豬btg2基因在抗prrs病毒中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的新功能，具體提供了豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應用，其是通過BTG2基因在細胞中的過表達來抑制PRRS病毒在細胞中的復制。本發明還提供了利用BTG2基因表達量篩選抗PRRS病毒豬的方法，以及制備過表達BTG2基因的克隆胚胎的方法。
【專利說明】豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的新功倉泛。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，俗稱“藍耳病”是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的,該病毒是巢狀病毒目動脈炎病毒科的一個成員，同屬的病毒還有馬動脈炎病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現為間質性肺炎和母豬流產木乃伊胎等，每年對全世界的養豬業造成了巨大的經濟損失。2007年在中國爆發了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴散，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死亡，該病最后證實是由一種高致病性的藍耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞，現在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應答，體液免疫不能及時產生有效的中和抗體，而且會形成抗體依賴的病毒增強效應，最終導致免疫抑制和持續感染。由于該病毒的突變率極高，傳統疫苗方法也不能有效控制該病，很多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補傳統方法的不足。
【發明內容】
[0003]為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種與抗藍耳病相關的新基因BTG2，及其通過對BTG2基因進行過表達，從而抑制PRRS病毒在細胞中的復制。
[0004]本發明的技術方案如下:
[0005]本發明首先提供了`豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應用，其是通過BTG2基因在細胞中的過表達來抑制PRRS病毒在細胞中的復制。
[0006]本發明還提供了一種過表達BTG2基因的載體。
[0007]作為優選，所述載體為導入BTG2基因⑶S序列的pCMV-Myc-N載體。
[0008]本發明還提供了含有所述載體的轉基因細胞。
[0009]進一步地，所述轉基因細胞為除胚胎細胞外的豬體細胞。
[0010]本發明還提供了一種制備克隆胚胎的方法，其以權利要求5所述轉基因細胞為核移植供體細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術獲得克隆胚胎。
[0011]本發明還提供了利用BTG2基因表達量篩選抗PRRS病毒豬的方法，所述方法為通過對豬的BTG2基因的表達量進行測定，BTG2表達量高的豬比BTG2表達量低的豬具有更高的抗PRRS病毒感染能力。
[0012]本發明的有益效果在于:
[0013]本發明所鑒定的與抗藍耳病相關的新基因BTG2 (B-cell translocation gene2),有研究表明BTG2具有調節細胞周期G1/S轉換的作用。本發明人首次利用生物信息學結合細胞生物學實驗的方法，證明了 BTG2具有抑制PRRS病毒復制的作用。
[0014]本發明發現的新的抑制PRRSV復制的基因BTG2可以有以下兩個用途:[0015]1.分析表明，相對于沒有過表達BTG2基因的細胞，過表達BTG2基因的細胞可以顯著抑制PRRS病毒的復制，因此，可以通過對豬的BTG2基因的表達量進行測定，BTG2表達量高的豬可能會比BTG2表達量低的豬更加抗PRRSV的感染，從而達到根據BTG2基因的表達量高低來篩選抗PRRSV的豬。
[0016]2.可以利用轉基因等基因工程學的方法，使得BTG2基因在豬中的表達量升高，從而得到BTG2表達量高的豬，進而培育出抗PRRSV復制的豬。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明實施例1中轉錄組數據分析得到的BTG2在通城豬和長白豬感染PRRSV的第O天，第3天，第5天和第7天肺組織中的表達模式和相對表達量；橫坐標代表時間點，縱坐標代表RPKM (相對表達量)。
[0018]圖2為本發明實施例2中原始載體pCMV-Myc-N的載體圖譜。
[0019]圖3為本發明實施例2中MARC145細胞攻毒實驗后24小時PRRSV的拷貝數；橫坐標代表對照組和攻毒組；縱坐標代表PRRSV 0RF7的相對表達量。
【具體實施方式】
