引物及其該引物用于制備比格犬抗菌肽β-防御素重組蛋白CBD127的方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體來說是一種引物及其該引物用于制備比格犬抗菌肽β-防御素重組蛋白CBD127的方法；該引物序列如下：上游引物：5’-ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’，下游引物：5’-TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’；制備方法包括：（1）比格犬β防御素基因CBD127的克隆及測序；（2）表達載體的構建與鑒定；（3）重組蛋白的融合表達；（4）重組蛋白的鑒定；（5）表達產物的可溶性分析；（6）融合蛋白的純化；（7）比格犬重組蛋白的生物學活性檢測。本發明操作難度小，可控性強，成本低，為防御素的免疫學研究及工業批量生產奠定了基礎。
【專利說明】引物及其該引物用于制備比格犬抗菌肽β-防御素重組蛋
白CBD127的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體來說是一種引物及其該引物用于制備比格犬抗菌肽β -防御素重組蛋白CBD127的方法。
【背景技術】
[0002]防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子活性肽，廣泛分布于動物、植物和昆蟲體內。由于其具有廣譜的抗微生物活性，因此被命名為“防御素”(defensins)。體外抑菌試驗表明，防御素能對革蘭氏陽性和陰性細菌、真菌、分枝桿菌、螺旋體、披膜病毒等病原微生物產生較強的殺傷作用，構成宿主抵抗外來病原菌感染的第一道防線。
[0003]比格犬是國際上公認的通用實驗犬，因其體型小、性情溫順、均質性好、易保定、遺傳性能穩定、生理生化指標穩定及實驗重復性好等優點，被廣泛應用于醫藥衛生科研和軍事醫學領域，是理想的實驗動物模型。開展對其β_防御素的實驗基礎性研究，對將來的臨床應用提供理論依據。更加預示了其有著廣闊的應用前景。
[0004]防御素依據其半胱氨酸空間排布及二硫鍵大小和形成方式的不同，可分為哺乳動物防御素、昆蟲防御素和植物防御素3種類型。哺乳動物防御素又分為α-、β_、Θ-防御素3種類型。β_防御素最早從牛氣管粘膜上皮中分離得到，廣泛分布于人、鼠、牛、羊、豬的多種器官上皮細胞內。目前，在脊椎動物、無脊椎動物和植物中發現的防御素已超過500多種，Patil等報道了犬染色體基因組編碼了 42種β-防御素基因及其擬基因。目前，關于犬β_防御素的基因克隆在國內報道較少，靳慧君等報道了從健康西施犬睪丸組織中擴增出防御素基因，其基因在NCBI上檢索名稱為DEFB3L (cBD3)，并構建了真核表達載體，證實了其能在HEK293T細胞中得到表達。國外Sang等報道在犬的睪丸組織內克隆到了犬β -防御素基因CBD1，并通過化學合成小肽的方法證實了其對革蘭氏陽性、陰性菌有抑菌作用，對支原體也有抑制作用。
[0005]隨著耐藥菌的出現，內源性的抗微生物肽越來越受到重視。防御素(β-defensin)作為抗菌肽的一種，借助其獨特的生物學特性，極易被腸道吸收，也因其特殊的抗菌機制，不會誘導產生耐藥性微生物。另一方面，動物食品安全越來越受到重視，使用無污染、無殘留、無毒副作用的添加劑是解決該問題的關鍵。防御素是動物體成分之一，參與生命過程，是小分子短肽，具有安全無毒副作用的生物學特征。用基因工程方法生產環保型β -防御素飼料添加劑，或通過日糧添加，對畜牧業生產具有極為重要的現實意義。
[0006]大腸桿菌表達系統是基因表達技術中發展最早、目前掌握最為成熟的原核表達系統。該項技術主要是將已克隆入外源基因的載體轉化到細菌中，通過誘導表達、純化獲得所需的目的蛋白。其優點是能夠在較短時間內獲得基因表達產物，且所需的成本相對較低。與其他表達系統相比，大腸桿菌還具有遺傳背景清楚，表達周期短、操作簡便和使用安全等特點，成為外源基因表達的首選系統。
[0007]天然獲取犬β -防御素的量極其有限，從機體中提取的步驟繁瑣、成本高，β -防御素主要通過化學合成和基因工程方法獲取。化學合成法可以方便地在合成過程中改變多肽的一級結構，但化學合成法的成本昂貴，同時也難以保證分子中三對二硫鍵的正確配對，從而影響其生物活性，嚴重影響了防御素的研究和應用。基因工程法是獲得大量、廉價防御素的最佳途徑。所以基因工程方法已經成為獲取β-防御素的主要方法。基因融合表達載體的應用是目前加強防御素穩定表達的較好手段。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種引物及其該引物用于制備比格犬抗菌肽β_防御素重組蛋白CBD127的方法。
[0009]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:一種引物，該引物序列如下:
[0010]SEQIDN0:15 ’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3，
[0011]SEQIDN0:25 ’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3，
