和FMV增強子元件(Maiti 等，(1997)Transgenic Res.6:143-156)。也參見 PCT W096/23898。
[0044]通常，這種構建物可包含5’和3’非翻譯區。這種構建物可以包含“信號序列”或“前導序列”，以促進感興趣肽的共翻譯或翻譯后轉運到某些細胞內結構如葉綠體(或其它質體)、內質網或高爾基體，或被分泌。例如，構建物可以被設計為包含信號肽來促進肽至內質網的轉移。“信號序列”意指已知或疑似導致共翻譯或翻譯后肽運輸穿過細胞膜的序列。在真核細胞中，這典型地包括分泌到高爾基體，帶有一些因而發生的糖基化。“前導序列”意指當翻譯時，導致足以引起肽鏈共翻譯運輸到亞細胞器的氨基酸序列的任何序列。因而，這包括通過進入內質網，到達液泡、包括葉綠體、線粒體等在內的質體而靶向運輸和/或糖基化的前導序列。也可以優選的是，設計包含內含子的植物表達盒，以使內含子的mRNA加工對于表達是必需的。
[0045]“3’非翻譯區”意指位于編碼序列下游的多核苷酸。多腺苷酸化信號序列和編碼調控信號的其它序列是3’非翻譯區,所述調控信號能夠影響聚腺苷酸束(polyadenylic acidtract)添加到mRNA前體的3’端。“5’非翻譯區”意指位于編碼序列上游的多核苷酸。
[0046]其它的上游或下游非翻譯元件包括增強子。增強子是用于增加啟動子區表達的多核苷酸。增強子在本領域是熟知的，且包括但不限于SV40增強子區和35S增強子元件。
`[0047]終止區可以是對轉錄起始區天然的，可以是對本發明的序列天然的，或可以源自另一來源。合適的終止區可從根癌農桿菌(A.tumefaciens)的T1-質粒得到,如章魚堿合酶和胭脂氨酸合成酶終止區。也參見Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144 ；Proudfoot(1991)Cell64:671-674 ;Sanfacon 等人，(1991)Genes Dev.5:141-149 ；Mogen等人，(1990)Plant Cell2:1261-1272 ;Munroe 等人，(1990)Gene91:151-158 ;Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903 ;和 Joshi 等人，(1987)Nucleic AcidRes.15:9627-9639o
[0048]在本發明的一個方面，合成的DNA序列被設計用于給定的多肽，如本發明的多肽。細胞中合成DNA序列的開放閱讀框的表達導致本發明的多肽的產生。合成DNA序列可以用于簡單地除去不必要的限制性內切核酸酶位點，以促進DNA克隆策略，改變或除去任何潛在的密碼子偏倚，改變或提高GC含量，除去或改變另起讀框，和/或改變或除去內含子/外顯子剪接識別位點、多腺苷酸化位點、SD序列、不必要的啟動子元件和可能存在于天然DNA序列中的類似物。也可能的是，合成DNA序列可以被用于將其它改良引入DNA序列，如引入內含子序列、產生作為融合到細胞器引導肽的蛋白質表達的DNA序列，所述細胞器引導肽例如葉綠體轉運肽、質外體/液泡導向肽、或導致所得到的肽保持在內質網中的肽序列。合成基因也可以使用宿主細胞優選的密碼子合成，用于改進表達，或可以使用具有宿主優選的密碼子使用頻率的密碼子進行合成。見，例如，Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol.92:1-11 ;美國專利第 6，320，100,6, 075，185,5, 380，831 和 5，436，391 號，美國公布申請第 20040005600 和 20010003849 號、以及 Murray 等，(1989)Nucleic AcidsRes.17:477-498，其通過引用并入本文。
[0049]在一種實施方式中，感興趣的多核苷酸被靶向葉綠體來進行表達。在這種方式中，在感興趣的多核苷酸不直接插入到葉綠體中時，表達盒將額外包含編碼指引感興趣的核苷酸到葉綠體中的轉運肽的多核苷酸。這種轉運肽在本領域是已知的。見，例如，Von Heijne 等人，(1991) Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126 ；Clark 等，(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550 ；Della-Cioppa 等，(1987)Plant Physiol.84:965-968 ；Romer 等，(1993) Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421 ；以及 Shah 等，(1986)Science233:478-481。
