一種熱穩定性改良的堿性木聚糖酶及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種熱穩定性改良的堿性木聚糖酶及其編碼基因和應用。本發明以Bacillus?subtillis?B230木聚糖酶xyn-B230的晶體結構為出發的結構，選擇的突變位點為S23H和I129Y。與木聚糖酶xyn-B230相比，突變后的酶的熱穩定性得到了明顯的提高，在70℃保溫120min仍能保留90%的酶活性。在75℃處理30min酶活性仍然能保持65%以上的活性。木聚糖酶xyn-B230-m具有比較好的性質，可以滿足在造紙行業的使用。
【專利說明】一種熱穩定性改良的堿性木聚糖酶及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種熱穩定性改良的堿性木聚糖酶及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002]木聚糖是植物半纖維素的重要成份，是陸生植物細胞壁中最普通的半纖維素，除纖維素外，木聚糖是自然界中最豐富的多糖。在闊葉材和一年生禾本植物中木聚糖占植物原料干重的20%-30%，針葉材中木聚糖含量較少，一般為原料干重的7%-10%。
[0003]木聚糖酶是降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱，它主要包括作用于主鏈的內切-1，4-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶以及其它輔酶。自從發現木聚糖酶可以用于紙漿的漂白以后，國內外對木聚糖酶研究和開發非常關注，它可以應用于生物制漿、紙漿漂白、廢紙二次纖維回收、廢紙脫墨處理及紙張表面處理等，特別是其在紙漿生物漂白中的巨大應用潛力早已引起各界同行的高度關注。無論是闊葉材還是針葉材硫酸鹽漿及其它化學漿；無論是與傳統的氯漂序相配合還是與先進的無氯漂序相配合，采用木聚糖酶處理均可以促使紙漿中殘余木質素的降解和溶解性木質素的抽除，不但可以提高紙漿的白度和白度穩定性，改善纖維的濾水性和造紙性 能，而且可大大減少后續漂白過程中氯化物的用量，從而大大降低制漿和造紙工業對環境造成的污染。
[0004]和其它的酶制劑不同，用于造紙上的酶制劑，需要經歷一個高溫強堿的處理過程，因為制漿過程是在堿性的條件下，用高溫蒸煮的方法除去木屑中的木質素。因此，用于紙漿漂白的木聚糖酶應是耐熱和耐堿的。而到目前為止，工業上用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最適反應溫度大多在45°C以下，這就要求在加酶之前先將紙漿的pH和溫度調到適合木聚糖酶作用的范圍，這是一個費時和費力的過程。
[0005]要解決以上問題，就需要獲得適合在造紙工業條件下使用的耐熱和耐堿的木聚糖酶。要獲得特殊性質的木聚糖酶，可以考慮從以下幾個方面展開工作:首先，可以從極端環境中分離具有嗜極微生物菌種，并從中克隆耐熱耐堿的木聚糖酶。同時，還要積極加強包括傳統微生物育種在內的誘變育種和分子育種，不斷提升菌種木聚糖酶基因的表達量和產品的性能。其次，通過基因工程和蛋白質工程等現代生物技術手段對木聚糖酶基因進行分子改造，提高木聚糖酶的穩定性和對不良外界條件的抗逆性，篩選出符合不同應用領域要求的木聚糖酶基因。因此提高該木聚糖酶的熱穩定性，使其能夠有效地在各領域上獲得更好的應用。
[0006]目前通過蛋白質工程的手段在酶分子改造方面已經有很多成功的例子，特別是在提高酶的熱穩定性。定點突變即理性設計是在已知酶的結構與功能的基礎上有目的、有針對性地改變酶的某一活性基團或模塊，最終獲得特定氨基酸殘基得具有性質得到預期改變的蛋白質，該技術已被廣泛用于酶分子的改造。
[0007]本發明以目前在紙漿和造紙上已經使用的來源于芽孢桿菌的木聚糖酶xyn-B230為出發材料，通過系列定點突變，最終得到了一個熱穩定性提高的木聚糖酶xyn-B230-m。與木聚糖酶xyn-B230相比，突變后的酶的熱穩定性得到了明顯的提高，在70°C保溫120min仍能保留90%的酶活性。在75°C處理30min酶活性仍然能保持65%以上的活性。木聚糖酶xyn-B230-m具有比較好的性質，可以滿足在造紙行業的使用。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是通過對來源于芽孢桿菌的木聚糖酶xyn-B230的改造，使改造后的木聚糖酶xyn-B230-m在高溫時穩定性提高，使其能夠更好在高溫強堿性的紙漿生物漂白中發揮降解原料中木聚糖的作用，促使紙漿中殘余木質素的更好降解和溶解性木質素的抽除。
