一種源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸及其制備方法
【專利摘要】一種源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸及其制備方法，涉及一種具有高效抑藻活性的脂類化合物。所述高效抑藻活性化合物的菌株為弧菌（Vibrio?sp.）BS02，保藏編號為CCTCCNO：M2010217。所述源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸的分子式為C16H30O2，分子量大小為254。將菌株BS02發酵培養，得含有強抑藻活性化合物的發酵液，離心后，收集上清液，再分離純化，即得具有強抑藻活性的化合物源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸。所述源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸能夠高效、專一地殺滅藻細胞，具有開發成抑藻劑的潛能，在生物降解藻類、治理赤潮方面具有廣泛的應用。
【專利說明】一種源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種具有高效抑藻活性的脂類化合物，尤其是涉及一種源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸及其制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，伴隨著水產養殖業的大力發展，以及逐年增多的填海造地，不規范的近海海域開發利用，使得水產養殖區水體生態系統遭到破壞，水體生態系統紊亂，氮磷污染消納能力下降，自凈功能逐步喪失，導致我國近海營養鹽負荷較重的海區富營養化程度居高不下，赤潮時有發生。素有“水體癌癥”之稱的有害藻華不僅導致沿海地區出現了嚴重的生態、資源、環境問題，同時也使沿海城鎮的經濟蒙受巨額損失。僅2012年以來，福建沿海就發生了八起赤潮，其中5月份平潭流水、蘇澳碼頭附近海域和龍風頭海濱浴場海域所引發的赤潮導致逾5000萬只鮑魚死亡，直接經濟損失達2億元人民幣。故此，有害赤潮作為水產養殖業的致命殺手，已經引起政府和地區的密切關注，如何研制新型、高效的赤潮調控方法并制定有關赤潮防治對策已成為各級政府和科研工作者的當務之急！
[0003]塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)是一種能產生麻痹性貝毒素(PSP)的海洋甲藻，是當前有害赤潮主要原因藻種之一，其所產生的PSP毒素不僅對生態環境產生不利的影響，同時也對人類的健康及海洋經濟的發展造成了巨大的威脅。鑒于塔瑪亞歷山大藻的各種危害，對其防治顯得越來越重要。當前藻類控制技術可歸結為:物理方法、化學方法及生物防治，其中溶藻微生物防治技術因具有成本低、安全性好的潛能，引起了越來越多研究人員的關注。溶藻細菌(Algicidal bacteria)是一類以直接或間接方式抑制藻類生長，或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統稱，具有較好的生態安全性，尤其適合在赤潮發生初期使用，在短期內即可 達到控制藻類生物量，阻止藻類大量增殖的效果，勢必成為赤潮生物防治的一個重要手段。目前，國內外已有不少對溶藻細菌的報道。
[0004]至今為止，大多數篩選到的殺藻細菌是通過分泌特異的具有殺藻活性的物質來起殺藻作用的。已經報道的殺藻活性物質包括:蛋白質(含胞外酶)、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的殺藻化合物(Paul C.,Pohnert G.1nteractionsof the Algicidal Bacterium Kordia algicida with Diatoms:Regulated ProteaseExcretion for Specific Algal Lysis[J].PLoS One，2011，6(6):e21032 ;Chen W.M., SheuF.S.，Sheu S.Y.Novel L—amino acid oxidase with algicidal activity against toxiccyanobacterium Microcystis aeruginosa synthesized by a bacterium Aquimarinasp [J].Enzyme Microb Technol，2011，49 (4): 372-379 ;0h J.1.，Kim M.J.，Lee J.Y.，Ko
1.J.，Kim W.，Kim S.W.1solation and characterization of algicidal bacteriafrom Cochlodinium polykrikoides culture[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2011，16 (6): 1124-1133 ；Lee S.0.，Kato J.，Takiguchi N.，Kuroda A.，IkedaT., Mitsutani A., Ohtake H.1nvolvement of an extracellular protease in algicidalactivity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strain A28[J].ApplEnviron Microbiol, 2000, 66(10):4334-4339)。
【發明內容】
[0005]本發明的第一目的是提供一種生產所述高效抑藻活性化合物的菌株及其篩選方法。
[0006]本發明的第二目的是提供一種源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸及其制備方法。
[0007]本發明的第三目的是提供一種源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸在制備抑藻劑中的應用。
