Il-2和mart-1雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和IL-2基因；所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本發明所述的雙基因共表達重組載體，采用IRES序列來連接IL-2基因和MART-1基因，能夠在同一載體中同時表達人黑色素瘤分化抗原和人白細胞介素-2，該重組載體可用于黑色素瘤的基因免疫治療，既能發揮細胞因子的免疫調節作用，又能靶向性地針對黑色素瘤產生特異性抗腫瘤效應。
【專利說明】IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用
【技術領域】 [0001]本發明涉及一種重組載體及其制備方法和應用，特別是涉及一種雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]黑色素瘤(Melanoma),又稱惡性黑色素瘤(Malignant Melanoma,MM),是來源于神經嵴黑色素細胞的惡性腫瘤，多發生于皮膚體表，亦可見于脈絡膜、軟腦膜及消化道等，其惡性程度高，是體表腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。近年來,黑色素瘤的發病率及相應的死亡率在迅速增長，且發病年齡愈來愈早，嚴重威脅著人類的健康。
[0003]黑色素瘤的傳統治療,是包括手術、化療、免疫治療等在內的綜合治療。目前唯一有效的治療方法是在腫瘤厚度小于I毫米時通過手術切除腫瘤，但由于黑色素瘤的高度侵襲轉移性和對多種化療藥物的耐藥性，導致其療效不佳以及預后不良。針對腫瘤患者普遍存在免疫力低下的情況,通過免疫治療來誘導機體的特異性抗腫瘤免疫反應，以抑制腫瘤的生長、轉移及復發。近年來，攜帶外源特異性腫瘤抗原的疫苗已成為腫瘤免疫治療的新方向，包括基因疫苗、腫瘤細胞疫苗、細菌疫苗、病毒疫苗及樹突狀細胞疫苗等。其中，基因疫苗是通過特定載體將具有治療作用的基因導入細胞的治療方法；然而，基因治療只能短時間提高某種基因對應蛋白表達水平，其療效持續時間短，缺乏長期抗腫瘤能力。
[0004]腫瘤之所以能在體內增殖、轉移，是因為缺少MHC抗原等能激活T細胞的分子，因而不能被T細胞識別，無法激活T細胞介導的主動免疫。因此，要誘導強有力的抗腫瘤免疫應答，不僅需要腫瘤相關抗原的表達和呈遞，還需要增強共刺激分子和細胞因子介導的免疫作用。
[0005]人白細胞介素-2 (Interleukin-2, IL-2),又名T細胞生長因子(T Cell GrowthFactor，TCRF)。IL-2是在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下，由T淋巴細胞或T淋巴細胞系產生的在機體免疫反應中具有重要調節作用的一種細胞因子。IL-2是機體免疫調節網絡中的核心物質，與其他細胞因子有協同和拮抗作用，共同完成機體免疫機能的平衡調節作用；其能夠刺激NK、CTL、LAK細胞的活化和增殖，也能促使T淋巴細胞、NK細胞產生干擾素、腫瘤壞死因子等，因而能夠廣泛應用于抗病毒、抗細菌感染和抗腫瘤等疾病的治療。在惡性腫瘤的發病機制中，由于免疫功能低下，腫瘤病人體內的NK、CTL、LAK等殺傷細胞功能低下，不能正常地清除腫瘤細胞，而這些殺傷細胞的活化和增殖均是以IL-2為基礎的，此時必須提供外源IL-2，幫助病人完成免疫監視功能，這就是IL-2治療腫瘤的免疫學基礎。IL-2單獨使用或者與淋巴因子激活的殺傷細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞一起用于轉移性黑色素瘤的治療，取得了不錯的臨床效果。然而，目前的IL-2基因免疫治療方法只是局部地提高機體的IL-2蛋白表達水平，其免疫調節作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。
[0006]MART-1 (人黑色素瘤分化抗原)是黑素瘤分化的相關抗原，其參與黑素小體成熟，表達于黑素瘤和黑素瘤細胞系，在多數類固醇腫瘤(包括腎上腺皮質腫瘤)、黑色素細胞病變以及血管周細胞瘤中表達。MART-1有較強的免疫原性，易于被細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別，產生有效的抗腫瘤免疫應答，被認為是黑素瘤免疫治療的最佳候選者。
【發明內容】
[0007]基于此，有必要針對現有技術存在的缺陷，提供一種IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體，該重組載體可用于黑色素瘤的基因免疫治療，既能發揮細胞因子的免疫調節作用，又能靶向性地針對黑色素瘤產生特異性抗腫瘤效應。
[0008]本發明的另一個目的是，提供所述IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法。
[0009]本發明的再一個目的是，提供所述IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體在黑色素瘤免疫治療中的應用。
[0010]IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有IL_2基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和IL-2基因；所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。
[0011]在其中一個實施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為PIRES2-1L-2-MART-1重組載體；其中，IL-2基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。
`[0012]在其中一個實施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為PIRES2-MART-1-1L-2重組載體；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
[0013]本發明所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0014]I)獲得含有特異性酶切位點的IL-2基因片段或MART-1基因片段；
[0015]2)將步驟I)得到的IL-2基因片段或MART-1基因片段連接于載體，構建含有IL-2基因或MART-1基因的重組載體；
[0016]3)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或IL-2基因片段；
[0017]4)將步驟3)得到的MART-1基因片段或IL_2基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構建所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體。
[0018]在其中一個實施例中，所述的pIRES2-1L-2-MART-l重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0019]A)獲得含有特異性酶切位點的IL-2基因片段:從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位點序列的IL-2特異性引物進行PCR擴增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位點的IL-2基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0020]B)構建pIRES2-1L-2-EGFP重組載體:用限制性內切酶EcoR 1、BamH I分別酶切PIRES2-EGFP質粒以及步驟A)得到的IL-2基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到pIRES2-1L-2-EGFP重組載體；
[0021]C)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段:從黑色素瘤細胞A375獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應產物再進行雜交PCR反應，得到MART-1基因片段混合物，其中的一種MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；
