一種溶解藻類的溶藻細菌lr5原生質體制備與再生的方法
【專利摘要】本發明一種溶解藻類的溶藻細菌LR5原生質體制備與再生的方法，牽涉到生物細胞工程里的制備原生質體與原生質體再生的【技術領域】。采用此次發明的制備與再生原生質體技術，操作簡便，實驗環境要求不高，可進行重復實驗；在本次實驗中所得到的最佳實驗條件下的溶藻細菌LR5原生質體形成率是72.41%，并且再生率達到了最大值51.19%，溶藻細菌LR5原生質體形成效果一般但溶藻細菌LR5原生質體恢復細胞壁能力即再生能力較強，這為后續的溶藻細菌原生質體融合以及轉化溶藻細菌構成高效溶藻功能菌做了很好的鋪墊。
【專利說明】一種溶解藻類的溶藻細菌LR5原生質體制備與再生的方法
【技術領域】
[0001]此次發明牽涉到生物細胞工程里的制備原生質體與原生質體再生的【技術領域】。特別的是溶解藻類的溶藻細菌LR5原生質體制備與再生。
【背景技術】
[0002]近年來，我國頻繁暴發藍藻水華災害，給我國帶來了嚴重的物力與財力損失。藍藻水華是由富營養化水體蔓延造成的。藍藻水華災害使大量的藍藻覆蓋在水體表面，嚴重阻礙了水體的流動，水體的自凈能力降低，復氧率減小，透明度下降，水質惡臭，水體內的魚、蝦等浮游生物因生活環境發生惡化而死亡。現如今，我國控制水體中的藍藻生物量依然采用傳統的機械打撈，此法雖能夠快速遏制小面積的藍藻生長，但此法耗時耗力且只能去除小部分的藍藻，大部分的藍藻在水體內因腐爛而消失，而藍藻危害并沒有隨著其消失而減弱，腐爛的藍藻細胞破碎后就會向水體釋放各種藻類毒素。所以，要找到一個可以快速、有效、安全的控制藍藻的方法去替代傳統的機械打撈。而構建具有溶藻功能的高效工程菌來控制藍藻就成為一個新的研究前景。
[0003]使用原生質體的轉化技術進行選育微生物研究中的融合重組原生質體可以同時表達兩親本菌株的優良性狀，也可使隱性基因因重組而暴露表達或隨機產生新的基因表達出新的性狀，從而成為微生物育種的一種途徑。原生質體的制備與再生是為了應用原生質體融合技術而做的鋪墊，從而以便后續構建高效溶藻菌株用以處理藍藻滋生的富營養化水體。關于原生質體的制備與再生的研究已經有報道。《西北大學學報》2002年第32卷第4期393-397頁報道了郭愛蓮等以木質素降解菌LI為目標菌株，通過原生質體制備與再生技術獲得高效木質素降解菌。《福建師范大學學報》2011年第27卷第4期122-124頁報道了葉濤等利用原生質體制備再生技術獲得再生能力高的雨生紅球藻菌種，對提高紅球藻產量具有較大應用價值。
[0004]使用微生物控制藍藻生長是一個高效安全的方法。國內外已有大量學者已篩選出多種溶藻菌，但現主要針對溶藻菌的溶藻機理、溶藻方式等進行研究。制備溶藻菌LR5原生質體且得到再生能力高的溶藻菌LR5原生質體，這就要求得到真實有效的溶藻菌LR5原生質體形成環境，從而為后續構建高效溶藻功能菌做好鋪墊。利用原生質體育種技術提高溶藻菌處理藍藻效率以及制備高效溶藻菌劑上的應用，國內外鮮有報道。
[0005]通過分離篩選獲得溶藻細菌LR5，其對藍藻的處理效果一般。為得到高效溶藻功能菌，有效治理藍藻水華帶來的富營養化水體污染問題，可從以下思路出發:得到再生能力高的溶藻細菌LR5原生質體形成條件，從而構建高效溶藻轉基因工程菌。本方法以原生質體育種技術構建工程菌為基礎，主要研究實驗室已分離的溶藻功能菌LR5的原生質體制備與再生，該菌是本實驗室從泥鰍中篩選出的I株具有溶藻功能的細菌。鑒于親本LR5菌株的抗性標記工作量大，天然抗性難以確定，抗性突變亦可能使優良性狀發生不定向改變，為確保親本LR5菌株保持其各自的優良生物學特性，本研究選用滅活原生質體融合法，既減少了工作量，又保證了后續研究中融合子的質量。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種溶藻細菌LR5原生質體制備與再生的方法，使得得到較高制備率與再生率的溶藻細菌LR5原生質體。
[0007]本發明所采用的技術方案如下:
一種處理藍藻的LR5溶藻細菌的原生質體制備與再生方法，按照下述步驟進行:
(1)溶藻細菌LR5菌種活化培養:
溶藻細菌菌種活化即為挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，其目的是溶藻細菌可以與呈液體的培養基充分碰觸，以期望散開溶藻細菌菌落可以生長均勻。在實驗中，取4 mL液體培養基，挑取一環菌進入液體培養基中，放于立式恒溫振蕩器(設置130 r/min, 300C )培養到溶藻細菌LR5的對數期，約為1O8-1O9個/ml ；
(2)酶解去除溶藻細菌LR5細胞壁:
提取4 ml的活化后溶藻細菌LR5置于臺式離心機中，設置離心轉速4000 r/min，離心時間是10分鐘(實際設置時間10.30分鐘)，其目的是收集溶藻細菌LR5，使用SMM緩沖液洗滌2至3次，使用1.60至1.95 mlSMM緩沖液將菌液混勻；添加0.05至1.00 mg/mL的溶菌酶0.05至0.40 ml和2 ml的質量濃度為0.4至1.2 g/L的EDTA溶液，設置水浴溫度30至50°C條件下酶解15至75 min ;待到酶解結束后，再使用臺式離心機(設置離心轉速4500r/min，離心時間是15分鐘)離心收集剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體，用32.14 g/L的高滲NaCl溶液洗滌菌體2至3次，將溶菌酶酶液去除后再用4 ml的32.14 g/L高滲NaCl溶液重懸。此即為制得的溶藻細菌LR5原生質體；
(3)溶藻細菌LR5原生質體再生:
提取高滲NaCl溶液重懸的溶藻細菌LR5原生質體懸浮液，用32.14 g/L質量濃度的NaCl溶液稀釋到合適的兩個梯度，分別吸取200 μ I菌體稀釋液涂布于高滲固體培養基，其中每個梯度做兩個平行樣，放置于30°C恒溫培養箱培養24至48 h，使得溶藻細菌LR5原生質體恢復其細胞壁，此即為溶藻細菌LR5原生質體再生。
[0008]本實驗所研究的菌種即溶藻菌LR5 {Pseudomonas aerwgifliosa)是從太湖水中的泥鰍體內篩選出的I株溶解藍藻的細菌，由鑒定得出類別是銅綠假單胞菌。此菌種已經于2013年4月26日由位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏號為CGMCC N0.7517。
[0009]上述的步驟(1)中所述的溶藻細菌LR5菌種活化操作中培養用的培養基成分展示如下:(I)普通細菌培養液:IL蒸餾水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g;其中要求調節PH為7.0至7.2 ; (2)普通細菌培養基:IL蒸餾水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、瓊脂20至24 g、氯化鈉5 g ;其中要求調節pH為7.0至7.2 ;此上所述的培養基據實驗滅菌要求在高壓滅菌鍋中在121°C滅菌溫度下持續滅菌20 min。
[0010]上述的步驟(3)中所述的溶藻細菌LR5原生質體恢復細胞壁，即為原生質體再生使用用的高滲固體培養基成分展示如下:800 mL蒸餾水中添加蛋白胨10 g、酵母浸出汁5g，、牛肉膏5 g、瓊脂20至24 g、蔗糖170 g(0.5 mol/L);其中要求調節pH為7.0至7.2 ;此上所述的培養基根據要求在高壓滅菌鍋中在121°C滅菌溫度下持續滅菌20 min。
[0011]上述的配制溶液成分如下:(1)高滲氯化鈉溶液:1 L蒸餾水中添加氯化鈉32.14go (2) SMM緩沖液:800 mL蒸餾水中添加蔗糖188.26 g、順丁烯二酸2.3214 g、六水合氯化鎂4.066 g;其中要求調節pH 6.8。(3) EDTA溶液:1 L SMM緩沖液中添加EDTA 0.6至1.2 g。(4)溶菌酶:1 mL SMM緩沖液中添加0.1 mg。上述配制的溶液根據實驗要求要在高壓滅菌鍋中在121°C滅菌溫度下持續滅菌20 min。
[0012]制備與再生溶藻細菌LR5原生質體方法優化條件:溶藻菌株培養28小時，將氯化鈉作為滲透壓穩定劑，采用0.75 mg/mL溶菌酶、2 mL的1.0 g/L EDTA和1.6 mL的SMM在40°C酶解30 min,就可得到最優的溶藻細菌LR5原生質體制備率與再生率，有利于后續操作中制備與再生融合子以及構建高效溶藻功能菌。 [0013]本發明的有益效果:
采用此次發明的制備與再生原生質體技術，操作簡便，實驗環境要求不高，可進行重復實驗；在本次實驗中所得到的最佳實驗條件下的溶藻細菌LR5原生質體形成率是72.41%，并且再生率達到了最大值51.19%，溶藻細菌LR5原生質體形成效果一般但溶藻細菌LR5原生質體恢復細胞壁能力即再生能力較強，這為后續的溶藻細菌原生質體融合以及轉化溶藻細菌構成高效溶藻功能菌做了很好的鋪墊。
【具體實施方式】
[0014]一株溶解藍藻的溶藻細菌LR5原生質體制備和再生方法創造了有利于制備溶藻細菌LR5原生質體以及提高溶藻細菌LR5原生質體能力的環境條件的方法。
[0015]以下提供本發明利用上述方法的5個實施例:
在本次發明的5個實例中都會涉及溶藻細菌LR5原生質體制備率和溶藻細菌LR5原生質體再生率的計算，現展示如下:
(I)藻細細菌LR5原生質體的制備率的計算方法