[0050]靶向葉綠體的感興趣多核苷酸可以被優化，用于在葉綠體中表達，以說明在植物細胞核和該細胞器之間密碼子使用的不同。在這種方式中，可以使用葉綠體優選的密碼子合成感興趣多核苷酸。見，例如，美國專利第5，380，831號，其通過引用并入本文。
[0051]這種植物表達盒可以被插入到植物轉化載體中。“轉化載體”意指允許轉化細胞的DNA分子。這樣的分子可以由一個或多個表達盒組成，并且可以組織成一個以上的載體DNA分子。例如，二元載體是植物轉化載體，其利用兩個非鄰接DNA載體來編碼所有必需的順式_和反式作用功能，用于轉化植物細胞(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in PlantScience5:446-451).“載體”是指設計用于在不同宿主細胞之間轉移的多核苷酸構建物。“表達載體”是指具有在外源細胞中摻入、整合和表達異源DNA序列或片段的能力的載體。
[0052]植物轉化載體包括一個或多個實現植物轉化的DNA載體。例如，本領域內的常見做法是應用包含一個以上鄰接DNA區段的植物轉化載體。這些載體在本領域內通常稱為二元載體。二元載體以及具有輔助質粒的載體最常用于農桿菌屬介導的轉化，其中實現有效轉化所需要的DNA區段的 大小和復雜性是相當大的，并且將單獨的功能分開在單獨的DNA分子上是有利的。二元載體通常包含質粒載體，所述質粒載體包含T-DNA轉移必需的順式作用序列(如左邊界和右邊界)、被工程化為能夠在植物細胞中表達的選擇性標記、和“感興趣的多核苷酸”(被工程化為能夠在植物細胞中表達的多核苷酸，轉基因植物的產生對于所述植物細胞是期望的)。也在該質粒載體上存在的是細菌復制必需的序列。順式作用序列以允許有效轉移到植物細胞并且在其中表達的方式排列。例如，選擇性標記序列和感興趣的序列位于左邊界和右邊界之間。第二質粒載體經常包含介導T-DNA從農桿菌屬轉移到植物細胞的反式作用因子。該質粒經常包含侵入性功能(Vir基因)，其允許植物細胞被農桿菌屬感染，以及通過在邊界序列切割的DNA轉移，和病毒介導的DNA轉移，如本領域所理解的(Hellens 和 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451 )。幾種類型的農桿菌屬菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA10U EHA105等)可用于植物轉化。第二質粒載體對于通過其它方法如顯微投影、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等將多核苷酸引入到植物中不是必需的。
[0053]D.植物轉化
[0054]本發明的方法包括將核苷酸構建物引入到植物中。“引入”意指將核苷酸構建物以該構建物進入到植物細胞內部的方式呈遞給植物。本發明的方法不需要使用將核苷酸構建物引入植物的具體方法，只需要核苷酸構建物進入到植物的至少一個細胞的內部。將核苷酸構建物引入植物中的方法在本領域是已知的，包括但不限于，穩定轉化法、瞬時轉化法和病毒介導法。
[0055]一般而言，植物轉化法包括將異源DNA轉移到靶植物細胞(例如，未成熟或成熟胚、懸浮培養物、未分化的愈傷組織、原生質體等)，隨后應用最大閾值水平的適當選擇(取決于選擇性標記基因并且在此情況下為“草甘膦”)以從未轉化的細胞團中回收轉化的植物細胞。外植體被典型地轉移到新鮮供給的相同培養基中并且常規培養。之后，轉化細胞在放置在補充有最大閾值水平的選擇劑(例如，“草甘膦”)的再生培養基上之后分化成莖干。然后，莖干被轉移到選擇性生根培養基，用于回收生根的莖干或小植株。轉基因小植株然后生長成為成熟的植物并且產生能育種子(例如，Hiei等，(1994)The PlantJournal6:271-282 ;Ishida等，(1996)Nature Biotechnology 14:745-750)。外植體典型地被轉移到新鮮供給的相同培養基中并且常規培養。產生轉基因植物的技術和方法的一般描述在Ayres和Park(1994) Critical Reviews in Plant Sciencel3:219-239 以及Bommineni和Jauhar (1997)Maydica42:107-120中找到。由于轉化的材料包含許多細胞；轉化的和未轉化的細胞都出現在任何一塊經受處理的靶愈傷組織或組織或細胞群中。殺死非轉化細胞并允許轉化細胞增殖的能力產生轉化的植物培養物。通常，除去非轉化細胞的能力限制了轉化植物細胞的快速回收和轉基因植物的成功產生。分子方法和生化方法可以用于確定整合的感興趣異源基因在轉基因植物的基因組中的存在。
