一種化學誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質粒穩定性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種化學誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質粒穩定性的方法，包括如下步驟：1）化學誘變；2）篩選；3）PCR檢測質粒穩定性；4）誘導表達與活性檢測。本發明通過化學誘變劑硫酸二乙酯誘變釀酒酵母基因工程菌株，用含有五氟尿嘧啶的培養基篩選，致死淘汰能利用培養基中尿嘧啶的細胞，得到不能利用培養基中尿嘧啶的突變體。該突變體只能或基本只能使用質粒本身基因合成尿嘧啶，因而在非選擇培養基中仍然維持質粒穩定性，極大降低了培養基成本，克服了制約利用釀酒酵母基因工程菌大規模生產抗菌肽的關鍵難題之一。
【專利說明】一種化學誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質粒穩定性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種化學誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質粒穩定性的方法 。
【背景技術】
[0002]抗菌肽是在誘導條件下，生物體免疫防衛系統產生的小分子活性肽類，廣泛分布于植物，動物以及人類。抗菌肽是由基因編碼、由核糖體合成的。目前已經發現、鑒定的抗菌肽已超過千種，大多帶凈正電荷。從結構上看可以分為α-螺旋型、折疊型、富含二硫鍵的、富含脯氨酸等多種類型。抗菌肽抑菌譜廣，有些抗菌肽還可以特異性地抑制某些腫瘤細胞的生長。抗菌肽可以用于醫藥衛生、食品添加劑、飼料添加劑等方面。抗菌肽與傳統抗生素抑菌機理不同，抗菌肽的作用方式主要是選擇性地攻擊病原物的細胞膜，病原物不易產生針對抗菌肽的耐藥性，因此使用抗菌肽可以解決細菌耐藥性問題。同時又由于它是一種肽，可以被消化道消化、吸收對人體無害，無殘留，因此，抗菌肽在醫藥、畜牧業、農業等方面都有十分廣泛的應用前景。抗菌肽在生物體內含量極低，生產成本居高不下，嚴重影響其廣泛應用；研究開發其大規模生產方法具有十分積極的意義。
[0003]目前，生產抗菌肽的方法主要有三種:1.直接從生物體中提取天然抗菌肽:抗菌肽廣泛存在于低等到高等動物的特定組織中，但是含量非常少，且提取工藝復雜，成本昂貴，難以滿足大規模生產的要求；2.化學方法合成抗菌肽:化學合成法成本高，同時難以保證合成肽類的天然結構和生物活性；3基因工程方法:采用該方法是如今研究的熱點，也是獲得抗菌肽的有效途徑之一。
[0004]釀酒酵母在食品業使用有數千年的歷史，也是基因工程的模式生物之一。隨著DNA重組技術的發展，釀酒酵母已被廣泛地應用于外源蛋白表達的宿主，其是真核生物，無內毒素，長久以來在食品和釀酒工業中廣泛應用；胞外分泌表達蛋白，簡化了表達產物的分離純化。
[0005]基因工程中釀酒酵母載體有兩類:整合型載體(YIps)和附加體型載(YEps)。整合型載體不含自主復制序列，通過同源重組被整合到宿主酵母菌的染色體上，穩定性好，但拷貝數很低，不能滿足生產要求。附加體型載體一般利用酵母天然2μ質粒的復制原點序列，能夠獨立于酵母染色體外自主復制，拷貝數通常可達30以上，易于更換宿主菌，但附加體型載體在非選擇條件下不穩定，大規模發酵時更容易丟失，而重組質粒在宿主細胞中的穩定存在，是基因工程生產異源蛋白的前提。當利用質粒載體在大量高效表達某種特殊產物時，質粒載體的丟失就意味著產量的下降，對于外源基因的表達是很大的障礙。從而給生產帶來嚴重的后果。如何有效提高質粒穩定性，一直是一個亟待解決的既有理論意義又有實際應用價值的關鍵問題。
[0006]pYES2是應用較為廣泛的釀酒酵母白表達載體，其在宿主細胞中穩定的機制，是通過質粒本身所攜帶的URA3基因彌補INVScl宿主細胞尿嘧啶營養缺陷，轉化菌在不含尿嘧啶的選擇性培養基中培養以保持選擇壓力，即可維持質粒的穩定存在。但選擇性培養基為合成培養基，要求添加一些氨基酸以及無堿基氮源，成本很高，構成工業化生產的主要障礙之一 。
[0007]URA3編碼乳清酸核苷-5' _磷酸脫羧酶，催化乳清甘酸脫羧形成尿嘧啶核苷酸，其它嘧啶核苷酸由尿嘧啶核苷酸轉變得到。若細胞乳清酸核苷-5^ -磷酸脫羧酶活性缺失，則需要利用培養基中的尿嘧啶，通過補救途徑合成尿嘧啶核苷酸，與此有關的酶有尿嘧啶透性酶、尿苷磷酸化酶等。鑒于構建好的基因工程菌株可以利用重組PYES2質粒的URA3基因合+突變體，使其失去或減弱從培養基中獲取尿嘧啶的能力，這樣基因工程菌可以在完全培養基中生長，同時保持對質粒穩定性所必需的選擇壓力。。