[0009]本發明的目的是提供一種優化改良的木聚糖酶xyn-B230_m[0010]本發明的再一目的是提供優化改良的木聚糖酶基因。
[0011]本發明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重組載體。
[0012]本發明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重組菌株。
[0013]本發明的再一目的是提供上述木聚糖酶xyn-B230_m的應用。
[0014]以Bacillus subtillis B230 木聚糖酶 xyn_B230 的晶體結構(PDB:1IG0)為出發的結構，選擇的突變位點，為了提高來源于芽孢桿菌的木聚糖酶xyn-B230的熱穩定性，利用生物計算和蛋白質工程手段對xyn-B230中可能影響其熱穩定性的關鍵氨基酸進行了突變研究，這些氨基酸分別是第23位的S突變為H、第45位的N突變為1、第55位的D突變為P、第60位的H突變為Y、第61位的S突變為D、第65位的N突變為D、第75位的N突變為T、第129位的I突變為Y、第149位的T突變為D、第185位的Y突變為F，以及進一步對熱穩定性有所提高的第23位的S突變為H和第129位的I突變為Y，進行組合突變。最后經過優化改良的木聚糖酶xyn-B230-m在75°C的熱穩定性得到了明顯的提高，可在造紙應用中顯示出巨大的應用潛力。
[0015]通過對每個突變體進行酶學性質的分析，最終獲得了熱穩定性明顯提高的木聚糖酶xyn-B230-m。本發明的木聚糖酶xyn-B230_m和原有芽孢桿菌木聚糖酶xyn_B230相比，有兩個氨基酸發生了突變，突變位點為S23H和I129Y (突變位點以斜體和下劃線標示)。突變后的氨基酸序列(不包括信號肽序列)如SEQ ID N0.1所示:
[0016]ATTlTSNQTGTHDGYDYELffKDHGNTSMTLNSGGAFSAQffSNIGNALFRKGKKF DSTKTHSQLGNISINYNATFNPGGNSYLCVYGWTKDPLTEYYIVDNWGTYRPTGT PKGTFTVDGGTYDIYETTRYNQPSIIGIATFKQYffSVRQTKRTSGTVSVSEHFKKff ESLGMPMGKMYETALTVEGYQSNGSANVTANVLTIGGKPLAA
[0017]本發明還提供了上述改良的耐高溫木聚糖酶xyn-B230-m的基因序列，其堿基序列如SEQ ID N0.2所示:
[0018]gctaccaccatcacatctaatcagacaggaacacacgacggttatgactatgaactttggaaggaccatggaaacacctctatgac tttgaactctggtggagctttttcagcccaatggagtaacattggtaacgcattgtttagaaagggaaagaaattcgattctaccaaaa ctcattcccagcttggtaacatctctatcaactacaacgctactttcaacccaggtggaaattcctacttgtgtgtttatggttggacaa aggatcctcttaccgaatactatattgtcgacaactggggaacttatagaccaacaggtacccctaaaggaacttttacagttgatgg tggaacatacgacatctacgagactacaagatataatcaaccatcaattatcggtatcgccacttttaagcaatactggtcagtcaga cagaccaaaagaactagtggaacagtttctgtctccgaacacttcaagaaatgggagagtttgggtatgcctatgggaaagatgta cgaaaccgctcttactgttgagggttatcagtcaaacggaagtgctaatgttactgctaatgtccttacaatcggtggaaaacctcttt aa