[0056]轉基因植物的產生可以通過幾種方法之一進行，包括但不限于，通過農桿菌屬將異源DNA引入到植物細胞中(農桿菌屬介導的轉化)，用附到粒子的異源外來DNA轟擊植物細胞，和用于轉移DNA的各種其它非粒子直接介導法(例如，Hiei等，(1994)The PlantJournal6:271-282 ;Ishida 等，(1996)Nature Biotechnologyl4:745-750 ；Ayres 和Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 ;Bommineni 和 Jauhar (1997)Maydica42:107-120)。
[0057]轉化葉綠體的方法在本領域內是已知的。見，例如，Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993`)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:913-917 ；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。該方法依賴于粒子槍輸送含選擇性標記的DNA以及通過同源重組將DNA靶向質體基因組。此外，質體轉化可以通過核編碼和質體介導的RNA聚合酶的組織優選表達來反式激活沉默的質體攜帶的轉基因來完成。這種系統已經在McBride 等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7301-7305 中進行了報道。
[0058]按照常規方法，已經被轉化的細胞可以生長成植物。參見，例如，McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后這些植物可以生長并且或者用同一轉化株系或不同株系進行授粉，并且得到的雜種具有經過鑒定的期望表型特征的組成型表達。可以生長兩代或兩代以上以保證期望表型特征的表達被穩定地保持并且遺傳，然后收獲種子以確保期望表型特征的表達已經獲得。以這種方式，本發明提供了轉化種子(也稱為“轉基因種子”)，其具有穩定摻入它們的基因組中的本發明的核苷酸構建物，例如，本發明的表達盒。
[0059]E.植物轉化的評價
[0060]在將異源外來DNA引入到植物細胞中以后，異源基因在植物基因組中的轉化或整合通過各種方法如與整合基因有關的核酸、蛋白質和代謝物的分析來證實。[0061]PCR分析是移種到土壤之前篩選早期轉化細胞、組織或莖中摻入基因存在的快速Sti(Sambrook^pRusselioooi)Molecular Cloning:ALaboratory Manual (Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY))。應用對感興趣基因或農桿菌屬載體背景等特異的寡核苷酸引物進行PCR。
[0062]植物轉化可以通過基因組DNA的DNA印跡分析來證實(Sambrook和Russell (2001)，見前)。一般而言，從轉化體提取總DNA，用適當的限制性酶消化，在瓊脂糖凝膠中進行分離并且轉移到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后根據標準技術(SambiOok和Russell, 2001，見前)，可以用例如放射性標記的32P靶DNA片段探測所述膜或“印跡”，以證實被引入的基因在植物基因組中的整合。
[0063]在RNA印跡分析中，根據本領域常規使用的標準程序，從轉化體的特異組織分離RNA，所述RNA在甲醛瓊脂糖凝膠上進行分離，并且印跡到尼龍濾膜上(SambiOok和Russell (2001),見前)。然后通過本領域內已知的方法(Sambrook和Russell (2001),見前)，使所述濾膜與源自GDC的放射性探針雜交，來檢測由本發明的grg序列編碼的RNA的表達。
[0064]根據標準程序(Sambrook和Russell (2001),見前),使用與存在于除草劑抗性蛋白上的一個或多個表位結合的抗體，可以對轉基因植物進行蛋白質印跡和生化分析等，以確定由除草劑抗性基因編碼的蛋白質的存在。
[0065]在本發明的一個方面，本文描述的grg基因可用作標記以評價細菌或植物細胞的轉化。
[0066]F.植物和植物部分
