重組PRRS病毒HV-nsp29及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組PRRS病毒HV-nsp29，該重組PRRS病毒的基因組cDNA序列為將序列表序列1自5’末端第1474—2055位的序列替換為序列表序列2自5’末端第814—1395位的序列；將序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列替換為序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列得到的。與野生型PRRSV高致病毒株HV相比，該重組PRRS病毒在PAM上生長的速度明顯下降，在豬體內的致病力明顯減弱。經其免疫后的小豬再次感染不同PRRS病毒后，精神狀態良好，食欲正常，且體內PRRS病毒量顯著低于未經免疫的小豬，說明該重組PRRS病毒可以開發為弱毒疫苗毒株。
【專利說明】重組PRRS病毒HV-nsp29及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組PRRS病毒HV-nsp29及其應用。
【背景技術】
[0002] 在生物體中，每種氨基酸至少對應一個密碼子，最多的有六種對應的密碼子， 編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。研究表明，生物體內普遍存在同義密碼子 非均衡使用的現象，例如：某一物種或某一基因通常傾向于使用一種或幾種特定的同義 密碼子，這些密碼子被稱為最優密碼子（optimal codon)，此現象被稱為密碼子偏好性 (codon bias)。同樣的，密碼子對的使用也有偏好性，但是密碼子對的偏好性并不依賴于密 碼子的偏好性。例如，精氨酸（arginine, Arg)可以被六種密碼子編碼，谷氨酸（glutamic acid, Glu)可以被兩種密碼子編碼，所以氨基酸對Arg-Glu可以被十二種同義密碼子對編 碼，如果根據密碼子的偏好性計算每個同義密碼子對在人類基因組中的出現次數，那么理 論上密碼子對CGC-GAA的出現次數為2, 397次，但實際只出現了 268次，所以CGC-GAA在人 類基因組中是非偏好性密碼子對；而密碼子對AGA-GAA編碼Arg-Glu的理論次數是2, 644 次，但其實際出現次數則是4, 195次，因此AGA-GAA是人類基因組中的偏好性密碼子對。
[0003] 盡管到目前為止人們并不清楚密碼子對偏好性的形成原因，但是密碼子對的使用 卻是可以影響翻譯效率的。2008年，Coleman等人把脊髓灰質炎病毒（poliovirus)的核 衣殼（capsid)基因進行了突變，在不改變氨基酸序列及RNA二級結構的前提下，在基因內 進行同義密碼子置換，使得偏好性的密碼子對被置換為非偏好性的密碼子對，化學合成突 變后的片段，然后利用反向遺傳學手段將合成的片段連入病毒全長cDNA克隆，這種致弱病 毒的方法稱為合成病毒致弱工程（synthetic attenuated virus engineering, SAVE)。置 換后病毒capsid基因的翻譯速率顯著下降，并且含有突變序列的重組病毒在體外細胞上 的復制能力和在小鼠中的致病力都明顯降低，在攻毒試驗中，重組病毒能夠有效的保護野 生型毒株對于免疫小鼠的再次感染。這種病毒弱化的方法具有廣泛的應用性，2010和2013 年，分別有人用同樣的方法改造了流感病毒，獲得了致弱效果明顯的流感病毒弱毒株。最重 要的是，在這種致弱病毒的工程中，病毒的弱化是由成百上千個點突變引起的，因此其發生 返強的可能性極低。
[0004] 豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syn -drome, 簡稱PRRS)，俗稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcinereproductive and respiratory syndrome viruse，PRRSV)引起的一種高發病率、高死亡率、低治愈率的豬病。 目前，世界上廣泛使用商品化的PRRS疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗。滅活的PRRSV疫苗沒 有效果或者是只能對同源毒株的感染提供有限的保護；弱毒疫苗持續散播病毒，尤其有回 復突變以致毒力返強的可能性，弱毒疫苗的返強性一直是人們擔心的一個安全問題。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種可以作為弱毒疫苗毒株的重組PRRS病毒。
[0006] 本發明要求保護的重組PRRS病毒HV-nsp29,其基因組對應的cDNA序列為將序列 表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列替換為序列表序列2自5'末端第814 -1395 位的序列；將序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列3自5'末 端第158- 2002位的序列所獲得的序列。
[0007] 序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列為序列表序列2自5'末端第 814-1395位的序列；序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列為序列表序列3自 5'末端第158- 2002位的序列的DNA片段，也是本發明需要保護的；
[0008] 同時，含有該片段的重組質粒、重組菌或重組細胞，也是本發明需要保護的。具 體地說，所述重組質粒為將質粒pcDNA3. I-HV中對應于序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的DNA片段替換為序列表序列2自5'末端第814-1395位的DNA片段，將質粒 pcDNA3. I-HV中對應于序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列 3自5'末端第158- 2002位的序列得到的質粒。質粒pcDNA3. I-HV是將序列表中的序列1 所示的HV毒株的基因組全長序列克隆到了真核表達載體pcDNA3. 1中得到的。