[0019]本發明還提供了包含上述優化改良的木聚糖酶xyn-B230-m的重組載體，將本發明的優化改良的木聚糖酶Xyn-B230-m插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將本發明的木聚糖酶xyn-B230-m插入到質粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒pPIC9-xyn-B230_m。
[0020]本發明還提供了包含上述木聚糖酶xyn-B230-m的重組菌株，優選重組菌株是畢赤酵母菌株GSl 15。
[0021 ] 本發明還提供了上述木聚糖酶xyn-B230-m在紙漿處理中的應用，主要涉及木聚糖酶在使用酶預處理改善纖維性能、紙漿的漂白和廢紙脫墨。在這些過程中采用木聚糖酶處理，均可以促使紙漿中殘余木質素的降解和溶解性木質素的抽除，不但可以提高紙漿的白度和白度穩定性，改善纖維的濾水性和造紙性能，而且可以大大減少后續漂序化學的用量，從而降低紙漿漂白對環境產生的污染。
[0022]本發明利用基因工程手段對來源于芽孢桿菌的木聚糖酶xyn-B230的進行改良，以解決該木聚糖酶在紙漿處理過程中高溫酶活性損失過多的缺陷，經過優化改良的木聚糖酶xyn-B230-m在75°C條件下的熱穩定性得到了很大的提高，進一步滿足了造紙用酶的要求，因此，本發明的優化改良的木聚糖酶xyn-B230-m可在造紙工業中顯示出巨大的應用潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1、木聚糖酶xyn_B2 30和xyn-B230_m純化的蛋白SDS-PAGE電泳圖
[0024]圖2、木聚糖酶xyn_B230和xyn-B230_m的pH穩定性。
[0025]圖3、木聚糖酶xyn_B230和xyn-B230_m的最適溫度。
[0026]圖4、木聚糖酶xyn_B230和xyn-B230_m在70°C的熱穩定性。
【具體實施方式】
[0027]實驗條件:
[0028]1、菌株與載體
[0029]大腸桿菌菌株ToplO、Escherichia coli BL21 (DE3)、表達載體 pET_22b (+)(購自Novagen公司)。畢赤酵母GS115、載體pPIC9 (購自Invitrogen公司)。
[0030]2、酶類及其他生化試劑
[0031]Fast pfu購自全式金公司，內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。X-Gal、IPTG、樺木木聚糖等底物購自Sigma公司，其它都為國產試劑。
[0032]3、培養基
[0033]大腸桿菌培養基為LB (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%似(:1，？!17.0)。酵母培養基為YPD (1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)。酵母篩選培養基為MD (葡萄糖20g/L，瓊脂粉 20g/L，生物素 4X 10_4g/L，YNB13.4g/L)。[0034]酵母誘導培養基BMGY (I %酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% ΥΝΒ、0.00004 %Biotin、l%甘油(V/V))和BMMY (除以1%甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。
[0035]本發明中所用到重組遺傳學技術均為本領域中的常規技術。在以下實施例中未作詳細介紹的技術，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關章節或部分來進行，包括:Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3版.2001) ；Kriegler, GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual (1990)；和 James M.Cregg, PichiaProtocols (第一版，1998)。
[0036]實施例1、木聚糖酶xyn-B230基因合成、表達載體構建及突變體構建
[0037] ( I)結構優化
[0038]以Bacillus subtillis B230 木聚糖酶 xyn_B230 (其氨基酸序列如 SEQ ID N0.3所示)的晶體結構(PDB:1IG0)為出發的結構，選擇的突變位點為:S23H、N451、D55P、H60Y、S61D、N65D、N75T、I129Y、T149D、Y185F，。