將溶菌酶酶液溶壁處理前的細胞和與溶菌酶酶液溶壁后的溶藻細菌LR5原生質體懸液均用蒸餾水稀釋，放置約10 min，使剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體吸水脹破，再分別吸取100 μ I菌體稀釋液涂布在普通細菌固體培養基平板上，每個稀釋梯度做兩個平行，置于30°C恒溫培養箱里倒置培養24至48 h，分別計錄普通細菌固體培養基平板上生長的菌落數A和B，根據下述公式計算溶藻細菌LR5原生質體制備率，從而測定溶藻細菌LR5原生質體的制備效果。
[0016]即:溶藻細菌LR5原生質體制備率(%) = (A_B)/AX 100%
A—酶解前溶藻細菌菌體個數
B—酶解后，溶藻細菌原生質體經蒸餾水漲破后的溶藻細菌個數上面公式表明:A是實驗前液體細菌培養基中生長的溶藻細菌個數，B是未被原生質體化的溶藻細菌的個數，所以(A-B)就是制備出的溶藻細菌原生質體的個數。所以，溶藻細菌原生質體制備率就可以輕易得出。
[0017](2)溶藻細菌LR5原生質體的再生率的計算方法
提取制備出的溶藻細菌LR5原生質體重懸液，使用高滲氯化鈉溶液稀釋到適宜的兩個梯度濃度，分別吸取200 μ I的溶藻細菌LR5原生質體高滲液涂布在固體高滲培養基平板上，其中每個梯度做兩個平行，放置于30°C恒溫培養箱培養24至48 h，計錄固體高滲培養基平板上的溶藻細菌LR5原生質體再生菌落數C，根據下述公式計算溶藻細菌LR5原生質體原生質體再生率，從而測定溶藻細菌LR5原生質體的恢復細胞壁效果即再生效果。
[0018]溶藻細菌LR5原生質體再生率(%) = (C-B)/(A-B) X 100%
式中:A——總菌數，即沒有經過酶解處理溶藻細菌懸浮液涂布于平板生長的菌體數量。
[0019]B—酶解后，溶藻細菌原生質體經蒸餾水漲破后的溶藻細菌個數。
[0020]C—涂布在高滲培養基上生長出的溶藻細菌個數。即為穩定劑內(含溶藻細菌原生質體)涂布在高滲培養基生長出的溶藻細菌個數。
[0021]上面公式表明:A代表是細菌培養基(液體)中生長的溶藻細菌個數。B代表是未原生質體化的溶藻細菌的個數。C代表是所有在高滲培養基上生長的溶藻細菌個數，其中高滲培養基上不但有恢復細胞壁的溶藻細菌，而且還有酶解反應不完全而未原生質體化的溶藻細菌。所以，(A-B)指的是制備出的溶藻細菌原生質體的個數，(C-B)指的是新生的溶藻細菌個數，如此以來溶藻細菌原生質體再生率就可以得出。
[0022]實施例1
將置于冰箱中保藏的溶藻細菌菌株LR5在斜面上“S，，形劃線重新轉接，挑取斜面上的單一溶藻細菌LR5菌落接到滅菌后的的普通細菌培養液里，放置于振蕩培養箱(設置培養溫度為30°C，設置培養轉速130 r/min)中進行培養到對數前期(約持續培養16 h)，其中菌液密度約為IO8-1O9個/ml。使用移液槍取4 ml活化后溶藻細菌LR5菌液，使用臺式離心機(設置離心轉速3000 r/mi n、離心時間10 min)來收集溶藻細菌LR5菌體，用SMM緩沖溶液洗滌2次，用1.2ml的SMM緩沖液重懸；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加熱至酶解溫度且質量濃度為0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴鍋(設置鍋內溫度40°C)條件下酶解30 min ;等到酶解結束后，再使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來離心收集剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗滌2次，最后用4 ml 32.14 g/L高滲氯化鈉溶液懸浮利用，此上過程所獲得的溶藻細菌LR5原生質體形成率為98.00%，再生率為11.99%。
[0023]實施例2
將置于冰箱中保藏的溶藻細菌菌株LR5在斜面上“S，，形劃線重新轉接，挑取斜面上的單一溶藻細菌LR5菌落接到滅菌后的的普通細菌培養液里，放置于振蕩培養箱(設置培養溫度為30°C，設置培養轉速130 r/min)中進行培養到對數后期(約持續培養28 h)，其中菌液密度約為IO8-1O9個/ml。使用移液槍取4 ml活化后溶藻細菌LR5菌液，使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來收集溶藻細菌LR5菌體，用SMM緩沖溶液洗滌2次，用1.2ml的SMM緩沖液重懸；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加熱至酶解溫度且質量濃度為0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴鍋(設置鍋內溫度40°C)條件下酶解30 min ;等到酶解結束后，再使用臺式離心機(設置離心轉速4500 r/min、離心時間15 min)來離心收集剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗滌2次，最后用4 ml 32.14 g/L高滲氯化鈉溶液懸浮利用，此上過程所獲得的溶藻細菌LR5原生質體形成率為78.33%，再生率為33.51%。
