一種全細胞轉化高效生產α-苯丙酮酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種全細胞轉化高效生產α-苯丙酮酸的方法，屬于發酵工程領域。通過在大腸桿菌中異源表達P.mirabilis氨基酸脫氨酶，并以此菌株轉化L-苯丙氨酸生產α-苯丙酮酸，對轉化條件進行了優化，實現了全細胞轉化高效生產α-苯丙酮酸。本發明與傳統化學法相比，成本低、操作簡單、環保，為工業化生物轉化生產α-苯丙酮酸奠定了基礎。
【專利說明】—種全細胞轉化高效生產α-苯丙酮酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種全細胞轉化高效生產α-苯丙酮酸的方法，特別是以大腸桿菌表達重組脫氨酶基因，以此菌株轉化L-苯丙氨酸生產α -苯丙酮酸，屬于發酵工程領域。
【背景技術】 [0002]α -苯丙酮酸(PPA)是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性藥物中間體。PPA還可用于制備苯乳酸，苯乳酸可作為抗菌物質。目前PPA生產主要是化學合成法，主要包括:乙酰氨基肉桂酸水解法、乙內酰脲與苯甲醛合成法和海因法。這些方法均需經過多步反應，對反應條件有較高要求，例如高壓、高溫等，產品得率低，對后期分離純化加大了難度，易產生有毒有害產物。
[0003]L-氨基酸脫氨酶(EC1.4.3.2, L-AAD)催化L-氨基酸氧化脫氨基,生成相應α -酮酸和氨，多為黃素蛋白，二聚體結構。L-氨基酸脫氨酶主要存在于蛇毒和昆蟲毒素中，在細菌、真菌、藻類中也存在。蛇毒氨基酸脫氨酶是研究最好的脫氨酶，但是價格昂貴，難以大規模使用。Proteus mirabilis KCTC2566有兩種L-氨基酸脫氨酶，一種具有廣泛的底物特異性，能夠催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其對L-苯丙氨酸具有較高催化活性；另一種具有底物限制性，只對堿性氨基酸具有催化活性，尤其是L-組氨酸。大部分細菌L-氨基酸脫氨酶是胞外分泌型，但是這兩種L-氨基酸脫氨酶都是膜蛋白。
[0004]在原核及真核生物中，20%_30%的基因編碼膜蛋白，這些膜蛋白形成許多重要的超分子化合物。膜蛋白在許多疾病中發揮重要作用，將近半數藥物的靶蛋白是膜蛋白。因此近些年，膜蛋白成為蛋白質組學及結構生物學的研究焦點。由于膜蛋白在雙層膜上定位、插入以及正確折疊都是非常復雜的過程，表達系統的選擇非常重要，膜蛋白表達有很多瓶頸尚未解決。
[0005]目前國外學者已對這兩種L-氨基酸脫氨酶進行分離純化及性質研究，但是目前尚未有利用此酶生產PPA的報道。
[0006]利用L-氨基酸脫氨酶為膜蛋白這一特性，我們開發了一種新的PPA生產模式-全細胞蛋白轉化。全細胞轉化相比分離酶具有如下優勢:全細胞生物催化劑更容易制備，成本低；比分離酶更穩定，不易受環境溫度、pH等因素影響，使用方便；轉化過程中不產生有毒害產品，不產生其他副產物；轉化過程一步生成PPA，不需經多步反應。相比之下現有某些化學合成法雖然得率能夠達到90%以上，但是能耗高、步驟繁瑣、污染嚴重。因此全細胞轉化這一節能環保的生產方式具有極大潛力，有望實現低能耗、高效率、高純度、無污染的工業化PPA生產。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是提供一種利用全細胞轉化高效生產PPA的方法，是將來源于P.mirabilis KCTC2566的脫氨酶基因在大腸桿菌中異源表達，以此菌株高效轉化L-苯丙氨酸生產PPA，從而解決了工業化PPA生產高成本、低得率、污染嚴重的問題。[0008]所述P.mirabilis KCTC2566 購買于 Korea Collection for Type Cultures,KCTC。
[0009]所述大腸桿菌基因工程菌的構建是以P.mirabilis KCTC2566的基因組DNA為模板，PCR擴增核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的脫氨酶基因后連接到載體pET-20b(+)，將所得重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。具體地，是以P.mirabilis KCTC2566基因組DNA為模板，使用如下引物擴增目的基因:
[0010]正向引物:5’CGCGGATCCATGAACATTTCAAGGAGAAAGCTAC3，,下劃線部分為 BamH I 酶切位點；反向引物:5’ CCGCTCGAGTTACTTCTTAAAACGATCCAAACTAA3’，下劃線部分為 Xho I 酶切位點。PCR產物純化、酶切后，與載體pET-20b (+)連接，構建重組質粒pET-pma。
[0011]所述基因工程菌全細胞轉化高效生產α -苯丙酮酸的方法，是將種子培養液按1%的接種量接種到發酵培養基中，37°C培養至OD為1.0，添加終濃度0.4mM的IPTG，30°C誘導5h，收集細胞，取1.4-25.2g/L細胞、4-24g/L底物L-苯丙氨酸，pH5_9，25_45°C條件下，轉化6-36h。優選底物L-苯丙氨酸濃度為14.0g/L,細胞濃度為8.4g/L，35°C，轉化16h。
[0012]所述微生物菌株的種子培養與發酵培養基:種子培養基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCllg,自來水定容至100mL。發酵培養基:蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL,各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加IOOmL滅菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，終體積為IOOmL,高壓滅菌)。
[0013]本發明的有益效果:本發明成功實現了 P.mirabilis中L-氨基酸脫氨酶在大腸桿菌中異源表達，并以此重組細胞一步轉化L-苯丙氨酸生產α-苯丙酮酸。最優的轉化條件為:L-苯丙氨酸濃度為14g/L和細胞濃度為8.4g/L，35°C轉化16h，達到最大轉化率25.2%。目前尚未有利用全細胞轉化生產PPA的報道，此發明有望解決化學法生產PPA能耗高、步驟繁瑣、污染嚴重的問題，為后續`工業化生產奠定了一定的理論基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1重組質粒的構建圖