[0039]Bacillus subtillis B230 木聚糖酶 xyn_B230 的氨基酸序列如 SEQ ID N0.3 PJf示:
[0040]ATTITSNQTGTHDGYDYELWKDSGNTSMTLNSGGAFSAQWSNIGNALFRKGKKFDSTKTHSQ LGNISINYNATFNPGGNSYLCVYGWTKDPLTEYYIVDNWGTYRPTGTPKGTFTVDGGTYDIYE TTRINQPSIIGIATFKQYffSVRQTKRTSGTVSVSEHFKKWESLGMPMGKMYETALTVEGYQSN GSANVTANVLTIGGKPLAA
[0041](2)基因優化合成
[0042]將來自于枯草芽抱桿菌Bacillus subtillis B230的木聚糖酶基因xyn_B230,按照畢赤酵母的偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下進行序列改造。改造中避免GT……AG這一形式的位點,注意不能影響mRNA的穩定性。將改造設計好的基因序列送南京金瑞斯公司進行全基因合成。
[0043](3)表達載體的構建
[0044]根據合成基因的序列設計PCR引物5’端含有Nco I內切酶位點，3’端含EcoR I內切酶位點，引物序列如下:
[0045]5 ’ 端引物 pET-xyn-F: GCACCCATGGGCTACCACCATCACATCTAATCA ; 3 ’ 端引物 pET-xyn-R:GCACGAATTCTTAAAGAGGTTTTCCACCGATTG ；以合成基因為模板，用上述引物進行PCR擴增，將擴增得到的片段克隆到載體pET-22b (+)上，得到重組載體pET-22b (+) -xyn_B230。
[0046](4)突變體的構建
[0047]米用TransGen 公司的 Fast Mutagenesis System 對 Bacillus subtillis B230的木聚糖酶基因xyn-B230基因進行定點突變，包含突變位點的部分重疊引物(表1)，按照該產品說明書的要求進行設計，PCR等相關操作按該產品的說明書進行。對篩選得到的突變體，經測序確定突變基因序列的正確性。
[0048]表1突變引物
[0049]
【權利要求】
1.一種熱穩定性改良的木聚糖酶突變體xyn-B230-m，其特征在于，對氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示的木聚糖酶進行S23H和I129Y突變，獲得所述熱穩定性改良的木聚糖酶突變體 xyn-B230-m。
2.根據權利要求2所述的熱穩定性改良的木聚糖酶突變體xyn-B230-m,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.熱穩定性改良的木聚糖酶突變體基因，其特征在于，編碼權利要求1所述的熱穩定性改良的木聚糖酶突變體xyn-B230-m。
4.根據權利要求3所述的熱穩定性改良的木聚糖酶突變體基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.包含權利要求3所述熱穩定性改良的木聚糖酶突變體基因的重組載體。
6.包含權利要求3所述熱穩定性改良的木聚糖酶突變體基因的重組載體pPIC9-xyn-B230_mo
7.包含權利要求3所述熱穩定性改良的木聚糖酶突變體基因的重組菌株。
8.包含權利要求3所述熱穩定性改良的木聚糖酶突變體基因的重組畢赤酵母菌株GS115。
9.一種制備熱穩定性改良的木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (O以權利要求4所述的重組載體轉化宿主細胞； (2)培養所述宿主細胞；· (3)分離純化熱穩定性改良的木聚糖酶。
10.權利要求1所述的熱穩定性改良的木聚糖酶突變體Xyn-B230-m的應用。
【文檔編號】C12R1/125GK103525793SQ201310519982
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】姚斌, 黃火清, 羅會穎, 王亞茹, 石鵬君, 柏映國, 孟昆, 楊培龍 申請人:中國農業科學院飼料研究所