[0024]實施例3
將置于冰箱中保藏的溶藻細菌菌株LR5在斜面上“S，，形劃線重新轉接，挑取斜面上的單一溶藻細菌LR5菌落接到滅菌后的的普通細菌培養液里，放置于振蕩培養箱(設置培養溫度為30°C，設置培養轉速130 r/min)中進行培養到對數后期(約持續培養28 h)，其中菌液密度約為IO8-1O9個/ml。使用移液槍取4 ml活化后溶藻細菌LR5菌液，使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來收集溶藻細菌LR5菌體，用SMM緩沖溶液洗滌2次，用1.2ml的SMM緩沖液重懸；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加熱至酶解溫度且質量濃度為0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴鍋(設置鍋內溫度40°C)條件下酶解30 min ;等到酶解結束后，再使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來離心收集剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗滌2次，最后用4 ml 32.14 g/L高滲氯化鈉溶液懸浮利用，此上過程所獲得的溶藻細菌LR5原生質體形成率為80.00%，再生率為26.41%。
[0025]實施例4
將置于冰箱中保藏的溶藻細菌菌株LR5在斜面上“S，，形劃線重新轉接，挑取斜面上的單一溶藻細菌LR5菌落接到滅菌后的的普通細菌培養液里，放置于振蕩培養箱(設置培養溫度為30°C，設置培養轉速130 r/min)中進行培養到對數后期(約持續培養28 h)，其中菌液密度約為IO8-1O9個/ml。使用移液槍取4 ml活化后溶藻細菌LR5菌液，使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來收集溶藻細菌LR5菌體，用SMM緩沖溶液洗滌2次，用1.2ml的SMM緩沖液重懸；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加熱至酶解溫度且質量濃度為0.8 g/L的EDTA溶液，在水浴鍋(設置鍋內溫度40°C)條件下酶解30 min ;等到酶解結束后，再使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來離心收集剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗滌2次，最后用4 ml 32.14 g/L高滲氯化鈉溶液懸浮利用，此上過程所獲得的溶藻細菌LR5原生質體形成率為77.92%，再生率`為35.83%。
[0026]實施例5
將置于冰箱中保藏的溶藻細菌菌株LR5在斜面上“S，，形劃線重新轉接，挑取斜面上的單一溶藻細菌LR5菌落接到滅菌后的的普通細菌培養液里，放置于振蕩培養箱(設置培養溫度為30°C，設置培養轉速130 r/min)中進行培養到對數后期(約持續培養28 h)，其中菌液密度約為IO8-1O9個/ml。使用移液槍取4 ml活化后溶藻細菌LR5菌液，使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來收集溶藻細菌LR5菌體，用SMM緩沖溶液洗滌2次，用1.2ml的SMM緩沖液重懸；加入0.75 mg/mL的溶菌酶酶液(即加入10.00 mg/mL的溶菌酶酶液0.3 ml)和2 ml加熱至酶解溫度且質量濃度為1.0 g/L的EDTA溶液，在水浴鍋(設置鍋內溫度40°C)條件下酶解30 min ;等到酶解結束后，再使用臺式離心機(設置離心轉速4000 r/min、離心時間15 min)來離心收集剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體，使用32.14 g/L的NaCl溶液洗滌2次，最后用4 ml 32.14 g/L高滲氯化鈉溶液懸浮利用，此上過程所獲得的溶藻細菌LR5原生質體形成率為72.41%，再生率為51.19%。