[0015]圖2全細胞轉化優化結果圖；a，底物濃度對轉化率的影響；b，生物催化劑濃度對轉化率的影響；c，pH對PPA產量的影響；d，溫度對PPA產量的影響；e，轉化時間對轉化率的影響。
【具體實施方式】
[0016]材料與方法
[0017]種子培養基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,自來水定容至100mL。
[0018]發酵培養基:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加IOOmL滅菌的含有17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
[0019]α -苯丙酮酸含量測定:將轉化體系進行離心，取上清稀釋一定倍數，與2.5mL三氯化鐵反應，測定640nm下的吸光度，代入標準曲線方程。
[0020]實施例1L-氨基酸脫氨酶重組質粒構建
[0021]以P.mirabilis KCTC2566基因組DNA為模板，使用如下引物擴增目的基因:
[0022]5’ CGCGGATCCATGAACATTTCAAGGAGAAAGCTAC3> (正向引物)和[0023]5’CCGCTCGAGTTACTTCTTAAAACGATCCAAACTAA3’(反向引物)，劃線部分分別為 BamHI和Xho I酶切位點。所得目的基因序列如SEQ ID N0.1所示，PCR產物純化、酶切后，與載體pET-20b(+)連接,構建重組質粒pET-pma (如圖1)。
[0024]實施例2重組大腸桿菌構建
[0025]將實施例1重組質粒pET-pma轉化克隆宿主E.coli JM109,挑取在LB氨芐抗性平板上生長的單菌落，PCR擴增，挑選到陽性轉化子提取質粒，雙酶切驗證，條帶正確的進行測序，序列正確的轉化表達宿主E.coli BL21。轉化BL21平板單菌落接種種子培養基過夜培養，1%的接種量接種到發酵培養基中，37°C培養至OD為1.0，添加終濃度0.4mM的IPTG，30°C誘導 5h。
[0026]實施例3全細胞轉化L-苯丙氨酸條件優化
[0027]收集實施例2的重組大腸桿菌誘導細胞，在Tris-HCl (pH=7.6)溶液中進行全細胞轉化。細胞濃度為12.6g/L(細胞干重)時，分別在不同濃度L-苯丙氨酸(2g/L，4g/L，8g/L，14g/L，20g/L, 24g/L)條件下，37°C，轉化12h，考察底物濃度對轉化的影響，最優L-苯丙氨酸濃度為14g/L時，轉化率達到最大20.4% ;L-苯丙氨酸濃度14g/L時，加入不同濃度的生物催化劑(1.4g/L，4.2g/L，8.4g/L，12.6g/L，16.8g/L，25.2g/L，細胞干重)，37 °C，轉化12h，研究細胞濃度對轉化的影響，最優細胞濃度為8.4g/L時，轉化率為23.7% ;在最優底物濃度和細胞濃度條件下，研究不同pH(5，6，7，8，9)和溫度(25°C，30°C，35°C，40°C，45V )對轉化的影響，pH對轉化影響不大，最優溫度為35°C時，轉化率為24.2% ;在上述最優條件基礎上，研究不同轉化時間(6h，12h，16h，20h，24h，30h，36h)對轉化率的影響，發現轉化16h時，轉化率達到25.2%，轉化20h時，轉化率只有0.3%的小幅增長，從經濟角度考慮，轉化16h為最佳(如圖2)。
[0028]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一種用于生產α-苯丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，是重組表達了脫氨酶基因的大腸桿菌。
2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述脫氨酶基因來源于奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)。
3.一種構建權利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，具體步驟為以P.mirabilis KCTC2566的基因組DNA為模板，PCR擴增核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的脫氨酶基因后連接到載體pET-20b (+)，將所得重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。
4.權利要求1所述基因工程菌在生產α-苯丙酮酸中的應用。
5.一種應用權利要求2所述基因工程菌全細胞轉化高效生產α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，將種子培養液按1%的接種量接種到發酵培養基中，37°C培養至OD為1.0，添加終濃度0.4mM的IPTG，30°C誘導5h，收集細胞，將1.4-25.2g/L細胞、4_24g/L底物L-苯丙氨酸，pH5-9，25-45°C條件下，轉化6_36h，將轉化體系進行離心，上清含α -苯丙酮酸。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述底物L-苯丙氨酸濃度為14.0g/L，細胞濃度為8.4g/L，35°C，轉化16h。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，種子培養基組成為:蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,自來水定容至IOOmL0
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，發酵培養基組成為:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL; 各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60°C，再加IOOmL滅菌的含17mmol/LKH2PO4 和 72mmol/L K2HPO4 的溶液。
【文檔編號】C12N1/21GK103642743SQ201310392427
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】陳堅, 劉龍, 堵國成, 李江華, 侯穎 申請人:江南大學