蛋白a1g_07050在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白A1G_07050在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用。本發明公開的A1G_07050蛋白，其序列如SEQ?ID?No.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示。蛋白A1G_07050可通過基因工程制備，用蛋白A1G_07050作為疫苗與立氏立克次體全菌蛋白疫苗相比，具有制備方法簡單、成本低、產量高、更安全等優點，本發明對于落基山斑點熱的防疫和治療具有重大價值。
【專利說明】蛋白A1G_07050在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蛋白A1G_07050在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用。
【背景技術】
[0002]立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)是一種嚴格胞內寄生的革蘭氏陰性菌，是落基山斑點熱(Rocky Mountain Spotted Fever, RMSF)的病原體。該菌主要分布在北美洲，其為斑點熱群立克次體(spotted fever group rickettsia, SFGR)中毒力最強的一個種，被列為生物戰劑和潛在的生物恐怖劑。
[0003]落基山斑點熱是一種嚴重威脅人類健康的人獸共患自然疫源性疾病。RMSF最早發現在美國西北部的愛達荷州和蒙大拿州，1899年Maxey報告了第一例RMSF臨床病例。在1906到1909年之間，Ricketts首先對該病進行了病原學研究，他證實了安氏革蜱為該病的傳播媒介。
[0004]RMSF的早期臨床表現主要有發熱，頭痛和肌痛。后期病情嚴重者可出現血壓下降，未接受治療者可產生肺炎，組織壞死和循環衰竭，并發心和腦后遺癥。在暴發型病例中可因心跳突然停止而死亡。雖然抗生素治療對落基山斑點熱有效，但由于立氏立克次體能以氣溶膠的形式傳播，一旦流行難以控制。并且RMSF早期癥狀缺乏特異性，很難與其他疾病相區別，難以做到早發現早治療。因此采用有效的疫苗作為預防接種是防止RMSF發生和流行的最有效手段。
[0005]二十世紀中期到末期，RMSF疫苗的研制主要集中在滅活疫苗上。1970年美國陸軍傳染病醫學研究所用雞胚成纖維細胞培養立氏立克次體并通過蔗糖密度梯度離心獲得純化的病原體，將純化立克次體甲 醛滅活后制成疫苗，在1983年進行的人體保護性試驗中證明該疫苗可以保護25%的接種者，可減輕患者的發熱反應，并能使四環素的治療效果更快更好。但是該滅活疫苗僅提供有限的保護作用，遠沒有達到有效疫苗保護標準。另外制備立氏立克次體滅活疫苗通常需要雞胚或者細胞大量培養立克次體，但是提取純化立克次體的防護要求高，工藝復雜，成本昂貴，因此難以大量制備和推廣使用。
[0006]隨著對RMSF疫苗研究的不斷深入以及蛋白質組學的飛速發展，人們將目光轉向了亞單位。研究發現立氏立克次體外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白B(OmpB)以及普氏立克次體外膜蛋白B(OmpB)免疫產生的抗體可以中和立克次體對小鼠的致死毒性，給予OmpA及OmpB的單克隆抗體可以保護豚鼠有效抵抗致死劑量的立氏立克次體的感染并交叉保護小鼠抵抗致死劑量的康氏立克次體(R.conorii)的感染。這些外膜蛋白盡管有一定的保護作用，但是其免疫保護效果有限，目前難以代替滅活RMSF疫苗。因此，鑒定立氏立克次體的保護性抗原，研發更加安全、有效、持久的亞單位疫苗對預防RMSF具有重大的意義。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種蛋白A1G_07050在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用。[0008]本發明提供的A1G_07050蛋白，為如下(I)- (3)中任一所示的蛋白:
[0009](I)SEQ ID N0.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示的蛋白；
[0010](2) SEQ ID N0.1 所示的蛋白；
[0011](3)將(I)或(2)所示的序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；
[0012]上述蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。
[0013]上述基因中，所述編碼基因為如下中至少一種: [0014]I) SEQ ID N0.3中自5’末端起第490位至第1143位核苷酸所示的DNA分子；
[0015]2) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
[0016]3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；
[0017]4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質的DNA分子。
[0018]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。
[0019]上述蛋白在制備預防和/或治療立氏立克次體引起的疾病的廣品中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0020]上述應用中，所述疾病為落基山斑點熱。
[0021]上述任一所述的應用中,所述產品為疫苗。
[0022]上述蛋白在制備降低被立氏立克次體感染的動物的臟器組織內立氏立克次體數量的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0023]上述應用中，所述臟器為脾臟、肝臟和/或肺臟。
