一株溶藻希瓦氏菌及其在控制藍藻水華中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株溶藻希瓦氏菌及其在控制藍藻水華中的應用。從太湖水體中分離獲得了一株具有顯著溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella?sp.)Lzh-2，保藏號為CGMCC?No.6549，并且從其代謝產物中分離純化并鑒定出其有效溶藻成分六氫吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氫吲哚-2,3-二酮，其中六氫吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮對銅綠微囊藻9110的半致死量LD50為5.7μg/mL，對聚球藻BN60無致死效果，二氫吲哚-2,3-二酮對銅綠微囊藻9110和聚球藻BN60的半致死量LD50分別為12.5μg/mL和34.2μg/mL。可用于新型生物殺藻劑的研發和生產，最終應用于湖泊藍藻水華的控制。
【專利說明】一株溶藻希瓦氏菌及其在控制藍藻水華中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境微生物領域，特別涉及一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2及其在藍藻水華控制中的應用。
【背景技術】
[0002]近些年來湖泊富營養化導致的藍藻水華爆發對湖泊水系的污染日益嚴重，太湖、巢湖、滇池等淡水水域都受到了嚴重的影響。因此探索控制藍藻生物量和抑制藍藻水華發生的有效途徑是非常必要的。
[0003]藍藻水華的控制技術可歸納為物理方法、化學方法和生物方法。物理方法如機械除藻、電磁場除藻等可以作為水華爆發的輔助控制措施，但是缺點在于治標不治本，并且處理能力有限；化學方法如除草劑等化學殺藻劑可以直接殺死藻類，但這些化學物質的專一性差，而且容易富集在食物鏈中造成二次污染。
[0004]其中由于物理方法和化學方法存在上述缺陷，生物方法因其環保、經濟等優點，受到越來越多的關注。針對藍藻的溶藻細菌(algae-lysing bacteria)是一類可以直接(菌藻細胞接觸)或者間接(分泌胞外物質)抑制滅殺藍藻的細菌統稱，它們是淡水生態環境系統的重要組成部分，對減少藍藻的生物量，維持生態平衡具有重要作用。
[0005]因此，本領域的技術人員致力于篩選高效溶藻細菌或分離富集溶藻細菌代謝產生的高效溶藻活性物質，以開發微生物殺藻劑，用以安全和高效的控制藍藻水華問題。
【發明內容】
[0006]鑒于現有技術中物理方法和化學方法處理能力有限、容易造成二次污染的缺陷，本發所要解決的技術問題是尋找高效溶藻細`菌及分離富集溶藻細菌代謝產生的高效溶藻活性物質，用以安全和高效的控制藍藻水華問題。
[0007]為實現上述目的，本發明提供了一株具有溶藻活性的希瓦氏菌及其代謝產物在藍藻水華控制中的應用。
[0008]本發明公開了一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh_2,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.6549，保藏日期為2012年9月14日。保藏機構地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編:100101,電話:86-10-64807355。
[0009]進一步地，本發明提供了上述希瓦氏菌Lzh-2在控制藍藻水華中的應用。
[0010]進一步地，本發明提供了上述希瓦氏菌Lzh-2的發酵產物在控制藍藻水華中的應用。
[0011]進一步地，本發明公開了上述希瓦氏菌Lzh-2的發酵產物中兩種具有溶藻活性的有效成分，分別為具有結構式(I)和(II)所示結構的化合物，本發明提供了一種具有結構式(I)所示結構的化合物在控制藍藻水華中的應用。
[0012]οO
0
Oh
(I)(II)
[0013]進一步地，本發明提供了一種溶藻菌劑，其特征在于，所述溶藻菌劑中包含權利要求I所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2?