[0008]所述高效抑藻活性化合物的菌株 為弧菌(Vibrio sp.)BS02，該菌已于2010年9月3日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2010217，保藏中心地址為:中國武漢武漢大學，郵編430072。
[0009]所述弧菌(Vibrio sp.) BS02的篩選方法包括以下步驟:
[0010]I)取福建漳江口紅樹林國家自然保護區土壤樣品，無菌水經過一系列10倍稀釋后，每個稀釋液取0.1mL涂布在高氏一號培養基平板上,在25°C下培養5d ；
[0011]2)挑取不同菌落大小、形態單菌落劃線于2216E固體平板，置于28~37°C溫度下培養3~5d，驗證是否純培養，重復該步驟直到得到純培養；
[0012]3)將純化后的菌株接種于4mL海水配制的高氏一號液體培養基中，置于28°C搖床，150rpm震蕩培養3d，取培養液于10，000~12，OOOg的條件下離心lOmin，除去菌體沉
淀，保存上清；
[0013]4 )取ImL上清接種于20mL指數生長的無菌塔瑪亞歷山大藻培養液中，于20 ± I °C，12h光照，12h黑暗,50 V- mo I photons nT2s4光照強度條件下培養2d,高氏一號培養基為對照加入藻液中，分別設置3個平行；觀察塔瑪亞歷山大藻細胞是否沉降，沉降代表菌體7d培養物上清中含有抑藻活性物質，從而篩選出弧菌(Vibrio sp.)BS02。
[0014]所述源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸的分子式為C16H3tlO2,分子量大小為254，
結構式如下:
[0015]
【權利要求】
1.高效抑藻活性化合物的菌株為弧菌(Vibriosp.)BS02，該菌已于2010年9月3日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2010217，保藏中心地址為:中國武漢武漢大學，郵編430072。
2.如權利要求1所述弧菌(Vibriosp.)BS02的篩選方法，其特征在于包括以下步驟: 1)取福建漳江口紅樹林國家自然保護區土壤樣品，無菌水經過一系列10倍稀釋后，每個稀釋液取0.1mL涂布在高氏一號培養基平板上,在25°C下培養5d ； 2)挑取不同菌落大小、形態單菌落劃線于2216E固體平板，置于28~37°C溫度下培養3~5d，驗證是否純培養，重復該步驟直到得到純培養； 3)將純化后的菌株接種于4mL海水配制的高氏一號液體培養基中，置于28°C搖床，150rpm震蕩培養3d，取培養液于10，000~12，OOOg的條件下離心lOmin，除去菌體沉淀，保存上清； 4)取ImL上清接種于20mL指數生長的無菌塔瑪亞歷山大藻培養液中，于20±1°C，12h光照，12h黑暗,50 V- mo I photons nT2s4光照強度條件下培養2d,高氏一號培養基為對照加入藻液中，分別設置3個平行；觀察塔瑪亞歷山大藻細胞是否沉降，沉降代表菌體7d培養物上清中含有抑藻活性物質，從而篩選出弧菌(Vibrio sp.)BS02。
3.源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸，其特征在于其分子式為C16H3tlO2,分子量大小為254，結構式如下:
4.如權利要求3所述源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將弧菌(Vibriosp.)BS02菌株接種于新鮮海水配制的固體2216E平板上畫線分離，于28°C恒溫培養箱中培養24h ;挑取所述平板上的單菌落接種于海水配制的高氏一號液體培養基中，于28~37°C，180~250rpm培養2~3d后即得發酵液； 2)將步驟I)中的發酵液于10，000~12，OOOg離心IOmin;采用乙酸乙酯等體積萃取5次，將乙酸乙酯萃取相合并，旋轉蒸干，加甲醇溶解離心，去鹽、去蛋白； 3)乙酸乙酯萃取物溶于ImL乙酸乙酯中，上樣于硅膠柱，所述硅膠柱為170mmX30mm，200~300目，洗脫劑:二氯甲烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脫程序:體積比1: 0，30min ；1: I, 30min ；1: 0, 30min ;洗脫流速:lmL/min ;用收集管收集洗脫液2mL/管； 4)每隔10~15min收集樣品，收集管內洗脫液利用薄層層析分析，擴增劑為乙酸乙酯，采用紫外顯色，碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，合并相似組分； 5)合并洗脫液于旋轉蒸發儀30°C下真空蒸干，溶解于DMSO驗證抑藻活性； 6)活性組分再通過硅膠柱，所述硅膠柱為170mmX30mm，200~300目；層析，洗脫劑:正己燒和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脫程序:體積比100: I, 30min ；60: I, 30min ；40: I, 30min ；20: I, 30min ;洗脫流速:lmL/min ;用收集管收集洗脫液2mL/管；重復步驟4)和5)檢測活性組份； 7)上述所得活性組份利用S^hadexLH - 20葡聚糖凝膠柱進一步分離，洗脫流動相采用99%甲醇，每6min收集一組分；收集管內洗脫液利用薄層層析分析，采用紫外顯色，碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，合并相似組分，于旋轉蒸發儀30°C下真空蒸干，溶解于DMSO驗證抑藻活性，得源于海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸。
5.如權利要求3所述源于`海洋細菌抑藻活性物質棕櫚油酸在制備抑藻劑中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK103484409SQ201310451825
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】鄭天凌, 李 東, 安新麗, 張化俊, 李祎, 鄭偉, 陳章然 申請人:廈門大學