[0024]本發明的蛋白A1G_07050可以作為一種抗原蛋白，刺激機體產生免疫應答對抗立氏立克次體毒株的攻擊，可以作為具有落基山斑點熱疫苗功能的保護性抗原。蛋白A1G_07050可通過基因工程制備，用蛋白A1G_07050作為疫苗與立氏立克次體全菌蛋白疫苗相比，具有制備方法簡單、成本低、產量高、更安全等優點，本發明對于落基山斑點熱的防疫和治療具有重大價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為DNA電泳檢測。
[0026]圖2為蛋白電泳檢測和免疫印跡實驗(Western blot)。
[0027]圖3為實時熒光定量PCR檢測免疫小鼠脾組織內立氏立克次體拷貝數。
[0028]圖4為實時熒光定量PCR檢測免疫小鼠肝組織內立氏立克次體拷貝數。
[0029]圖5為實時熒光定量PCR檢測免疫小鼠肺組織內立氏立克次體拷貝數。
【具體實施方式】
[0030]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0031]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0032]下述實施例中所用的試劑如無特殊說明，均購自國藥集團化學試劑公司。
[0033]下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。[0034]以下實施例中利用儀器NAN0DR0P1000分光光度計(購自Thermo Scientific公司)進行蛋白濃度的測定；利用儀器7300Real Time PCR System(購自Applied Biosystems公司)進行立氏立克次體拷貝數的測定。
[0035]載體pET_32a(+)購自Novagen公司，產品目錄號為69015。
[0036]大腸桿菌BL21購自Novagen公司，產品目錄號為69450。
[0037]C3H/HeN小鼠(3-4周齡，雄性)購自北京維通利華公司。
[0038]弗氏完全佐劑(CFA)購自Sigma公司，產品目錄號為F-5881。
[0039]弗氏不完全佐劑(IFA)購自Sigma公司，產品目錄號為F-5506。
[0040]鎳-NTA瓊脂糖凝膠(N1-NTA)試劑盒購自Qiagen公司，產品目錄號為30230。
[0041]DNA提取試劑盒購自Qiagen公司，產品目錄號為69506。
[0042]辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自中科瑞泰公司，產品目錄號為ZB-2305。
[0043]限制性內切酶均購自大連TaKaRa公司。
[0044]實施例中所用的立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)均為立氏立克次體 Sheila Smith 株(Rickettsia rickettsii, Sheila Smith strain),該菌株在文獻“Ellison Dff, Clark TR, Sturdevant DE, Virtaneva K, Porcella SF, Hackstadt T.Genomiccomparison of virulent Rickettsia rickettsii Sheila Smith and avirulentRickettsia rickettsii 1wa.1nfect Immun.2008Feb;76(2):542-50.Epub2007Novl9.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。
[0045]主要試劑的配制:
[0046]PCR 反應用 2XMix 的配制(Iml):
試劑名稱_Wn_
Taq DNA 聚合酶(5υ/μ1)ΙΟμΙ
[0047]
IOXBuffer (Mg，200μ1
dNTP Mixture160M-1
[0048]加去離子水定容至lml。
[0049]可溶性蛋白裂解緩沖液ρΗ8.0 (1000ml):
組成質量
50 mM NaH2PO47.80g NaH2PO4.2^0 (MW 156.0lg/raol)
[0050]300 mM NaCl17.54g NaCl (MW 58.44g/mol)
10 mM 咪唑0.68g 咪唑(MW 68.08g/mol)
[0051]稱取上述質量的各試劑，用去離子水溶解并定容到1000ml，NaOH調節pH至8.0。
[0052]包涵體表達形式目的蛋白純化所需緩沖液的配制如下:
[0053]一、包涵體蛋白裂解緩沖液pH8.0 (1000ml):
【權利要求】
1.A1G_07050蛋白，為如下(I)-(3)中任一所示的蛋白: (1)SEQID N0.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示的蛋白； (2)SEQ ID N0.1所示的蛋白； (3)將(I)或(2)所示的序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因為如下中至少一種: 1)SEQ ID N0.3中自5’末端起第490位至第1143位核苷酸所示的DNA分子； 2)SEQ ID N0.3所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子； 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.權利要求1所述的蛋白在制備預防和/或治療立氏立克次體弓丨起的疾病的產品中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:所述疾病為落基山斑點熱。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于:所述產品為疫苗。
8.權利要求1所述的蛋白 在制備降低被立氏立克次體感染的動物的臟器組織內立氏立克次體數量的產品中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述臟器為脾臟、肝臟和/或肺臟。
【文檔編號】C12N1/19GK103483430SQ201310444429
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】龔文平, 熊小路, 溫博海, 齊永, 段長松, 焦俊, 楊小梅 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所