[0012]本發 明的另一目的是提供一種制備比格犬抗菌肽β_防御素重組蛋白CBD127的方法，包括如下步驟:
[0013](I)比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及測序；
[0014](2)表達載體的構建與鑒定；
[0015](3)重組蛋白的融合表達；
[0016](4)重組蛋白的鑒定；
[0017](5)表達產物的可溶性分析；
[0018](6)融合蛋白的純化；
[0019](7)比格犬重組蛋白的生物學活性檢測。
[0020]進一步的，所述步驟(1)比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及測序包括如下步驟:
[0021]①從比格犬睪丸組織中提取總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA ；
[0022]②設計引物及PCR反應，利用Primer5.0軟件設計引物:
[0023]SEQIDN0:15 ’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3，
[0024]SEQIDN0:25’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’
[0025]用cDNA為模板進行梯度PCR操作擴增比格犬抗菌肽β -防御素重組蛋白CBD127基因序列，PCR反應體系為30 μ L體系，反應條件為95°C預變性5min，94°C變性40s，55 °C退火30s，72°C延伸90s，共30個循環，而后72°C延伸8min ；
[0026]③、PCR產物的回收和純化；
[0027]④、克隆；
[0028]⑤、測序鑒定。
[0029]進一步的，所述比格犬β -防御素基因CBD127的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
[0030]進一步的，所述比格犬β -防御素基因CBD127編碼的蛋白序列如SEQIDNO:7所
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[0031]本發明的有益技術效果是:本發明運用分子生物學技術，從比格犬睪丸組織內克隆到犬β -御素基因CBD127，選用合適的表達宿主在體外表達犬β -御素基因CBD127蛋白，在國內外第一次通過實驗證實了 CBD127融合蛋白的具有廣譜的抗菌活性。體外抑菌試驗表明，其對金黃色葡萄球菌(圖1)、大腸桿菌(圖2)、糞腸球菌(圖3)、酵母菌(GS115)(圖4)都有一定程度的抑制作用。
[0032]本發明操作難度小，可控性強，成本低，為防御素的免疫學研究及工業批量生產奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0034]圖1是pGEX-6p-l_CBD127對金色葡萄球菌的抑菌效果，注:1:陰性對照；2~3:重組蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0035]圖2是pGEX-6p-l-CBD127對大腸桿菌的抑菌效果，注:1:陰性對照；2、4:重組蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；3:空載體 pGEX_6p_l ；
[0036]圖3是pGEX-6p-l_CBD127對糞腸球菌的抑菌效果，注:1:陰性對照；2~4:重組蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0037]圖4是pGEX-6p-l-CBD127對酵母菌(GS115)的抑菌效果，注:1:陰性對照；2~3:重組蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0038]圖5是比格犬β -防御素CBD127的PCR擴增圖，注:M: NDA2000分子Marker ；1:CBD127基因；2:陰性對照；
[0039]圖6 是重組質粒 pGEX-6p-l-CBD127 酶切圖；注:M:NDA5000 分子 Marker ；1:酶切后的 PGEX-6p-l-CBD127 ；
[0040]圖7是CBD127蛋白誘導表達的SDS-PAGE分析，注:1:未誘導的重組載體；2_5:分別為2h、4h、6h、8h誘導的重組蛋白pGEX-6p-l-CBD127 ；6:pGEX-6p-l空載體；M:蛋白質相對分子質量標準；
[0041]圖8是融合蛋白的Western-Blot結果，注:M:蛋白分子質量標準；1:融合蛋白pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0042]圖9是CBD127蛋白存在形式的SDS-PAGE分析，注:1:包涵體蛋白；2:上清蛋白；M:蛋白分子質量標準；3:GST標簽蛋白；
[0043]圖10是蛋白純化后SDS-PAGG分析，注:M:蛋白分子量標準；1-2:純化后蛋白pGEX-6p-l-CBD127。
【具體實施方式】
[0044]下面結合實施實例對本發明作進一步說明:
[0045]實施實例一
[0046](1)、比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及測序
[0047]哺乳動物抗菌肽在動物機體固有免疫中發揮著重要作用。本發明根據Genbank已發表的犬β -防御素基因核苷酸序列(登錄號:DQ011996.1),利用Primer5.0軟件設計引物:SEQIDNO:15，-ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3，，SEQIDNO:25，-TTATGTAGAATTTGTCTTG-3，，從比格犬睪丸組織中擴增出CBD127基因，片段大小為303bp(SEQIDNO:3圖5)。(液氮中取出睪丸組織，置于研磨器中研磨，然后分別裝于50mL瓶內，-80°C保存。按TRIzoI試劑說明書提取各組織樣本的總RNA。采用cDNA反轉錄試劑鼠源反轉錄酶M-MLV，按說明反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板按以下程序進行PCR擴增:94°C預變性5min ;94°C變性40s，55°C退火30s，72°C延伸90s，30個循環；72°C終延伸8min。結束后，PCR產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查結果，并用膠回收試劑盒回收純化PCR產物。)并克隆至PMD19-T載體上，構建CBD127模板質粒pMD19-T-CBD127，經序列測定其基因序列如SEQIDNO:4 (劃線黑色部分為目的基因，加粗字體為引物，黑色斜體分別為起始密碼子和終止密碼子)。
[0048]CGCGTACGACGGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATT ATGkkQC
TCATCCTGATCAT TGCAATCCTGCTGTTCCAGAAGTCCAAAGTAACTGAACAACTTAAGAGATGCTGGGGTGAA
TATATACGAGGATATTGCAGGAAAATATGCAGAATAAGTGAAATACGTGAAGTACTCTGTGAAAATGGGAGATATTG
TTGCCTCAACATCGTGGAATTGGAAGCACGTAGAAAAATTACAAAGCCACCTCCTCCAGAGCCAAGGACATATGCAA
Τ6Α0ΤΤΤ000Τ0ΑΑ6ΑΤ6ΑΤ6ΑΤΑΤΑΑΤΤ6ΤΑ6ΑΑΑΑΤΤΑΤΤ0ΜTτΑΤ00ΑΑTι7\0ΑΑΑΤΤ0ΤΑ0Α7^ ^AAT
CGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT
[0049]比格犬β -防御素基因CBD127的核苷酸序列通過同源比發現和其他哺乳動物的β -防御素基因CBD127具有很高的一致性性，翻譯的蛋白氨基酸序列一致性超過99%，蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。
[0050](2)、表達載體的構建與鑒定
[0051 ] 在上下游引物5 ’分別添加EcoRI和XhoI酶切位點(SEQIDNO: 55 ’ -CGGAATTCATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’，SEQIDNO:65’ -CGCTCGAGTTATGTAGAATTTGTCTTG-3’)，以PMD19-T-CBD127為模板，擴增CBD127基因，回收擴增PCR產物割膠純化，將純化產物和空載體pGEX-6p-l分別用EcoRI和XhoI雙酶切，回收純化酶切產物，經T4連接酶連接轉化克隆感受態細胞DH5 α，涂布平板挑取單菌落與液體LB (Amp+)中搖菌，抽提質粒，將重組質粒進行雙酶切鑒定(圖6)，將酶切鑒定為陽性菌液送往北京華大基因測序，測序準確后，并將其命名為 pGEX-6p-l-CBD127。
[0052](3)、重組蛋白的融合表達
[0053]將測序正確的重組質粒PGEX-6P-1-CBD127轉化到E.coli BL21 (DE3)(商購)中。挑單菌落接種于LB液體培養基中(含50 μ g/ml氨芐霉素)，37 °C過夜培養。次日按I %接種于50ml LB液體培養基中(含50 μ g/ml氨芐霉素)，37°C振蕩培養至0D600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.6mM, 37°C，200rpm振蕩培養，分別于誘導后2、4、6、8小時各取菌液5mL，離心保留菌體。最后用SDS-PAGE電泳檢測誘導表達情況。重組蛋白帶有GST標簽，大小約為26KD。SDS-PAGE電泳可見，誘導后有大小相符的蛋白產生，在2h就有蛋白表達。由圖所示，融合蛋白在8h表達量較大(圖7)。
[0054](4)、重組蛋白的鑒定
[0055]SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，利用目的蛋白上的GST標簽，，用抗GST鼠單克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗鼠多克隆抗體為酶標二抗，進行Western Blot分析(圖8)。從圖中可觀察到只有在表達產物條帶大小(36KD))的位置處可見目的條帶。[0056](5)、表達產物的可溶性分析