【權利要求】
1.一種處理藍藻的LR5溶藻細菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于按照下述步驟進行: (1)溶藻細菌LR5菌種活化培養: 溶藻細菌菌種活化即為挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，取4 mL液體培養基，挑取一環菌進入液體培養基中，放于立式恒溫振蕩器，130 r/min, 30°C培養到溶藻細菌LR5的對數期，IO8-1O9個/ml ； (2)酶解去除溶藻細菌LR5細胞壁: 提取4 ml的活化后溶藻細菌LR5置于臺式離心機中，設置離心轉速4000 r/min，離心時間是10分鐘，使用SMM緩沖液洗滌2至3次，使用1.60至1.95 mlSMM緩沖液將菌液混勻；添加0.05至1.00 mg/mL的溶菌酶0.05至0.40 ml和2 ml的質量濃度為0.4至1.2g/L的EDTA溶液，設置水浴溫度30至50°C條件下酶解15至75 min ;待到酶解結束后，再使用臺式離心機；離心轉速4500 r/min，離心時間是15分鐘；離心收集剛剛制得的溶藻細菌LR5原生質體，用32.14 g/L的高滲NaCl溶液洗滌菌體2至3次，將溶菌酶酶液去除后再用4 ml的32.14 g/L高滲NaCl溶液重懸；此即為制得的溶藻細菌LR5原生質體； (3)溶藻細菌LR5原生質體再生: 提取高滲NaCl溶液重懸的溶藻細菌LR5原生質體懸浮液，用32.14 g/L質量濃度的NaCl溶液稀釋到合適的兩個梯度，分別吸取200 μ I菌體稀釋液涂布于高滲固體培養基，其中每個梯度做兩個平行樣，放置于30°C恒溫培養箱培養24至48 h，使得溶藻細菌LR5原生質體恢復其細胞壁，此即為溶藻細菌LR5原生質體再生。
2.根據權利要求1`所述的一種處理藍藻的LR5溶藻細菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于所述的溶藻菌aerwgifliosa,其保藏號為CGMCC N0.7517。
3.根據權利要求1所述的一種處理藍藻的LR5溶藻細菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于上述的步驟(1)中所述的溶藻細菌LR5菌種活化操作中培養用的培養基成分展示如下:(I)普通細菌培養液:IL蒸餾水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g;其中要求調節pH為7.0至7.2 ; (2)普通細菌培養基:1L蒸餾水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10g、瓊脂20至24 g、氯化鈉5 g ;其中要求調節pH為7.0至7.2 ;此上所述的培養基據實驗滅菌要求在高壓滅菌鍋中在121°C滅菌溫度下持續滅菌20 min。
4.根據權利要求1所述的一種處理藍藻的LR5溶藻細菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于所述的步驟(3)中所述的溶藻細菌LR5原生質體恢復細胞壁，即為原生質體再生使用用的高滲固體培養基成分展示如下:800 mL蒸餾水中添加蛋白胨10 g、酵母浸出汁5 g，、牛肉膏5 g、瓊脂20至24 g、蔗糖170 g (0.5 mol/L);其中要求調節pH為7.0至7.2 ;此上所述的培養基根據要求在高壓滅菌鍋中在121°C滅菌溫度下持續滅菌20 min。
5.根據權利要求1所述的一種處理藍藻的LR5溶藻細菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于所述的配制溶液成分如下:(1)高滲氯化鈉溶液:1 L蒸餾水中添加氯化鈉`3`2.14 g ;(2)SMM緩沖液:800 mL蒸餾水中添加蔗糖188.26 g、順丁烯二酸2.3214 g、六水合氯化鎂4.066 g ;其中要求調節pH 6.8 ；(3)EDTA溶液:1 L SMM緩沖液中添加EDTA 0.6至1.2 g ;(4)溶菌酶:1 mL SMM緩沖液中添加0.1 mg ;上述配制的溶液根據實驗要求要在高壓滅菌鍋中在121°C滅菌溫度下持續滅菌20 min。
【文檔編號】C12R1/385GK103555621SQ201310505662
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】張文藝, 陳晶, 李仁霞, 陳雪珍, 馮國勇 申請人:常州大學