[0067]“植物”意指全植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚及其后代。植物細胞可以是分化`的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)。本發明可以用于將多核苷酸引入任何植物種類中，包括但不限于，單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物的例子包括但不限于，玉米(玉蜀黍)、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜(oilseed rape)、蕓苔屬某種、紫花苜猜、裸麥、稷、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果樹、澳大利亞堅果、杏樹、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。
[0068]蔬菜包括但不限于,番爺、萵苣、青豆、利馬豆、豌豆和甜瓜屬(genus Curcumis)的成員如黃瓜、甜瓜和香瓜。觀賞植物包括但不限于，杜鵑花、繡球花屬、芙蓉屬、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牽牛屬、石竹屬、猩猩木和菊花。農作物植物也是感興趣的，包括例如，玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等。
[0069]本發明適合單子葉植物科的任何成員，包括但不限于，玉米、水稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、裸麥、甘鹿、菠蘿、薯菌、洋蔥、香蕉、椰子和海棗。
[0070]G.增加植物產量的方法
[0071]提供了增加植物產量的方法。所述方法包括將包含本文公開的grg序列的多核苷酸引入到植物或植物細胞中。如本文所定義的，植物的“產量”是指由植物產生的生物量的質量和/或數量。“生物量”意指任何測量的植物產物。生物量產率的增加是任何所測量的植物產物的產量的提高。增加植物產量具有幾種商業應用。例如，增加植物葉的生物量可以增加多葉蔬菜的產量，用于人類和動物消費。此外，增加葉生物量可以用于增加植物來源的藥品或工業產品的生產。產量的增加可以包括統計學上顯著的增加，包括但不限于，至少1%的增加、至少3%的增加、至少5%的增加、至少10%的增加、至少20%的增加、至少30%的增加、至少50%的增加、至少70%的增加、至少100%的增加或更大的增加。
[0072]在具體的方法中，用有效濃度的除草劑處理植物，其中所述除草劑應用導致植物產量增加。“有效濃度”意指允許植物產量增加的濃度。感興趣除草劑的這種有效濃度通常在本領域內是已知的。按照通常的除草劑施用技術，除草劑可以在芽前或芽后被施用到含有農作物的田地中，所述農作物已經通過異源表達本發明的grg基因而獲得了除草劑抗性。
[0073]也提供了賦予植物或植物部分除草劑抗性的方法。在這種方法中，本文公開的grg多核苷酸被引入到植物中，其中所述多核苷酸的表達導致草甘膦耐性或抗性。通過這種方法產生的植物可以用有效濃度的除草劑處理并且顯示出增加的對除草劑的耐性。本申請中除草劑的“有效濃度”是足以使植物或植物部分的生長減緩或停止的量，所述植物或植物部分對除草劑不具有天然抗性或沒有獲得對除草劑的抗性。
[0074]H.在田地中控制雜草的方法
[0075]也提供了在含有植物的田地中選擇性控制雜草的方法。在一種實施方式中，作為本文公開的grg多核苷酸插入到植物種子或植物的結果，植物種子或植物具有草甘膦抗性。在具體的方法中，植物用有效濃度的除草劑處理，其中所述除草劑施用導致選擇性控制雜草或其它未轉化的植物。“有效濃度”意指控制雜草或其它未轉化植物的生長或蔓延而不顯著影響草甘膦抗性植物或植物種子的濃度。感興趣除草劑的這種有效濃度通常在本領域內是已知的。按照通常的除草劑施用技術，除草劑可以在芽前或芽后被施用到含有獲得除草劑抗性的植物或植物種子的田地中。
[0076]1.溫度譜`
[0077]已經進行了幾個植物中草甘膦代謝的研究，所述研究顯示草甘膦不被植物代謝或代謝得非常緩慢。草甘膦迅速穿透角質層，并且在相當長的一段時間內被轉移遍及整個植物(在 Kearney 和 Kaufman, Eds (1988) Herbicides ;Chemistry, Degradation & Mode ofAction Marcel Dekker, Inc., New York, 3:1-70 以及 Grossbard 和 Atkinson, Eds.(1985),The Herbicide Glyphosate Butterworths, London, p.25-34 中進行綜述)。因而，可能的是，在農學上重要的植物中，草甘膦耐性在草甘膦暴露之后的一段持續時間中是必要的。在溫度經常在生長季節期間超過30°C的情況下，使用可在升高的溫度保持活性的草甘膦耐性EPSP合酶將會是有利的。