[0020]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0021]實施例1利用分析轉錄組數據方法發現新的抗PRRSV感染的基因
[0022]BTG2`[0023]由于不同的豬品種和個體的遺傳背景差異，對藍耳病的抗性也不同，研究表明在臨床癥狀和生理生化指標上，通城豬、梅山豬等國內豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感染高致病性PRRSV后有較強的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和通城豬的組織做差異基因表達分析，某些免疫相關的基因表達量在感染前后兩個品種間有顯著的差異。通過對不同品種間PRRSV感染造成的基因表達差異的分析，不僅可以研究藍耳病的感染機制，還可以找出抗性或易感相關的基因，從而為藍耳病的治療和預防提供新辦法。
[0024]前期實驗通過對6個品種豬(長白豬、大白豬、杜洛克豬、清平豬、梅山豬、通城豬)感染高致病性藍耳病毒(PRRSV)進行抗病豬的篩選，通過臨床癥狀記錄:采食量、體溫、生理生化、細胞因子以及存活時間等的檢測，最后得到了對藍耳病抗性差異較大的兩個品種:長白豬(易感豬)、通城豬(抗病豬)。
[0025]選取抗病豬和易感豬各8頭，分別在第O天和感染高致病PRRSV后第3、5、7天宰殺取樣，肺組織提取總RNA，建庫進行高通量測序，通過生物信息學分析。分析發現:在攻毒第O天即對照組，BTG2在通城豬肺組織中的第3天的相對表達量(RPKM) 218.16大于長白豬的88.52 ;而且在通城豬肺組織中BTG2的表達達到峰值是在感染后第3天，在長白豬肺組織中BTG2基因感染后的表達量均低于感染前(如圖1所示)。
[0026]實施例2利用細胞實驗方法驗證BTG2基因抗PRRSV感染
[0027]1.設計針對BTG2基因(GenBank登錄號為EU255256.1)的引物，利用反轉錄PCR技術反轉錄mRNA并擴增得到BTG2基因的CDS序列，引物序列如下:
[0028]目的基因BTG2:
[0029]上游引物BTG2-F:
[0030]5' -GCGTCGACCATGAGCCAGGCCCGCTGGAC-3'；
[0031]下游引物BTG2-R:
[0032]5' -CCCTCGAGACTAACTGGAGACCGCCATGACGTAG-3'。
[0033]將擴增得到的BTG2基因的⑶S序列(如SEQ ID N0.1所示)導入原始載體pCMV-Myc-N (購自Clonetech公司，載體圖譜如圖2所示)，構建pCMV_BTG2_Myc載體。由于pCMV-Myc-N具有CMV強啟動子，能夠使導入其中的BTG2基因進行過表達。
[0034]2.BTG2基因過表達的驗證
[0035]將構建好的連有BTG2基因⑶S序列的pCMV_BTG2載體和未連接有BTG2基因的⑶S序列的pCMV-Myc-N載體，分別轉染MARC145細胞。
[0036]3.將構建好的連有BTG2基因⑶S序列的pCMV_BTG2載體和未連接有BTG2基因的CDS序列的pCMV-Myc-N載體，分別轉染MARC145細胞，培養24小時之后，提取細胞的總RNA,對PRRS病毒的0RF7 (第7個編碼閱讀框)進行定量PCR檢測。
[0037]PRRS 病毒 0RF7 引物:
[0038]上游引物PRRS-F: AATAACAACGGCAAGCAGCA ；
[0039]下游引物PRRS-R: GCACAGTATGATGCGTCGGC。
[0040]為了計算PRRS病毒0RF7的相對表達量，在對PRRS病毒的0RF7進行定量PCR檢測的同時引入內參基因GAPDH (GAPDH在細胞內表達量比較恒定)，同時進行PCR擴增。
[0041]內參基因GAPDH (GenBank 登錄號為 ΝΜ_001206359.1):
[0042]內參基因GAPDH引物:
[0043]上游引物GAPDH-F: CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC ；
[0044]下游引物GAPDH-R:GACGCCTGCTTCACCACCTTCT。
[0045]4.分析轉染了帶有BTG2基因⑶S序列的質粒的細胞中的PRRS 0RF7的拷貝數與轉染了不帶有BTG2基因CDS序列的質粒的細胞中的0RF7的拷貝數是否有顯著差異。我們的結果顯示，在攻毒完成，并培養24小時后，轉染了過表達BTG2基因CDS序列的細胞中的PRRS病毒的0RF7的相對表達量要顯著的低于對照組(如圖3所示)。
[0046]通過比較過表達BTG2基因的MARC145細胞和不轉任何基因的MARC145細胞中的PRRS的拷貝數目，來分析BTG2基因對于PRRS病毒在MARC145細胞中復制的影響。我們研究發現過表達BTG2基因后，PRRS病毒在MARC145細胞中的復制明顯受到抑制，這說明BTG2基因對于PRRS病毒的復制具有抑制作用，我們可以通過過表達BTG2基因來達到抑制PRRS病毒復制的目的。
[0047]本實施例實驗操作中包含:
[0048]I)總RNA的提取
[0049]總RNA的提取是用Invitrog en公司生產的TRIzol試劑，并嚴格按照產品說明書要求進行操作。