[0014]進一步地，本發明提供了 一種溶藻藥劑，其特征在于，所述溶藻藥劑中包含權利要求I所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh_2的發酵產物，所述發酵產物為發酵液、發酵液濃縮物、發酵液粗提物或發酵液提取物。
[0015]進一步地，本發明提供了一種控制藍藻水華的方法，包括如下步驟:
[0016]I)、發酵希瓦氏菌Lzh-2菌株；
[0017]2)、萃取發酵液；
[0018]3)、萃取液蒸干得粗提物；
[0019]4)、粗提物水溶后用于控制藍藻水華。
[0020]優選地，步驟I)中，發酵條件為，希瓦氏菌Lzh-2接種于pH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養基中，28°C、200rpm環境條件下發酵48h，得到所述希瓦氏菌Lzh_2發酵液。
[0021]優選地，步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，萃取體系中乙酸乙酯與發酵液的體積比為1:1，混合后，放入振蕩器中振蕩24h，分離出的上層乙酸乙酯溶液即希瓦氏菌Lzh-2發酵液的萃取液。萃取液蒸干后即為發酵液粗提物。粗提物經本領域常規技術手段，如柱層析的方法，進一步提純即可得到發酵液提取物，發酵液提取物可以為單一成分，也可以為包括多種組分的組合物。
[0022]所述希瓦氏菌Lzh-2發酵液對下列藻株的4天溶藻率分別為:衣藻BS3為91.7±7.8%，綠藻BI為86±12.1%，銅綠微囊藻PCC7806為79±4.1%，銅綠微囊藻9110為 77.3 ±3.4%,顫藻 BN35 為 74.1 ±4.5%,綠色微囊藻 FACHB-979 為 72.6 ±5.7%,聚球藻BN60為43±5.8%，色球藻FACHB-191為34.1 ±6.9% ；6天溶藻率分別為:衣藻BS3為93.1 ±7.3%，綠藻 BI 為 97.9±6.2%，銅綠微囊藻 PCC7806 為 84.9±3.8%，銅綠微囊藻 9110為 92.3±6.8%，顫藻 BN35 為 97.2±10.5%，綠色微囊藻 FACHB-979 為 86.3±8.5%，聚球藻BN60 為 81.9±3.9%，色球藻 FACHB-191 為 29.5±9.7%。
[0023]所述希瓦氏菌Lzh-2發酵液，利用HPLC技術純化希瓦氏菌Lzh_2的代謝產物，具體制備方法如下:
[0024]將所述萃取液蒸干并加水溶解后使用0.22 μ m孔徑濾膜過濾，濾液通過DIKMA公司的SupersilTM C18-EP半制備柱，水和甲醇為流動相的HPLC進行初步純化，得到溶藻成分；
[0025]將所述溶藻成分通過DIKMA SupersilTM C18-EP分析柱，水和甲醇為流動相的HPLC進行進一步純化，得到兩種有效溶藻成分S-2A和S-2B。
[0026]所述的希瓦氏菌Lzh-2的代謝產物中有效的溶藻成分的化學結構通過LC-MS、GC-MG和HMR分析獲得。
[0027]希瓦氏菌Lzh-2用于控制藍藻水華時，其有效的溶藻成分S-2A的分子離子峰為155.0821m/z，樣品分子量為154.0742，分子式為C7HltlN2O2，核磁共振氫譜結果是1HNMR (400MHz, D2O) δ 4.22 (s, I H)，4.06 (dd, J=17.3，2.7Hz, 1H)，3.77 (d, J=17.3Hz, 1H)，3.44(dd, J=8.7，4.8Hz，2H), 2.41 - 2.12 (m, 1H) ,2.09-1.71 (m, 3H);有效的溶藻成分 S-2B 的分子尚子峰為146.0250m/z,樣品分子量為147.1308,分子式為C8H5NO2,核磁共振氫譜結果是1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.11 (s, 1H)，7.76 (d, J=7.5Hz, 1H)，7.70 (s, 1H)，7.26 (t, J=7.6Hz,1H)，7.05 (d, J=7.9Hz, 1H)。
[0028]進一步地，有效的溶藻成分S-2A是所述希瓦氏菌Lzh-2的代謝產物六氫吡咯并[I, 2-A]吡嗪-1，4- 二酮，有效的溶藻成分S-2B是所述希瓦氏菌Lzh-2的代謝產物二氫吲哚-2，3-二酮。
[0029]進一步地，六氫吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4- 二酮對銅綠微囊藻9110的半致死量LD50為5.7 μ g/mL ;所述二氫吲哚_2，3- 二酮(靛紅)對銅綠微囊藻9110的半致死量LD50為12.5 μ g/mL,對聚球藻BN60的半致死量LD50為34.2 μ g/mL。