[0008]誘變是通過物理、化學、生物因素作用于宿主菌，人為使其遺傳物質發生變異的手段，不僅可以提高菌種有效產物的產量，改善其生物學特性和創造新品種，而且對于研究有效產物代謝途徑、遺傳圖譜繪制、功能基因分析等都具有一定的作用。誘變育種操作簡便、速度快、收效大、手段多樣，所以是實驗室及生產上最為常用的高產菌株育種方式。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于提供一種化學誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質粒穩定性的方法。
[0010]本發明所采取的技術方案是:
一種化學誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質粒穩定性的方法，包括如下步驟:
1)化學誘變
2)篩選;
3)PCR檢測質粒穩定性。
[0011]步驟I)所述誘變的操作為:取含重組質粒的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES，超聲波處理后，將誘變液加入硫代硫酸鈉溶液中終止反應。
[0012]作為優選的，步驟I)的具體操作為:取含重組質粒pYES2_ a -G13的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES使其終濃度為2% (ν/ν)，超聲波處理10~20min后，將誘變液加入25%的硫代硫酸鈉溶液中終止反應。
[0013]步驟2)所用的篩選劑為五氟尿嘧啶，具體操作為，將步驟I)誘變后的菌液涂布于含五氟尿嘧啶的SC-U固體培養基上進行篩選。
[0014]作為優選的，所述SC-U固體培養基中五氟尿嘧啶的濃度為20 μ mol/L。
[0015]步驟3)的具體操作為:于篩選板上挑選單個菌落接種于完全培養基培養，分別在培養24h、48h、72h、96h、120h、144h時做菌液PCR反應，檢測質粒的穩定性。
[0016]所述釀酒酵母基因工程菌為含有抗菌肽G13重組質粒pYES2- a -G13的釀酒酵母基因工程菌。
[0017]本發明的有益效果在于:
本發明通過化學誘變劑硫酸二乙酯誘變釀酒酵母基因工程菌株，用含有五氟尿嘧啶的培養基篩選，致死淘汰能利用培養基中尿嘧啶的細胞，得到不能利用培養基中尿嘧啶的突變體。該突變體只能或基本只能使用質粒本身基因合成尿嘧啶，因而在非選擇培養基中仍然維持質粒穩定性，極大降低了培養基成本，克服了制約利用釀酒酵母基因工程菌大規模生產抗菌肽的關鍵難題之一。
[0018]對于本發明來說，主要解決了如下問題。
[0019]1.誘變菌株在沒有選擇壓力的完全培養基上可以正常生長而質粒不丟失，節約了培養基成本；
2.誘變菌株利用α信號肽，將表達產物分泌至胞外，避免了破碎細胞等工序，方便分離純化，降低生產成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為突變菌株在含有尿嘧啶的完全培養基上培養6天的PCR檢測結果，其中S代表在尿嘧啶缺陷培養基上培養6天菌液的PCR結果，W代表在完全培養基上培養6天的菌液 PCR 結果，M 代表 DNA Marker D (2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp);
圖2為誘變工程菌誘導上清對大腸桿菌DH5a和枯草芽孢桿菌活性檢測圖，其中A為枯草芽孢桿菌抑菌活性圖，B為大腸桿菌DH5 α抑菌活性圖，圖中丨為氨芐，2為SC-U尿嘧啶缺陷培養基誘導上清，3為完全培養基誘導上清，4為無菌ddH20 ；
圖3為PCR檢測效果圖。M為Maker，1-5是誘變菌株的在完全培養基第一到第五天的PCR檢測，6-10是未誘變的完全培養基第一到第五天的PCR檢測。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0022]實施例1
本實施例所用的釀酒酵母基因工程菌為含有重組質粒pYES2-a -G13的釀酒酵母基因工程菌，所述重組質粒pYES2-a -G13的制備方法參加申請號為CN201210073067.9的專利申請《一種利用釀酒酵母表達抗菌肽G13的方法》。
[0023]1、誘變