[0078]在本發明的一個實施方式中，EPSP合酶在比周圍環境溫度高或低的溫度下顯示出熱穩定性。“熱穩定性”意指在比周圍環境溫度高或低的溫度下，所述酶比在該溫度下為非熱穩定的EPSP合酶在更長的一段時間內具有活性。例如，熱穩定EPSP合酶在比周圍環境溫度高或低的溫度下具有酶促活性大于大約I小時、大于大約2小時、大約3小時、大約4小時、大約5小時、大約6小時、大約7小時、大約8小時、大約9小時、大約10小時、大約11小時、大約12小時、大約13小時、大約14小時、大約15小時、大約20小時、大約25小時或更長。為了本發明的目的，“周圍”環境溫度為大約30°C。在一些實施方式中，高于周圍溫度是在或高于大約32°C、大約34°C、大約37°C、大約40°C、大約45°C、大約50°C、大約55°C、大約60°C、大約65°C或更高的溫度。低于周圍溫度是在或低于大約28°C、低于大約27°C、大約26 °C、大約25 °C、大約23 °C、大約20°C、大約18 °C、大約15 °C、大約I (TC，在或低于大約5°C，或在0°C左右。分析EPSP合酶活性的方法在本文其它地方被進一步詳細討論。為了本發明的目的，當熱穩定EPSP合酶以在該酶的最適溫度觀測到的最大活性水平的大約90%至100%、大約80%至大約90%、大約70%至大約80%、大約60%至大約70%或大約50%至大約60%起作用時，其被認為是有活性的。
[0079]因而，本文提供的是在高于周圍環境溫度的溫度下增加草甘膦耐性的方法和組合物。在一種實施方式中，所述方法包括將編碼在SEQ ID N0:8、10、14、28、30、32或34中所示的草甘膦抗性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物，并且使所述植物在高于周圍環境溫度的溫度下生長。在【具體實施方式】中，所述生長溫度在所述植物的生長季節期間高于周圍溫度平均至少大約2小時每天，至少大約3小時每天、至少大約4小時每天、至少大約5小時每天、大約6小時每天、大約7小時每天、大約8小時每天、大約9小時每天、大約10小時每天、大約11小時每天、大約12小時每天、大約14小時每天、大約16小時每天、大約18小時每天、大約20小時每天、至少大約22小時每天,或可達大約24小時一天。
[0080]在另一實施方式中，所述方法包括將編碼在SEQ ID N0:8、10、14、28、30、32或34中所示的草甘膦耐性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物，使所述植物與除草有效濃度的草甘膦接觸，和使所述植物在高于周圍環境溫度的溫度下生長每天至少I小時、至少大約2小時、至少大約3小時、至少大約4小時或以上，在草甘膦施用給植物之后持續至少2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，其中溫度高于周圍環境溫度的天數發生在所述植物的生長季節期間。
[0081]下列實施例作為說明而不是作為限制加以提供。
[0082]實驗
[0083]1.svngrg23
[0084]GRG23 (SEQ ID NO: 2)是EPSP合酶，其具有極好的動力學數值Km、Ki和Vmax (美國專利申請第60/741，166號，2005年12月I日提交)。新的編碼GRG23蛋白的基因序列(美國專利申請第60/741，166號，2005年12月I日提交)被設計并合成。所得到的序列在本文被提供為SEQ ID N0:6，并且在本文中稱為“syngrg23”。通過本領域已知的方法，將開放閱讀框克隆到表達載體pRSFlb (Invitrogen)中。
[0085]編碼GRG23的syngrg23基因被克隆到pUC19載體中以產生pAX748。應用Mutazyme II系統(Stratagene),使用在該載體中在syngrg23側翼的PCR引物從pAX748擴增syngrg23,以將隨機突變引入syngrg23編碼區。在易錯PCR (error-prone PCR)反應中，模板以1:50稀釋，并且擴增進行30個循環。用限制性酶BamH I和Sgs I消化得到的PCR產物，凝膠純化，并且連接到載體pRSFlb中，以產生誘變的syngrg23文庫。
