雞β-防御素AvBD6基因及其乳酸菌載體的構建方法
【專利摘要】本發明公開了雞β-防御素AvBD6基因，其序列如序列表所示。參照乳酸乳球菌密碼子的偏愛性進行密碼子優化處理，將稀有密碼子agg、cgg、tgc等優化為偏愛密碼子cgt、tgt，設計并合成后命名為Op-AvBD6。本發明還公開了雞β-防御素AvBD6基因乳酸菌載體的構建方法：對載體pNZ8148、Op-AvBD6進行雙酶切；回收酶切產物，經DNA?Ligation?Kit連接后電轉化到Lactococcus?lactis?NZ9000中；經氯霉素篩選、PCR鑒定，雙酶切鑒定后得到目的產物。本發明的有益效果在于，可明顯提高雛雞的平均日增重和免疫器官指數，維持雛雞腸道菌群結構的穩定。同時，在感染甲型副傷寒沙門氏菌后，可降低雛雞的死亡率。
【專利說明】雞后-防御素AvBD6基因及其乳酸菌載體的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種雞P -防御素AvBD6基因及其乳酸菌載體的構建方法。
【背景技術】
[0002]飼用抗生素一直以來廣泛應用于降低畜禽類發病率和維持畜禽健康。然而，長期使用抗生素會導致其在畜產品中殘留及產生細菌耐藥性，并通過食物鏈威脅人類健康。因此，迫切需要尋找一種全新類型的抗菌物質來控制畜禽疾病、改善畜禽產品品質，以保證畜禽業健康快速的發展。防御素(Defensin)是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，根據半胱氨酸殘基形成二硫鍵的分子結構不同，分為a -防御素、(6-防御素和0-防御素三大類[1’
2]。禽防御素屬于(6-防御素的一種，具有抗菌譜廣、抗菌機制特殊、無殘留等特點，已成為很有前景的新一代“綠色抗生素替代品” [3’4]。
[0003]雞AvBD6在雞的先天防御系統中起著重要的作用，并在體內很多組織器官中廣泛表達，其中在消化道上端、肝臟、膽囊和腎臟中的表達量較高，且具有廣譜的抗菌活性[5]。雞AvBD6已經在大腸桿菌和畢赤酵母中成功表達,雞AvBD6在大腸桿菌中表達的融合蛋白對多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和大腸桿菌均有抑菌活性[6]。而雞AvBD6在畢赤酵母GS115中表達的融合蛋白對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌均有抑菌活性[7]。雞AvBD6重組蛋白具有耐熱和耐酸堿的特性，因此，可以耐受飼料加工過程的高溫處理與適應畜禽消化道內的pH環境。
[0004]本發明嘗試應用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)進行表達，因為乳酸乳球菌是公認的安全級(generally regarded as safe,GRAS)微生物,對動物生長具有益生作用，可直接口服，而不需要進一步純化目標蛋白，可作為一種新型功能性微生態制劑，這將為微生態制劑的深層次開發作出有意義的探索。本發明采用乳酸菌表達系統中的NICE系統，是因為其是在乳酸菌中應用最廣、可控性強的高效誘導表達系統。在加入誘導物Nisin后其誘導效率可達1000倍以上[8]。有研究報道表明，防御素和益生菌能夠提高飼料轉化率、促進營養物質的吸收，維持腸道微生態平衡，促進機體免疫功能，從而防治家禽疾病，提高家禽生產性能。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題之一是提供一種雞(6-防御素AvBD6基因及其構建方法。
[0006]本發明是通過以下技術方案來實現的。
[0007]雞0 -防御素AvBD6基因，其序列如序列表所示。參照乳酸乳球菌密碼子的偏愛性進行密碼子優化處理，將稀有密碼子agg、Cgg、tgC等優化為偏愛密碼子cgt、tgt，設計并合成后命名為0p-AvBD6。