用接種環挑取一 80°C下保存的釀酒酵母基因工程菌甘油菌于尿嘧啶缺陷固體培養基(SC-U)上，等菌落長出，取單菌落接種于SC-U液體培養基上，待0D600=3時，無菌條件下取IOml菌液于離心機中，3000r/min離心lOmin，用pH=7的PB緩沖液40ml懸浮至菌體密度為IO6個/ml，在懸浮液中加入Iml誘變劑DES (硫酸二乙酯)使其終濃度為2% (v/v)，用超聲波處理15min，吸取500 μ I誘變液加入0.25ml 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應。取誘變菌體進行SC-U固體培養基平板涂布，得知在誘變15min時致死率為80%。
[0024]2、篩選
根據誘變可知在DES誘變15min時其致死率達80%，涂布于含20 μ mo I /L的五氟尿嘧啶的固體培養基中進行篩選。
[0025]3、PCR檢測質粒穩定性
挑選單個菌落接種于完全培養基培養，分別在培養24h，48h，72h，96h，120h, 144h時做菌液PCR反應，檢測質粒的穩定性，PCR引物序列如下:
Pl:CCGCTCGAGAAAAGACAAAGATCTGT (SEQ ID NO:1)
P2:GGAATTCTTACCATCTAGATCTACCAGTTCTACAAAC (SEQ ID NO:2)。
[0026]圖1為突變菌株在含有尿嘧啶的完全培養基上培養6天的PCR檢測結果，該結果表明利用本發明方法篩選得到的在突變菌株可以在沒有選擇壓力的完全培養基上正常生長而質粒不丟失。
[0027]4、誘導表達與活性檢測
挑選單克隆接種于YPD完全培養基，30°C 200r/min震蕩培養48h，4°C、3000rpm離心10 min,收集酵母菌，分別用含4%半乳糖的SC培養基和和SC- U誘導培養基懸浮，使菌液終濃度達到0D600=0.4，置于20°C，200r/min的搖床誘導。誘導24h做抑菌活性試驗檢測。圖2為誘變工程菌誘導上清對大腸桿菌DH5 α和枯草芽孢桿菌活性檢測圖，檢測結果表明，本發明方法篩選得到的誘變菌株能夠高效穩定的表達分泌抗菌肽G13。
[0028]5、傳代實驗
將篩選得到的誘變菌株進行傳代培養，傳代約100次后，所得到的菌株仍可以在沒有選擇壓力的完全培養基上正常生長而質粒不丟失，并能夠高效穩定的表達分泌抗菌肽G13。本試驗已多 次重復。
【權利要求】
1.一種化學誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質粒穩定性的方法，包括如下步驟: 1)化學誘變； 2)篩選; 3)PCR檢測質粒穩定性； 4)誘導表達與活性檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述誘變的操作為:取含重組質粒的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES，超聲波處理后，將誘變液加入硫代硫酸鈉溶液中終止反應。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟I)的具體操作為:取含重組質粒pYES2-a -G13的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES使其終濃度為2%(v/v)，超聲波處理10~20min后，將誘變液加入25%的硫代硫酸鈉溶液中終止反應。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所用的篩選劑為五氟尿嘧啶，具體操作為，將步驟I)誘變后的菌液涂布于含五氟尿嘧啶的SC-U固體培養基上進行篩選。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述SC-U固體培養基中五氟尿嘧啶的濃度為 20 μ mol/Lo
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)的具體操作為:于篩選板上挑選單個菌落接種于完全培養基培養，分別在培養24h、48h、72h、96h、120h、144h時做菌液PCR反應，檢測質粒的穩定性。`
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母基因工程菌為含有重組質粒pYES2_a -G13的釀酒酵母基因工程菌，所述重組質粒pYES2_a -G13表達抗菌肽Gl3。
【文檔編號】C12N15/01GK103555710SQ201310519928
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】查向東, 馬利娟, 趙大偉, 余忠麗, 車媛媛, 徐雪嬌 申請人:貴州省福泉市福中福農牧有限公司