[0086]所述誘變的syngrg23文庫被轉化進大腸桿菌(E.coli)菌株BL21*DE3star (Invitrogen)中。轉化后，單個菌落被鋪板在含有150mM草甘膦的1XM63培養基上，以選擇保持酶促活性和具有生長耐性的克隆。
[0087]實施例2.在平板上篩選草甘膦抗性
[0088]文庫連接物被轉化到BL21*DE3感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen)中。根據制造商說明書進行轉化，其中具有下列改變。在37°C，在SOC培養基中溫育I小時之后，通過離心沉淀細胞(5分鐘，1000Xg，4°C)。用Iml M63+洗滌細胞，再次離心，并且傾析上清液。再一次用lmlM63+洗滌細胞，并且將細胞重懸于200ul M63+中。
[0089]為了選擇在大腸桿菌中賦予草甘膦抗性的突變GRG23酶，細胞被鋪板在含有150mM 草甘勝、0.05mM IPTG (異丙基-β-D-硫代批喃半乳糖苷)(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)和50 μ g/ml卡那霉素的M63+瓊脂培養板上。M63+培養基含有IOOmMKH2PO4、15mM(NH4)2SO4'50 μ M CaCl2UuM FeS04、50yM MgCl2、55mM 葡萄糖、25mg/升 L-脯氨酸、IOmg/升鹽酸硫胺素、足量的NaOH以調節pH至7.0、和15g/升瓊脂。將所述平板在37°C溫育36小時。
[0090]挑取單個菌落并且排列到384孔板中。以這種方式，產生了兩個384孔板。從在沒有草甘膦的平板上生長的菌落中挑取第三板的384個克隆。
[0091]實施例3.草甘膦抗性GRG23變體的分離和分析
[0092]通過在草甘膦平板上生長來鑒定用誘變的syngrg23和/或grg23變體轉化的BL21*DE3細胞。制備誘變的syngrg23和/或grg23變體的提取物并且分析其改進的酶促活性。用針將草甘膦平板上鑒定的菌落挑到含有LB培養基的96孔板中并且生長至0.D大約0.6。然后加入IPTG (0.5mM)并且將所述板在20°C溫育過夜，以誘導蛋白質表達。使用POP培養試劑(Novagen)和Lysonase (Novagen),從細胞團中制備蛋白質提取物，并且在37°C加熱提取物30分鐘后，測量粗制溶解產物中的酶促活性。活性大于含有適當對照蛋白質(例如，GRG23)的一組提取物的平均值以上兩個標準差的提取物被選擇，用于進一步分析。
[0093]在作為粗制提取物溫育之后顯示出活性增加的克隆被生長在250mL LB培養物中，并用IPTG誘導蛋白質表達。誘導之后,使用鈷樹脂(cobalt resin) (Novagen),通過親和層析從每一培養物中純化突變GRG23蛋白。然后，在37°C加熱0、2、4、和大約16小時之后，檢測純化的蛋白質的酶促活性。`
[0094]實施例4.改自的GRG23奪體
[0095]從誘變syngrg23的DNA文庫中，鑒定出幾個在37°C具有改良的活性的克隆。與這些提取物對應的克隆的DNA序列被測定。表1示出了在6個保持草甘膦抗性的GRG23的變體中鑒定的氨基酸變化:grg23(L3Pl.B20) (SEQ ID NO: 20)，編碼氨基酸序列GRG23(L3P1.B20) (SEQ ID N0:21) ；grg23(L3Pl.B3) (SEQ ID NO:22)，編碼氨基酸序列 grg23 (L3P1B3)(SEQ ID NO:23) ；GRG23(L3P1.F18) (SEQ ID NO: 24)，編碼氨基酸序列 GRG23 (L3P1.F18)(SEQ ID NO:25);和 grg23 (L3P1.023) (SEQ ID NO: 26)，編碼氨基酸序列 GRG23 (L3P1.023)(SEQ ID NO:27)。
[0096]表1.在抗草甘膦的GRG23變體中鑒定出的突變
[0097]
克隆 I在GRG23中的氨基酸(AA)
L3P1B20 V206 — I—
L3P1B3 D75 ^ H.E217 ^ K—
L3P1F18 T274 — I—
L3P1023 |R5 — H一
[0098]克隆在250mL LB培養物中生長，并且如上所述分離所誘導的蛋白質表達。然
后，在37°C加熱O、2、4、和大約16小時之后，檢測純化的蛋白質的酶促活性。發現克隆之一，稱為“M5”，在37°C延長溫育之后保持了增加比例的酶促活性(表2)。該克隆的DNA序列被測定，并且在本文中該基因被稱為grg23 (acel) (SEQ ID N0:8)。從grg23 (acel)表達的蛋白質被稱為 GRG23 (ACEl) (SEQ ID NO: 9) ?
