一種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標的制作方法

一種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標的制作方法
【專利摘要】一種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標，包括核酸莖環結構，與核酸莖環結構5'端連接的熒光基團和與核酸莖環結構3'端連接的淬滅基團，其制備方法是：在半導體量子點水溶液中加入連接劑，加入核酸鏈在37℃孵育；再加入NaCl甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后沉淀重懸于去離子水中；加入核黃素水溶液進行反應即可。本發明的優點是：選用量子點和核黃素作為信標中熒光共振能量轉移的供體和受體，使自由態的分子信標具有細胞染色和紅外成像的能力；當信標分子一旦與靶點結合，量子點的熒光信號即被恢復；將人端粒酶逆轉錄酶設計為分子信標的靶點，利用其只在腫瘤細胞中高效表達的特點，使該分子信標具有癌癥診斷的通用性。
【專利說明】—種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，特別是一種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標。
【背景技術】
[0002]端粒酶活性是人類惡性腫瘤早期診斷的通用標志物，這是因為85-95%的各類惡性腫瘤組織中都存在端粒酶的陽性表達。癌細胞之所以能夠突破壽命的限制，是因為它們可以合成具有活性的端粒酶，端粒酶能夠對縮短的染色體末端進行修復，使癌細胞無限地分裂。因此可以采用端粒酶靶向探針進行腫瘤細胞的診斷和標識。近年發展起來的分子信標作為一種靶向檢測探針，吸引了許多研究者的注意，分子信標是一種具有發夾結構的熒光核酸探針，自由狀態時的分子信標呈發夾結構，此時由于熒光基團與淬滅基團靠得很近，熒光被淬滅；當與靶序列結合后，分子信標的空間構型發生改變，熒光恢復。
[0003]目前，人們對分子信標的結構做出了許多改進，使其在序列檢測、病原體偵測、藥物療效監測、區分基因野生型和突變型、DNA-蛋白相互作用研究、定量聚合酶鏈擴增(PCR)、以及體外轉錄反應中的RNA實時檢測等眾多領域中得到應用。如中國專利CN102115784A公開了一種PCR熒光分子信標探針技術定量檢測人類白細胞抗原B27基因的方法，淬滅基團為DABCYL，熒光基團為FAM，以HLA-B27基因為檢測目標，實現了對HLA-B27基因的快速定量檢測。中國專利CN102154474A也公開了一種用于肺癌診斷的分子信標復合物，包括磁性納米微球以及吸附在磁性納米微球上的分子信標，發光基團為Alexa488，淬滅基團為BHQI，該發明克服分子信標活體檢測中的假陽性問題，對活細胞內miR-155進行檢測，從而實現對肺癌的診斷與 鑒別診斷。
[0004]我們已經知道人端粒酶主要包括三種成分:人端粒酶RNA成分(humantelomerase RNA template, hTR)、人端粒酶催化亞單位(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)及端粒酶相關蛋白hTEPl (TPl / TLP1)，其中hTERT是端粒酶活性的決定因素，其基因位于5號染色體短臂末端5pl5.33的單拷貝基因，大小約3.5kb，其mRNA水平與端粒酶活性呈正相關。本發明采用量子點作為分子信標的熒光基團，設計了一種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標，它能與腫瘤細胞中的hTERT mRNA發生特異性結合，進而檢測端粒酶的活性。本發明的基本思路是選用量子點和核黃素作為信標中熒光共振能量轉移(FRET)的供體和受體，使自由態的分子信標不具有熒光信號，能用于細胞染色和成像，通過檢測熒光信號可以追蹤分子信標的準確位置；當信標與靶點結合時，信標中量子點的熒光信號恢復，癌變細胞就會出現閃爍的亮點，實現對腫瘤細胞成像和早期診斷。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對上述技術分析，提供一種操作簡單、特異性強、靈敏度高的用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標，而且其制備方法簡單、操作方便，可用于端粒酶活性檢測。
[0006]本發明的技術方案:
一種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標，包括核酸莖環結構，與核酸莖環結構5’端連接的熒光基團和與核酸莖環結構3’端連接的淬滅基團，所述核酸莖環結^5' ccgctggcca cgttcgtgcg g3，[No ID +101 ~+1211, 5’gcgcggg gacccggcggctttccgcgc3' [No ID +154~+180],5’gtggcc cagtgcctgg tgtgcgtgcc ctgggacgc3’ [No ID+185^+2201,5' gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3’「No ID +831~+857],5’eg ccgagaccaagcacttcctc tactcctcag gcg3’ [No ID +1019~+1043],5’gcttcctcag gaacaccaagaagttcatct ccctggggaa gc3’ [No ID +1491~+1532],5’ggtc tttcttttat gtcacggagacc3’ [No ID +1707~+17321,5，ctctttttct accggaagag3，[No ID +1751~+1770],5'ctgcg ggagctgtcg RaagcagS' [No ID +1826~+1847],5’egg cttttgttca gatgccg3’ [NoID +2748~+2767],5’ggtg cggcctgctg ctggataccc ggacc3’ [No ID +2787~+2815],5’gcagagc gactactcca gctatgc3’ [No ID +2824~+2847], 5’ccagtc tcaccttcaaccgcggcttc aaggctgg3，[No ID +2865~+2898],5' ctctgctac tccatcctga aagccaag3’ [NoID +3122~+31481,5’actcagga cagcccagacgcagctgagt3’「No ID +3283~+3301]，5’ ctcccggggacgac gctgactgcc ctggag3’ [No ID +3317~+3350],其中畫線部分均為該核酸鏈中能形成環狀結構的序列；所述熒光基團為TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe或CdSe/CdS、CdSe/ZnSe, CdSe/ZnS、CdS/ZnS核殼結構的半導體量子點材料；所述淬滅基團為核黃素，其分子結構如圖2所示，核酸的5’端連接一個熒光基團為半導體量子點，3’端連接一個淬滅基團為核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點。
[0007]—種所述用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標的制備，步驟如下:
1)在TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS 核殼結構的半導體量子點水溶液中，加入6-馬來酰亞胺基乙酸N-琥珀酸亞胺酯(EMCS)或雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯鈉鹽(BS3)連接劑溶液，充分攪拌10-30min后，加入5’端巰基修飾后的核酸鏈，25-40°C溫度下孵育2.5h，得到混合液；
2)在上述混合液中加入NaCl的甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后，沉淀重懸于去離子水中；
3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入核黃素水溶液，25-40°C溫度下反應2-12h，得到孵育液；
4)在上述孵育液中加入濃度為2ul1X10 - 4mol/L的核酸鏈5’ ggtctccgtgacataaaagaaagacc3’ , 25-40°C溫度下反應2.5h,即可制得該量子點_核黃素分子信標。
[0008]所述半導體量子點水溶液的濃度為0.5-10mmol/L,連接劑溶液的濃度為
0.5-10mg/mL,核酸鏈溶液的濃度為0.1 X 10—4_1 X 10—4mol/L ;半導體量子點水溶液、連接劑溶液和核酸鏈溶液的體積比為3:1:0.0075。
[0009]所述核黃素水溶液的濃度為0.01-0.15mg/mL。
[0010]所述核黃素水溶液與半導體量子點水溶液的體積比為1:1。
[0011]本發明的優點是:
本發明所開發的量子點分子信標，是一種快速、高效的癌細胞端粒酶活性檢測探針，它能從分子水平上對癌變細胞進行特異性熒光標記。當有靶序列存在時，分子信標的環序列與靶序列特異性結合，熒光分子與淬滅分子分開，產生可被檢測的425nm熒光信號；當靶序列不存在時，分子信標呈“發夾”結構，莖部的熒光分子與淬滅分子接近至7-10nm，產生熒光共振能量轉移(FRET)，量子點發出的425nm熒光被淬滅分子吸收，此時檢測不到量子點的熒光信號。該分子信標可以制備成生物制劑，配以簡單的熒光顯象裝置，就能應用到臨床診斷中。量子點分子信標是從癌變細胞生理學層面上進行檢測，這使癌癥診斷提前到了細胞水平，能爭取更多的治療時間，研究成果具有一定的社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】[0012]圖1為本發明量子點-核黃素分子信標的分子構造圖。
[0013]圖2為實施例1中量子點-核黃素分子信標的突光發射光譜。
[0014]圖3為實施例2中量子點-核黃素分子信標的突光發射光譜。
[0015]具體的實施方式 實施例1:
一種用于端粒酶活性檢測的TGA-ZnS: Mn2+量子點-核黃素分子信標，如圖1所示，包括核酸革環結構 5’gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3’ [No ID +831 ~+857],(其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環狀結構的序列)，與核酸莖環結構5’端連接的突光基團TGA-ZnS:Mn2+量子點。以及與核酸莖環結構3’端連接的淬滅基團核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點。
[0016]所述用于端粒酶活性檢測的TGA-ZnS = Mn2+量子點-核黃素分子信標的制備，步驟如下:
1)使用中國專利CN103242829A 合成的 TGA-ZnS:Mn2+，在 600 μ L 濃度我 2.5mmol/L的TGA-ZnS = Mn2+量子點水溶液中，TGA-ZnS: Mn2+采用中國專利CN103242829A方法合成，加入200 μ L濃度為0.5mg/mL 6-馬來酰亞胺基乙酸N-琥珀酸亞胺酯連接劑溶液，充分攪拌IOmin后，加入1.5ul I X 10 - 4mol/L 5’端巰基修飾后的核酸鏈5’ HS (C6) RtRaccRtRRtttctgtgtg gtgtcac3’ [No ID +831 ~+857], 37°C孵育 2.5h,得到混合液；
2)在上述混合液中加入濃度為0.055mol/L的NaCl甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后,沉淀重懸于600ul去離子水中；
3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入等體積量的濃度為0.lmg/mL的核黃素水溶液600uL，37°C孵育2h，得到孵育液；
4)在上述孵育液中加入濃度為3.5ul 1X10 —4mol/L的靶核酸5’ gtgacaccacacagaaaccacggtcacG’ , 37°C反應2.5h,即可制得該量子點-核黃素分子信標。
[0017]圖2為實施例1中量子點-核黃素分子信標的熒光發射光譜，圖中表明:TGA-ZnSiMn2+量子點的熒光發射峰為425nm，分子信標處于游離態時，量子點的熒光相對強度從27降至10，這表明量子點與核黃素之間存在熒光共振能量轉移現象，可以作為分子信標的能量供體和受體。當有靶序列存在時，分子信標的環序列與靶序列特異性結合，熒光分子與淬滅分子分開，熒光信號恢復，熒光相對強度從10升至17。
[0018]實施例2:一種用于端粒酶活性檢測的ZnS:Mn2+量子點-核黃素分子信標，如圖1所示，包括核酸莖環結構 5’ggtc tttcttttat gtcacggaga cc3’ [No ID +1707~+1732],(其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環狀結構的序列)，與核酸莖環結構5’端連接的熒光基團ZnS:Mn2+量子點。以及與核酸莖環結構3’端連接的淬滅基團核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點。
[0019]所述用于端粒酶活性檢測的ZnS =Mn2+量子點-核黃素分子信標的制備，步驟如下: 1)在600μ L濃度為8mmol/L ZnS量子點水溶液中，加入200 μ L濃度為2mg/mL的雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯鈉鹽，充分攪拌20min后，加入1.5uL濃度為0.5 X 10 -4mol/L 的 5’端巰基修飾后的核酸鏈:5’HS (C6)ggtc tttcttttat gtcacgg aga cc3’ [NoID +1707~+1732]，30°C孵育2.5h，得到混合液；
2)在上述混合液中加入濃度為0.055mol/L的NaCl甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后,沉淀重懸于600ul去離子水中；
3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入等體積量的濃度為0.05mg/mL的核黃素水溶液600ul，37°C孵育4h，得到孵育液；
4)在上述孵育液中加入濃度為2ul1X10 - 4mol/L的核酸鏈5’ ggtctccgtgacataaaagaaagacc3’，25°C反應2.5h,即可制得該量子點_核黃素分子信標。
[0020]圖3為實施例2中量子點-核黃素分子信標的熒光發射光譜，圖中表明:ZnS:Mn2+量子點的突光發射峰為425nm,分子信標處于游尚態時,量子點與核黃素之間足夠接近，存在熒光共振能量轉移現象，量子點的熒光相對強度從27降至10。當有靶序列存在時，分子信標的環序列與靶序列特異性結合，熒光分子與淬滅分子分開，熒光信號恢復至17。
【權利要求】