[0050]2)反轉錄 PCR
[0051]反轉錄所采用的是MMLV逆轉錄DNA聚合酶并嚴格按照Promega公司的說明書要求進行操作。
[0052]3)利用熒光實時定量PCR技術檢測PRRSV 0RF7的表達情況
[0053]熒光實時定量PCR:
[0054]儀器型號:ABI公司生產的 Applied BiosystemsViiA7
[0055]試劑盒:康為世紀公司生產的FastSYBR mixture (Coffin Biotech C0., Ltd.[CWBIO])，并按照產品說明書操作。
[0056]PRRSV 0RF7相對表達量分析方法:
[0057]Λ Λ Ct方法:Λ Ct實驗組=(實驗組目的基因Ct-實驗組內參基因Ct)
[0058]Δ Ct對照組=(對照組目的基因Ct-對照組內參基因Ct)
[0059]2—Δ ACt=2~(ACt 實驗組-ACt 對照組)
[0060]采用GAPDH作為內參基因。
[0061]實施例3利用BTG2基因過表達制備抗PRRSV的轉基因豬
[0062]1、供體細胞的復蘇。從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，并不斷快速搖動凍存管。待冷凍液徹底解凍后，轉移至離心管中，用新鮮培養液稀釋3倍，1000rpm,離心5分鐘，出去上清，用新鮮的培養液懸浮細胞沉淀，將細胞稀釋至所需濃度，接種到培養皿中
培養。`
[0063]2、利用脂質體轉染的方法，將目的質粒轉入供體細胞中。常規方法消化細胞，用IOOul無血清培養基DMEM來稀釋0.8ug待轉質粒和2ul脂質體(lipofectamineTM2000)。室溫孵育20分鐘后，向24孔培養板的每個孔內添加IOOul上述液體。將培養板前后輕輕晃動搖勻，培養4-6小時后更換培養液為完全細胞培養基。
[0064]3、轉基因陽性細胞的篩選。將脂質體轉染48小時的細胞加入800ug/mL G418，每2-3天換液一次，篩選14天后，用PBS洗2遍，收集陽性細胞克隆。
[0065]4、轉基因陽性細胞的DNA檢測。按照常規分子克隆方法，提取轉基因陽性細胞DNA并進行PCR驗證。
[0066]5、以上述轉基因陽性細胞為核移植供體細胞，以體外成熟的初情期前母豬卵母細胞為核移植受體細胞。把供體細胞以及成熟卵母細胞同時轉入39度，5%C02,100%濕度平衡10分鐘，然后在配有顯微操作儀器及恒溫臺的倒置顯微鏡上用固定吸管吸持卵母細胞，用注射針將吸取卵母細胞核。然后挑選表面光滑的體細胞，從去核時裂口處放入卵周隙，用注射針點壓透明帶，使供體細胞與受體卵的胞膜接觸緊密。將供體細胞-卵胞質構成的重構卵轉移到培養液PZM3中，在39度，5%C02，100%濕度培養箱中恢復I小時。
[0067]6、將恢復好的重構卵分批轉移到融合液中平衡2分鐘，用融合/激活液洗滌3遍后，每批放5-8個放入已經鋪滿融合液的融合槽內，使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行，用CUY-21融合儀(BEX，日本)施加I個lOOus，1.4kv/cm的直流電脈沖誘導融合同時激活，接著用PZM3培養液洗滌3遍，立即轉入礦物油覆蓋胚胎培養液中或輔助激活液中，39度，5%C02,100%濕度培養4小時后再體視顯微鏡下判定融合。
[0068]7、克隆胚胎體外培養。將融合的重構胚用胚胎培養液洗滌5遍后，轉入預平衡2小時以上的胚胎培養液PZM3中，培養條件39度，5%C02，5%02，90%N2，飽和濕度。
[0069]8、挑選形態優良的克隆胚胎用非手術法移入自然發情的經產母豬子宮內進行妊娠。[0070]9、對出生的克隆轉基因豬進行PCR和southern檢測，進行功能研究。
[0071]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所`做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應用，其特征在于，其是通過BTG2基因在細胞中的過表達來抑制PRRS病毒在細胞中的復制。
2.一種過表達BTG2基因的載體。
3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于，所述載體為導入BTG2基因CDS序列的pCMV-Myc-N 載體。
4.含有權利要求2或3所述載體的轉基因細胞。
5.根據權利要求4所述的轉基因細胞，其特征在于，其為除胚胎細胞外的豬體細胞。
6.一種制備克隆胚胎的方法，其特征在于，其以權利要求5所述轉基因細胞為核移植供體細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術獲得克隆胚胎。
7.利用BTG2基因表達量篩選抗PRRS病毒豬的方法，其特征在于，所述方法為通過對豬的BTG2基因的表達量進行測定，BTG2表達量高的豬比BTG2表達量低的豬具有更高的抗PRRS病毒感染能力。
【文檔編號】A61K48/00GK103751802SQ201310717888
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】李寧, 李佳, 任立明, 李駿蔚 申請人:中國農業大學