[0008]本發明要解決的技術問題之二是提供一種雞P -防御素AvBD6基因乳酸菌表達載體的構建方法。[0009]本發明中載體pNZ8148-0p_AvBD6的構建表達方法是:用限制性酶NcoI和XbaI分別對載體PNZ8148和0p-AvBD6進行雙酶切，回收酶切產物，經DNA Ligation Kit連接后電轉化到 Lactococcus lactis NZ9000 中，電轉化處理參數為 2.5kV、25 U F、200 Q、5ms。經氯霉素篩選、PCR鑒定，雙酶切鑒定后得到轉化子pNZ8148-0p-AvBD6，提質粒送生物公司測序，測序結果完全吻合。
[0010]對上述的乳酸菌表達載體進行誘導表達的方法是:將測序正確的陽性菌落接種于GMl7液體培養基中，待菌液OD6tltl值達到0.4~0.5時加入Nisin (終濃度為5ng/ml)，30°C誘導4h。誘導結束后離心收集菌體，將菌體用溶菌酶破碎后離心取上清液(含目的蛋白)。將pNZ8148空載體轉化至L.lactis NZ9000中，按同樣方法進行誘導表達，取4h后的誘導表達產物作為陰性對照。
[0011]重組AvBD6乳酸菌，其保藏號:CGMCC No7831 ;保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址:北京市朝陽區北辰路I號院3號；保藏日期:2013-06-27 ;分類命名:乳酸乳球菌；拉丁名:Lactococcus lactis。
[0012]本發明的有益效果:
[0013]1、本發明選用乳酸乳球菌NICE表達系統，首先，NICE系統是在乳酸菌中應用最廣、可控性強的高效誘導表達系統，在加入誘導物Nisin后其誘導效率可達1000倍以上。其次，乳酸乳球菌是公認的食品級微生物，對動物生長具有益生作用，可直接口服，而不需要進一步純化目標蛋白，使其應用于工業化生產成為可能。
[0014]2、本發明用乳酸菌的NICE系統表達了雞AvBD6在國際上屬于首次，且表達產物雞AvBD6具有良好的抑菌活性。
[0015]3、本發明根據乳酸菌的密碼子偏好性，對雞AvBD6基因進行了密碼子優化，優化后增加了目的蛋白在乳酸菌系統中的表達產量，使目的蛋白產量更高效和經濟。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明中陽性重組子pNZ8148-0p-AvBD6的菌落PCR鑒定核酸電泳圖；(其中 1、2:空表達載體 pNZ8148，3、4:pNZ8148-0p-AvBD6 陽性克隆，M:DL2000DNA maker ；)
[0017]圖2為本發明中陽性重組子pNZ8148-0p-AvBD6的雙酶切鑒定核酸電泳圖；(1:pNZ8148-0p-AvBD6 陽性克隆雙酶切，M:DL2000DNA maker ；)
[0018]圖3為本發明的AvBD6乳酸菌表達產物的Tricine-SDS-PAGE電泳圖；(I =Nisin誘導的陰性轉化子，2:Nisin誘導的陽性轉化子，M:蛋白Marker ；)
[0019]圖4為本發明的AvBD6乳酸菌表達產物對指示菌的抑菌試驗結果示意圖；(A):巴氏桿菌，B):大腸埃希氏菌(ATCC44102)，C):甲型副傷寒沙門氏菌(ATCC9150)，D):糞腸球菌(ATCC29212)，E):雞白痢沙門氏菌(S2)，0:PBS空白對照，1:抗生素陽性對照，2 =Nisin誘導的陰性轉化子，3 =Nisin誘導的陽性轉化子；)
[0020]圖5為本發明的AvBD6重組乳酸菌對雛雞平均日增重的影響的示意圖；
[0021]圖6為本發明的AvBD6重組乳酸菌對雛雞免疫器官指數的影響的示意圖；
[0022]圖7為本發明的AvBD6重組乳酸菌對雛雞回腸菌群結構的影響的示意圖；(1、3、5和I為未攻毒組；2、4、6和8為其攻毒組；M:DL2000DNA Marker)
[0023]圖8為本發明的AvBD6重組乳酸菌對雛雞盲腸菌群結構的影響，1、3、5和7為未攻毒組;2、4、6 和 8 為其攻毒組；M:DL2000DNA Marker ；
[0024]圖9為本發明所用的表達載體質粒pNZ8148的不意圖。
【具體實施方式】
[0025]下面根據附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0026]本發明所使用的主要材料