1.一種用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標，其特征在于:包括核酸莖環結構，與核酸莖環結構5’端連接的熒光基團和與核酸莖環結構3’端連接的淬滅基團，所述核酸某環結構的序列為5’CCRCtRRCCa CRttCRtRCR g3’[No ID +101~+121],5'gcgcggg gacccggcgg ctttccgcgc3’ [No ID +154~+180],5’gtggcc cagtgcctggtgtgcgtgcc ctgggacgc3’ [No ID +185^+220],5' gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3’ [NoID +831~+857],5’eg ccgagaccaa gcacttcctc tactcctcag gcg3’ [No ID +1019~+1043],5’gcttcctcag gaacaccaag aagttcatct ccctggggaa gc3’ [No ID +1491~+1532],5’ggtctttcttttat gtcacggaga cc3' [No ID +1707^+1732],5' ctctttttct accggaagag3’ [No ID+1751^+17701,5' ctgcg ggagctgtcg gaagcagS' [No ID +1826~+1847],5’egg cttttgttca￡atgccg3' [No ID +2748~+2767],5’ggtg cggcctgctg ctggataccc ggacc3’ [No ID+2787~+2815],5’gcagagc gactactcca gctatgc3’ [No ID +2824~+2847], 5’ccagtctcaccttcaa ccgcggcttc[No ID +2865~+2898],5' ctctgctac tccatcctgaaagccaag3' [No ID +3122^+3148],5’ actcagga cagcccagacgcBgctgagtS' [No ID+3283~+3301], 5，ctcc cggggacgac gctgactgcc ctggag3，[No ID +3317~+3350],其中畫線部分均為該核酸鏈中能形成環狀結構的序列；所述熒光基團為TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe或CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS核殼結構的半導體量子點材料；所述淬滅基團為核黃素，其分子結構如圖2所示，核酸的5’端連接一個熒光基團為半導體量子點，3’端連接一個淬滅基團為核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點。
2.一種如權利要求1所述用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標的制備，其特征在于步驟如下:
1)在TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS 核殼結構的半導體量子點水溶液 中，加入6-馬來酰亞胺基乙酸N-琥珀酸亞胺酯(EMCS)或雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯鈉鹽(BS3)連接劑溶液，充分攪拌10-30min后，加入5’端巰基修飾后的核酸鏈，25-40°C溫度下孵育2.5h，得到混合液； 2)在上述混合液中加入NaCl的甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后，沉淀重懸于去離子水中； 3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入核黃素水溶液，25-40°C溫度下反應2-12h，得到孵育液； 4)在上述孵育液中加入濃度為2ul1X10 - 4mol/L的核酸鏈5’ ggtctccgtgacataaaagaaagacc3’ , 25-40°C溫度下反應2.5h,即可制得該量子點_核黃素分子信標。
3.根據權利要求2所述用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標的制備，其特征在于:所述半導體量子點水溶液的濃度為0.5-lOmmol/L，連接劑溶液的濃度為0.5-10mg/mL,核酸鏈溶液的濃度為0.1 X 10—4_1 X 10—4mol/L ;半導體量子點水溶液、連接劑溶液和核酸鏈溶液的體積比為3:1:0.0075。
4.根據權利要求2所述用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標的制備，其特征在于:所述核黃素水溶液的濃度為0.01-0.15mg/mL。
5.根據權利要求2所述用于端粒酶活性檢測的量子點-核黃素分子信標的制備，其特征在于:所述核黃素水溶液與半導體量子點水溶液的體積比為1:1。
【文檔編號】C12N15/11GK103497997SQ201310453815
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】應明, 劉靜, 沈林燕 申請人:天津理工大學