[0099]表2.在升高的溫度下GRG23 (ACEl)對GRG23的半衰期
[0100]
[0101]相對于野生型GRG23蛋白，GRG23 (ACEl)包含兩個氨基酸置換:Α49 — T和S276 — T。含有該基因的pRSFlb被稱為ρΑΧ3801。圖1示出了在升高的溫度下GRG23 (ACEl)對GRG23的相對穩定性。
[0102]實施例5.GRG-23奪體的EPSPS活件測定
[0103]分析了含有GRG-23變體蛋白的提取物的EPSP合酶活性，如2005年12月I日提交的美國專利申請第60/741，166號中所述，其通過引用以其全部并入本文。根據制造商說明書，在含有0.5mM莽草酸-3 -磷酸、200uM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、lU/ml黃嘌呤氧化酶、2U/ml核苷磷酸化酶、2.25mM肌苷、lU/ml辣根過氧化物酶、2mM草甘膦、50mM HEPES/KOH ρΗ7.0UOOmM KCl 和AMPLEX? Red(Invitrogen)的 50 μ I 終體積中進行分析。在室溫下，提取物與除了莽草酸-3 -磷酸之外的所有分析成分溫育5分鐘，并且通過加入莽草酸_3 -磷酸開始進行分析。應用Spectramax Gemini XPS突光分光計(MolecularDynamics,激發:555nm ;發射:590nm),測量EPSP合酶活性。
[0104]如以前所述(2005年12月I日提交的美國專利申請號60/741，166)，對純化的蛋白質的動力學參數進行全測定，調節由本領域內已知的Bradford分析確定的蛋白質量。對于任一種草甘膦濃度，EPSP合酶活性被測量為范圍廣泛的PEP濃度的函數。采用ICALEIDAGRAPH?軟件(Synergy Software),數據被擬合到 Michaelis-Menten 方程，并被用于確定EPSP合酶在該草甘膦濃度下的Km(表觀Km)。在不少于4個草甘膦濃度的情況下確定表觀1^值,并且應用本領域已知的方程(ml*x/ (m2+x) ;ml=l ;m2=l),根據表觀1^對草甘膦濃度的曲線圖，計算EPSPS對于草甘膦的I。
[0105]表3.GRG23 (ACEl)對 GRG23 的動力學
[0106]
KmKi (μΜ)Vmax
(μΜ )( nmol/min/ pg )
GRG23?2213,800?4~77
~GRG23(ACE1)9114,62013.73
[0107]實施例 6.grg;23(ace2)的鑒定
[0108]相對于GRG23，GRG23 (ACEl)包含兩個氨基酸改變。為了確定在這些位置的另外的置換是否能夠進一步提高活性，產生DNA文庫，其導致產生表達蛋白質的克隆，所述蛋白質在與GRG23(SEQ ID NO: 2)對應的位置49和276上進行實質性突變。通過在草甘膦平板上生長，選擇賦予草甘膦抗性的克隆，并且生長并分析動力學特性，如所述。
[0109]令人驚訝的是，一個克隆——本文稱為grg23(ace2) (SEQ ID N0:10)，其編碼GRG23 (ACE2)蛋白(SEQ ID NO: 11)——被鑒定為具有改進的熱穩定性。grg23 (ace2)的DNA序列顯示GRG23(ACE2)包含單氨基酸改變(GRG23的殘基276改變為精氨酸)。
[0110]實施例7.GRG23和GRG51的比較，以及不同殘某的誘奪
[0111]產生兩個文庫以通過GRG23和GRG51的氨基酸序列的比較評價可能的氨基酸序列的變換。第一個文庫將變異從GRG51氨基酸序列引入grg23(ace2)編碼區。第二個文庫將變異從GRG23 (ACE2)氨基酸序列引入grg51編碼區。
[0112]評價所得到的文庫的克隆:(I)賦予細胞草甘膦抗性的能力，和(2)在37°C延長溫育后的活性。全部10個克隆被測序并且更詳細地分析。一個具體克隆——本文稱為
grg51.4(SEQ ID NO: 12)，其編碼蛋白質 GRG51.4 (SEQ ID NO: 13)-相對于 GRG23 (ACE2)
和GRG51包含幾個氨基酸改變。相對于GRG23 (ACE2)存在于GRG51.4中的氨基酸改變隨后被引入 grg23(ace2)基因中，以產生 grg23 (ace3) (SEQ ID NO: 14)，其編碼 GRG23 (ACE3)蛋白(SEQ ID NO: 15)。GRG23 (ACE3)顯示出相對于GRG23和GRG23 (ACE2)的較高的活性和熱穩定性。
[0113]GRG23(acel)被誘變，并且檢測克隆以鑒定表達具有改進的熱穩定性和/或活性的變體的克隆。一個克隆——grg23 (L5P2.J2) (SEQ ID NO: 16)，其編碼GRG23 (L5P2.J2) (SEQ ID NO: 17)——由于其改進的動力學特性而被鑒定。GRG23 (L5P2.J2)相對于GRG23 (ACEl)包含三個氨基酸改變，如下面表4中所示。
[0114]表4.GRG23 (L5P2.J2)中的氨基酸改變
[0115]
相對于 GRG23(ACE1)，在 GRG23(L5P2.J2)中的氨基酸(AA)
【權利要求】