[0009] 上述重組質粒在制備重組PRRS病毒HV-nsp29或PRRS疫苗中的應用，以及重組 PRRS病毒HV-nsp29在制備PRRS疫苗中的應用，也是本發明需要保護的內容。
[0010] 實驗證明，將野生型PRRSV高致病毒株HV基因組的全長CDNA克隆中對應于序列 表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列改造為序列表序列2自5'末端第814 -1395 位，將野生型PRRSV高致病毒株HV基因組的全長cDNA克隆中對應于序列表序列1自5'末 端第7683- 9527位的序列改造為序列表序列3自5'末端第158- 2002位后獲得的重組病 毒HV-nsp29,與野生型PRRSV高致病毒株HV相比，在PAM (豬肺泡巨噬細胞)上生長的速度 均明顯下降。重組PRRS病毒HV-nsp29在豬體內的致病力明顯減弱，且經HV-nsp29免疫后 的小豬再次感染不同PRRS病毒后，小豬的精神狀態良好，食欲正常，健康，且體內PRRS病毒 量顯著低于未經免疫的小豬，說明本發明所提供的重組PRRS病毒可以開發為弱毒疫苗毒 株。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為重組PRRS病毒感染豬PAM細胞后不同時間的病毒滴度結果。
[0012] 圖2為重組PRRS病毒感染豬PAM細胞后84小時誘導的細胞病變結果。
[0013] 圖3為接種HV-wt或HV-nsp29后小豬的直腸溫度變化。
[0014] 圖4為接種HV-wt或HV-nsp29后小豬的存活率變化。
[0015] 圖5為接種HV-wt或HV-nsp29后小豬血清中PRRS病毒滴度變化。
[0016] 圖6為實時熒光定量PCR檢測接種HV-wt或HV-nsp29兩周后小豬各組織的中PRRS 病毒滴度變化。
[0017] 圖7為接種HV-Wt或HV-nsp29兩周后小豬部分組織切片的蘇木精一伊紅染色結 果。
[0018] 圖8為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS病毒后的存活率變化。
[0019] 圖9為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS病毒后的直腸溫度變化。
[0020] 圖10為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS病毒后血清中PRRS病毒 滴度變化。
[0021] 圖11為實時熒光定量PCR檢測免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS 病毒兩周后小豬各組織的中PRRS病毒滴度變化。
[0022] 圖12為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬血清中和抗體滴度變化。
[0023] 圖13為流式細胞儀檢測不同PRRS毒株對免疫HV-nsp29和未免疫的小豬淋巴細 胞進行再刺激后的INF γ和DC8+的水平。
[0024] 圖14為在PAM細胞上對HV-nsp29連續傳代過程中觀察細胞病變的部分結果。其 中，pi、PlO和p20分別代表第1、10和20代。
[0025] 圖15為第1代、第10代和第20代的HV-nsp29中的nsp2和nsp9基因的CPB值。 其中，pl、pl0和p20分別代表第1、10和20代。
【具體實施方式】
[0026] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0027] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0028] 下述實施例中所用的野生型PRRSV高致病毒株HV :Genbank號為JX317648,公眾 可從中國農業大學獲得。
[0029] 下述實施例中的實驗數據如無特殊說明，均為三次重復的平均值，并用t檢測進 行統計學分析，當P〈〇. 05時差異顯著。
[0030] 下述實施例中基因的CPB值等于基因內每個密碼子對的CPS值的算術平均值，公 式為：。
【權利要求】
1. 一種重組PRRS病毒，其特征在于：該重組PRRS病毒的基因組對應的cDNA序列為將 序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列替換為序列表序列2自5'末端第814- 1395位的序列；且將序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列3 自5'末端第158- 2002位的序列所獲得的序列。
2. 權利要求1所述病毒在制備PRRS疫苗中的應用。 3. DNA片段，其序列是將序列表序列1自5'末端第1474-2055位的序列替換為序列 表序列2自5'末端第814-1395位的序列；且將序列表序列1自5'末端第7683- 9527位 的序列替換為序列表序列3自5'末端第158- 2002位的序列得到的。
4. 權利要求3所述DNA片段在制備權利要求1所述重組PRRS病毒中的應用。
5. 權利要求3所述DNA片段在制備PRRS疫苗中的應用。
6. 含有權利要求3所述DNA片段的重組質粒、重組菌或重組細胞。
7. 根據權利要求6所述的重組質粒，其特征在于：所述重組質粒為將質粒pcDNA3. 1-HV 中對應于序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的DNA片段替換為序列表序列2自5'末 端第814-1395位的序列；將質粒pcDNA3. 1-HV中對應于序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列3自5'末端第158- 2002位的序列。
8. 權利要求6或7所述重組質粒在制備權利要求1所述重組PRRS病毒中的應用。
9. 權利要求6或7所述重組質粒在制備PRRS疫苗中的應用。
【文檔編號】C12N15/79GK104419687SQ201310394862
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月3日 優先權日:2013年9月3日
【發明者】封文海, 高麗, 楊丙田, 王良海, 郭雪坤, 余志彬, 劉翼浩, 陳鑫鑫, 鄭世軍, 唐軍 申請人:中國農業大學