[0030]本發明的希瓦氏菌Lzh-2的溶藻效果具有廣譜性。其發酵液制備方法簡單，制備周期短。希瓦氏菌Lzh-2的發酵液對太湖中的銅綠微囊藻9110、聚球藻BN60、綠藻B1、顫藻BN35等具有很好的溶藻效果，而銅綠微囊藻和聚球藻是太湖藍藻水華中的主要藍藻。希瓦氏菌Lzh-2發酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于藍藻水華或其它微藻的控制，且溶藻效果較好。其中，希瓦氏菌Lzh-2發酵液對銅綠微囊藻9110的6天溶藻率達到92.3±6.8%，對聚球藻BN60的6天溶藻率達到81.9 ±3.9%。希瓦氏菌Lzh_2的代謝產物六氫吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4-二酮和二氫吲哚-2，3-二酮(靛紅)對太湖藍藻水華中的主要藍藻銅綠微囊藻9110和聚球藻BN60具有較好的致死作用`，可用于新型殺藻劑的研發和生產，最終應用于湖泊藍藻水華的控制。
[0031]以下將結合附圖對本發明的希瓦氏菌Lzh-2菌株及其代謝產物六氫吡咯并[I, 2-A]吡嗪-1，4- 二酮和二氫吲哚_2，3- 二酮(靛紅)在藍藻水華控制中的效果作進一步說明，以充分地了解本發明的目的、特征和效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1是溶藻菌Lzh-2對銅綠微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果；
[0033]圖2是溶藻菌Lzh-2的發酵液乙酸乙酯萃取液加入到銅綠微囊藻9110藻平板上的溶藻效果；
[0034]圖3是溶藻物質六氫吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4_ 二酮和二氫吲哚_2，3_ 二酮分別加入到銅綠微囊藻9110藻平板上的溶藻效果；
[0035]圖4是溶藻物質六氫吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4_ 二酮和二氫吲哚_2，3_ 二酮分別加入到藻液中對銅綠微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果。
【具體實施方式】[0036]實施例1溶藻細菌的篩選
[0037]將太湖梅梁灣水域采集的IOmL自然水樣加入到90mL對數期的銅綠微囊藻9110的藻液中，兩天后取黃化藻液用梯度稀釋法涂牛肉膏蛋白胨培養基瓊脂平板，28°C培養24h，取菌落密度適中的平板，按照菌落形態的不同挑選不同菌株。
[0038]將篩選出來的菌株分別接種入IOmL牛肉膏蛋白胨培養基中，28°C，200rpm培養24h，將IOmL培養好的菌液分別加入90mL對數期銅綠微囊藻的藻液中。另外將IOmL滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養基同樣加入90mL藻液中作為對照。所有實驗組和對照組的藻液在光照培養箱中培養48h后計算其溶藻效率，選取了其中溶藻效率最高的一株細菌進行進一步研究，該菌株代號為Lzh-2。
[0039]藻液培養條件:銅綠微囊藻9110用BGll液體培養基培養,放置于光照培養箱中，25°C,光照強度40 μ mol photons m-2s_l,光暗周期比為12h:12h (光照:黑暗)。
[0040]溶藻效率計算方法:溶藻效率(%)=(對照組藻細胞密度-實驗組藻細胞密度)/對照組藻細胞密度X100。其中銅綠微囊藻的藻細胞密度用血球計數板測定。
[0041]圖1中A為加入溶藻菌Lzh-2時銅綠微囊藻9110細胞濃度隨時間的變化曲線(溶藻菌1^11-2(1\108(^118/1^)(_)和空白對照(令))。B為加入溶藻菌Lzh-2時聚球藻BN60葉綠素a濃度隨時間的變化曲線(溶藻菌Lzh-2(1X 108cells/mL) (.)和空白對照(▲))。
[0042]實施例2希瓦氏菌Lzh-2菌株的鑒定