1.分離的或重組的核酸分子，其選自: a)核酸分子，其包含SEQID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32 或34 的核苷酸序列；和 b)核酸分子，其編碼包含SEQ ID N0:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33 或 35的氨基酸序列的多肽。
2.權利要求1所述的分離的或重組的核酸分子，其中所述核苷酸序列是設計用于在植物中表達的合成序列。
3.載體，其包含權利要求1或2所述的核酸分子。
4.權利要求3所述的載體，進一步包含編碼異源多肽的核酸分子。
5.宿主細胞，其含有權利要求3所述的核酸分子。
6.權利要求5所述的宿主細胞，其是細菌宿主細胞。
7.權利要求5所述的宿主細胞，其是植物細胞。
8.轉基因植物，其包含權利要求7所述的宿主細胞。
9.權利要求8所 述的植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。
10.轉基因種子，其包含權利要求1所述的核酸分子。
11.分離的或重組的多肽，其選自: a)多肽，其包含SEQID NO:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33或35 的氨基酸序列；和 b)多肽，其由SEQ ID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32或34 的核苷酸序列編碼。
12.權利要求11所述的多肽，其進一步包含異源氨基酸序列。
13.產生具有抗除草劑活性的多肽的方法，包括在表達編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養權利要求5所述的宿主細胞，所述多肽選自: a)多肽，其包含SEQ ID NO:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33或35 的氨基酸序列；和 b)多肽，其由SEQ ID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32 或34 的核苷酸序列編碼。
14.賦予植物除草劑抗性的方法，所述方法包括用DNA構建物轉化所述植物和再生轉化的植物，所述構建物包含驅動在植物細胞中表達的啟動子，所述啟動子與選自SEQ IDN0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32 或 34 的核苷酸序列可操作地連接。
15.權利要求14所述的方法，其中所述除草劑是草甘膦。
16.植物，具有穩定摻入到其基因組的DNA構建物，所述DNA構建物包含編碼具有抗除草劑活性的蛋白質的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自: a)核酸分子，其包含SEQID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32或34 的核苷酸序列；和 b)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33 或 35的氨基酸序列的多肽； 其中所述核苷酸序列可操作地連接到驅動編碼序列在植物細胞中表達的啟動子。
17.權利要求16所述的植物，其中所述植物是植物細胞。
18.權利要求16所述的植物，其中所述植物是大豆植物。
19.權利要求16所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
20.權利要求16所述的植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。
21.增加植物活力或產量的方法，其包括: a)提供包含SEQID N0:28、8、10、14、30、32或34中所示的核苷酸序列的植物； b)使所述植物與有效濃度的草甘膦接觸；和 c)在與所述草甘膦接觸之后，使所述植物在溫度高于周圍環境溫度的條件下生長每天至少2個連續小時,持續至少4天,其中所述接觸之后的天數在所述植物的生長季節內， 其中所述植物的活力或產量高于表達草甘膦耐性EPSP合酶的植物的活力或產量，所述草甘膦耐性EPSP合酶不具有高于周圍環境溫度的最適溫度。
22.權利要求21所述的方法，其中步驟(c)中的溫度為大約32°C至大約60°C。
23.賦予植物草甘膦抗性的方法，包括: a)提供包含SEQID N0:28、8、10、14、30、32或34中所示的核苷酸序列的植物； b)使所述植物與有效濃度的草甘膦接觸；和 c)在與所述草甘膦接觸之后， 使所述植物在溫度高于周圍環境溫度的條件下生長每天至少2個連續小時,持續至少4天,其中所述接觸之后的天數在所述植物的生長季節內。
24.權利要求23所述的方法，其中步驟(c)中的溫度為大約32°C至大約60°C。
25.權利要求24所述的方法，其中步驟(b)中的溫度為大約37°C。
26.權利要求1所述的分離的或重組的核酸分子，其中所述核苷酸序列與能在植物細胞中指導編碼序列表達的啟動子可操作地連接。
【文檔編號】C12N9/10GK103484481SQ201310317783
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2007年11月20日 優先權日:2006年11月29日
【發明者】L·C·斯考藤, C·彼得斯, B·范德伯格, T·漢森, V·貝林遜 申請人:埃塞尼克斯公司