[0057]取500ml誘導6_8小時的菌液離心收集菌體，按10: I比例重懸于PBS中，超聲破碎(300-400W，超聲3s，間隔5s，工作15分鐘)，然后12000rpm離心10分鐘，分別保留上清和沉淀，用SDS-PAGE電泳檢測分析目的蛋白是否為可溶性蛋白。在菌體超聲破碎上清檢測到少量蛋白，目的蛋白大多以包涵體的形式存在(圖9)。
[0058](6)、融合蛋白的純化
[0059]1000mL上述誘導表達的菌液，離心收集菌體后，用STE洗滌菌體，加入20mL菌體裂解液重懸菌體，4°C作用30min，使溶菌酶充分裂解細菌細胞壁，可以觀察到菌液變得十分粘稠，呈絲狀。超聲破碎直至菌液不再粘稠，12000rpm離心30min,用Novagen公司ProteinRefolding Kit蛋白純化試劑盒處理包涵體后進行透析，獲得具有生物學活性的蛋白。然后利用帶GST凝膠的柱子(上海生工)進行純化回收目的蛋白。純化后結果如圖10所示。[0060](7)、比格犬重組蛋白的生物學活性檢測
[0061]用超濾濃縮管將CBD127融合蛋白進行濃縮，用BCA法測定蛋白濃度。
[0062]CBD127融合蛋白的活性檢測用薄層平皿瓊脂糖孔穴擴散法測定。分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌分別接種于5mL無氨芐抗性LB液體培養基，37 °C搖床培養過夜。酵母菌(GS115)接種于5mL無抗YH)液體培養基中，30°C搖床培養過夜。分別取0.5mL上述培養液接種于新鮮的5mL無氨芐抗性LB和YPD培養基中，分別與37°C、30°C搖床培養至對數生長中期。取200 μ L此細菌培養液，涂于無氨芐抗性LB和YH)瓊脂平板，放置片刻。待菌液稍干后，用直徑為6_的滅菌打孔器打孔若干個，分別在孔中加入100 μ L PBS作對照，100 μ L此重組蛋白。將平板正面向上37°C培養2h后，倒置繼續培養18h (酵母菌培養40h)，觀察抑菌效果。
[0063]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本實用新型的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.引物，其特征是，該引物序列如下:
SEQIDNO:15’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’
SEQIDN0:25’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’
2.一種制備比格犬抗菌肽β_防御素重組蛋白CBD127的方法，其特征是，包括如下步驟: (1)比格犬β-防御素基因CBD127的克隆及測序； (2)表達載體的構建與鑒定； (3)重組蛋白的融合表達； (4)重組蛋白的鑒定； (5)表達產物的可溶性分析； (6)融合蛋白的純化； (7)比格犬重組蛋白的生物學活性檢測。
3.根據權利要求2所述制備比格犬抗菌肽β-防御素重組蛋白CBD127的方法，其特征是，所述步驟(1)比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及測序包括如下步驟: ①從比格犬睪丸組織中提取總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA； ②設計引物及PCR反應，利用Primer5.0軟件設計引物:
SEQIDN0:15’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’
SEQIDN0:15’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’ 用cDNA為模板進行梯度PCR操作擴增比格犬抗菌肽β-防御素重組蛋白CBD127基因序列，PCR反應體系為30 μ L體系，反應條件為95°C預變性5min，94°C變性40s，55 °C退火30s，72。。延伸90s，共30個循環，而后72°C延伸8min ； ③、PCR產物的回收和純化； ④、克隆； ⑤、測序鑒定。
4.根據權利要求3所述制備比格犬抗菌肽β-防御素重組蛋白CBD127的方法，其特征是，所述比格犬β -防御素基因CBD127的核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。
5.根據權利要求3所述制備比格犬抗菌肽β-防御素重組蛋白CBD127的方法，其特征是，所述比格犬β -防御素基因CBD127編碼的蛋白序列如SEQIDN0:7所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540669SQ201310500692
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】尹燕博, 馮培祥, 潘福星 申請人:青島農業大學