[0043]用形態觀察、染色、生理生化反應、16srRNA基因序列分析等方法對溶藻效果最強的Lzh-2進行鑒定，該菌株為革蘭氏陰性，直短桿狀，極生單鞭毛，大小為0.6 μ m~Ι.Ομ--ΧΙ.Ομπι~4.Ομ--，在液體培養基中搖床培養24h后，個別菌體長達7 μ m。在營養瓊脂固體培養基平板上培養24h后，菌落形態為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，無色至淡肉紅色，透明，菌落大小為2mm~3mm。經16srRNA基因序列分析和同源性比較，得知其與GenBank中某希瓦氏菌菌株有99%的同源性,故鑒定為希瓦氏菌Shewanella sp.,命名為希瓦氏菌Lzh-2。該菌種已經保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6549，保藏日期為2012年9月14日。保藏機構地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編:100101，電話:86-10-64807355。該菌種的16srRNA基因在GenBank中的登錄號是HQ896842。
[0044]實施例3希瓦氏菌Lzh-2發酵液及其乙酸乙酯萃取液的制備方法
[0045]將希瓦氏菌Lzh-2按照1%接種量接種于滅菌牛肉膏蛋白胨培養基中，28°C下200rpm搖床培養48h后得到希瓦氏菌Lzh-2含菌發酵液。將乙酸乙酯按照1:1的比例加入發酵液中，放入振蕩器中振蕩24h，分離出上層溶液，即乙酸乙酯萃取液。將乙酸乙酯蒸干，加水溶解，再使用0.22 μ m孔徑的微孔濾膜過濾后用于進一步純化代謝產物。
[0046]實施例4希瓦氏菌Lzh-2對不同藍藻和真核藻類的溶藻效果
[0047]將8份培養好的(培養條件:牛肉膏蛋白胨培養基，280C，200rpm培養24h)10mL希瓦氏菌Lzh-2菌液分別加入8株藍藻和真核藻(表1)的藻液中(90mL，所有藻液均培養到對數期)，同樣使用IOmL無菌牛肉膏蛋白胨培養基分別加入8種藻液中(90mL，所有藻液均培養到對數期)作為對照(1:9)，在光照培養箱中培養4天和6天后分別測定所有實驗組和對照組的藻液的葉綠素濃度，計算其溶藻效率。每個樣品測三個平行樣，表示成平均值土標準差的形式。
[0048]實驗中用到的藻種有3株購自武漢水生所藻種庫，另外5株篩選自太湖水體。實驗結果表明，希瓦氏菌Lzh-2的發酵液對于絕大部分原核藻種具有很好的溶藻效果，對色球藻FACHB-191沒表現出很好的溶藻效果(表1)。此結果表明希瓦氏菌Lzh_2的溶藻能力具有廣譜性，是一種非常有潛力的溶藻細菌。
[0049]表1.希瓦氏菌Lzh-2對8株藻株的溶藻效果
[0050]
【權利要求】
1.一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh_2,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.6549，保藏日期為2012年9月14日。
2.如權利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2在控制藍藻水華中的應用。
3.如權利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2的發酵產物在控制藍藻水華中的應用。
4.一種具有結構式(I)所示結構的化合物在控制藍藻水華中的應用。
5.一種溶藻菌劑，其特征在于，所述溶藻菌劑中包含權利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2。
6.一種溶藻藥劑，其特征在于，所述溶藻藥劑中包含權利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2的發酵產物，所述發酵產物為發酵液、發酵液濃縮物、發酵液粗提物或發酵液提取物。
7.一種控制藍藻水華的方法，包括如下步驟: . 1)、發酵權利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2； .2)、萃取發酵液； .3)、萃取液蒸干得粗提物； . 4)、粗提物水溶后用于控制藍藻水華。
8.如權利要求7所述的方法，其中步驟I)中，發酵條件為，希瓦氏菌Lzh-2接種于PH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養基中，28°C、200rpm環境條件下發酵48h，得到所述希瓦氏菌Lzh-2發酵液。
9.如權利要求7所述的方法，其中步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯。
10.如權利要求9所述的方法，其中步驟2)中，乙酸乙酯與發酵液的體積比為1:1。
【文檔編號】C12R1/01GK103509744SQ201310413420
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月11日 優先權日:2013年9月11日
【發明者】楊虹, 李正華, 柳向龍, 潘建良, 譚晶 申請人:上海交通大學