[0027]主要試劑與試劑盒:PremixTaq? Version2.0(Loading dye mix)、DNA LigationKit Ver.2.0、限制性內切酶 Nco1、Xbal、DL2000DNAMarker、DL500DNA Marker,4 X ProteinSDS PAGE Loading Buffer均購于TaKaRa公司；質粒小量提取純化試劑盒、膠回收試劑盒、葡萄糖、瓊脂粉、TBE緩沖液、溴酚藍等均購于上海生工生物工程技術服務有限公司；LB肉湯培養基、M17肉湯培養基購于海博生物技術有限公司；瓊脂糖、Tris堿購于Promega公司；Nisin, TEMED購于Sigma公司；氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、考馬斯亮藍G250、丙烯酰胺均購于 Solarbio 公司；Protein Marker Low range、甘油購于 BBI 公司。
[0028]實施案例1:
[0029]目的基因與引物的合成
[0030](I)目的基因的合成
[0031 ] 根據Genbank中發表的雞AvBD6cDNA編碼區序列(序列號NM_001001193 )和乳酸乳球菌密碼子的偏愛性，由大連寶生物公司人工合成序列0p-AvBD6，序列如下:CCATGGGTATGAGCCCTATTCATGCTTGTAGATATCAACGTGGTG TTTGTATTCCTGGTCCATGTCGTTGGCCATATTACCGTGTTGGAT CATGTGGTAGTGGACTTAAATCTTGTTGTGTTCGTAACCGTTGG GCT TAA TCTAGA (劃線為 NocI和XbaI酶切位點，雙劃線為終止密碼子)，并將其克隆至pMD19-T Simple載體上。
[0032]表1乳酸乳球菌的密碼子偏好性表
[0033]
【權利要求】
1.一種雞(6-防御素AvBD6基因，即Op-AvBD6，其特征在于，其基因序列如序列表所示。
2.根據權利要求1所述的雞(6-防御素AvBD6基因，其特征在于，所述雞(6-防御素AvBD6基因是將雞AvBD6基因的稀有密碼子agg、cgg、tgc等優化為偏愛密碼子cgt、tgt而成。
3.—種雞P -防御素AvBD6基因乳酸菌載體的構建方法，其特征在于，步驟包括: (1)對載體pNZ8148、Op-AvBD6進行雙酶切； (2)回收酶切產物,經DNALigation Kit連接后電轉化到Lactococcus lactis NZ9000中； (3)經氯霉素篩選、PCR鑒定，雙酶切鑒定后得到目的產物。
4.根據權利要求3所述的雞(6-防御素AvBD6基因乳酸菌載體的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中電轉化處理參數為2.5kV、25iiF、200Q、5ms。
5.根據權利要求3所述的雞(6-防御素AvBD6基因乳酸菌載體的構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中載體pNZ8148、0p-AvBD6是使用限制性酶NcoI和XbaI進行雙酶切的。
6.一種雞(6-防御素AvBD6基因乳酸菌載體的誘導表達方法，其特征在于，步驟包括: (1)將測序正確的陽性雞P-防御素AvBD6基因乳酸菌載體菌落接種于GM17液體培養基中； (2)待菌液OD600值達到0.4~0.5時加入Nisin，30°C誘導4h ； (3)離心收集菌體即誘導表達后的AvBD6重組乳酸菌，將菌體用溶菌酶破碎后離心取上清液；
7.根據權利要求6所述的雞(6-防御素AvBD6基因乳酸菌載體的誘導表達方法，其特征在于，其使用方法為:所述誘導表達后的AvBD6重組乳酸菌的菌液濃度調節至5X 108CFU/mL，在第一周按1:50的比例加入雛雞的飲水中，從第二周開始按1:25的比例加入雛雞的飲水中。
【文檔編號】C12R1/46GK103614381SQ201310489097
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】祁克宗, 汪雪雁, 段慧, 周秀紅, 彭開松, 涂健, 劉紅梅, 陳玎玎, 張明, 付瑞燕, 薛秀恒 申請人:安徽農業大學