[0022]D)構建pIRES2-1L-2-MART-l重組載體:用限制性內切酶BstX 1、Not I酶切步驟B)得到的pIRES2-1L-2-EGFP重組載體，將步驟C)得到的MART-1基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-1L-2-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-1L-2-MART-1 重組載體。
[0023]在其中一個實施例中，步驟A)所述的IL-2特異性引物為:
[0024]IL-2 上游引物:5’ -CCGGAATTCATGTACAGGATGCAACTCC-3’，
[0025]IL-2 下游引物:5 ’ -CGCGGATCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3 ’。
[0026]在其中一個實施例中，步驟C)所述的MART-1特異性引物包括MART-1第一引物對和MART-1第二引物對，所述的MART-1第一引物對由MART-1上游長引物和MART-1下游長引物組成，所述的MART-1第二引物對由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物組成:
[0027]MART-1第一引物對為:
[0028]MART-1 上游長引物:5’ -AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3’，
[0029]MART-1 下游長引物:5’-GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’ ；
[0030]MART-1第二引物對為:
[0031]MART-1 上游短引物:5’ -ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3’，
[0032]MART-1 下游短引物:5’ -GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3’。
[0033]在其中一個實施例中，所述的pIRES2-MART-l-1L-2重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0034]a)獲得含有特異性酶切位點的MART-1基因片段:從黑色素瘤細胞A375獲取cDNA作為模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位點序列的MART-1特異性引物進行PCR擴增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位點的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0035]b)構建pIRES2-MART-l-EGFP重組載體:用限制性內切酶Xho 1、EcoR II分別酶切pIRES2-EGFP質粒以及步驟a)得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-MART-1-EGFP重組載體；
[0036]c)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應產物再進行雜交PCR反應，得到IL-2基因片段混合物，其中的一種IL-2基因片段具有BstXI和Not I酶切粘性末端；
[0037]d)構建pIRES2-MART-l-1L-2重組載體:用限制性內切酶BstX 1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體，將步驟c)得到的IL-2基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MART-1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-MART-1-1L-2 重組載體。
[0038]在其中一個實施例中，步驟a)所述的MART-1特異性引物為:
[0039]MART-1 上游引物:5，-AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3，，
[0040]MART-1 下游引物:5，-CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3 ’。[0041]在其中一個實施例中，步驟c)所述的IL-2特異性引物包括IL-2第一引物對和IL-2第二引物對，所述的IL-2第一引物對由IL-2上游長引物和IL-2下游長引物組成，所述的IL-2第二引物對由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物組成:
[0042]IL-2第一引物對為:
[0043]IL-2 上游長弓丨物:5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0044]IL-2 下游長引物:5’-GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT-3’ ；
[0045]IL-2第二引物對為:
[0046]IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0047]IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
[0048]本發明所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體在黑色素瘤基因免疫治療中的應用。
[0049]在其中一個實施例中，將所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體轉染黑色素瘤患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內，進行黑色素瘤基因免疫治療。
[0050]本發明所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體，采用IRES序列來連接IL-2基因和MART-1基因，能夠在同一載體中同時表達人黑色素瘤分化抗原(MART-1)以及人白細胞介素-2 (IL-2)，可減少基因載體的用量，減少非治療相關的外源基因序列的引入。其中，MART-1是腫瘤靶向性的相關抗原，IL-2是發揮免疫調節作用的細胞因子，兩者聯合使用，既可以發揮細胞因子的 的免疫調節作用，又可以靶向性地產生特異性的抗腫瘤效應，從而能夠獲得更好的黑色素瘤免疫治療效果。將雙基因共表達重組載體轉染黑色素瘤患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內，MART-1的大量表達，可刺激樹突狀細胞遞呈MART-1多肽與MHC復合物，進而刺激機體免疫系統，產生特異性殺傷性T細胞，靶向性殺傷表達MART-1多肽的腫瘤細胞；而IL-2的大量表達，能進一步增強機體免疫調節能力，并能增強特異性T淋巴細胞的擴增能力和細胞活力，增強活化的T細胞產生干擾素，協同擴大抗腫瘤免疫效應。
[0051]IRES序列是來源于某些病毒和細胞mRNA5’端的一段非翻譯區，可以不依賴帽的方式啟動遠端的mRNA翻譯，可在上游啟動子的控制下和與之相連的基因共同轉錄，在同一轉錄本上翻譯出不同的蛋白。IRES連接多基因進行共表達時，多個基因的mRNA在同一條轉錄子上，但轉錄后的翻譯過程相互獨立，上游基因以傳統方式進行翻譯，下游基因依靠IRES序列以不依賴帽的方式進行翻譯，保證了各個基因的獨立結構及功能。利用IRES代替內部啟動子，不但可使多基因共表達載體大大縮小，而且還克服了傳統多基因表達載體中啟動子之間的相互抑制現象，避免融合蛋白的產生。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052]圖1為實施例一所得的含有特異性酶切位點序列的IL-2基因片段的電泳圖，其中，I為IL-2基因，M為標記；
[0053]圖2 為 pIRES2-EGFP 質粒圖譜；
[0054]圖3為實施例二所得的PIRES2-1L-2-EGFP重組載體圖譜；
[0055]圖4為實施例二所得的pIRES2-1L-2-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應產物，M為標記；[0056]圖5為實施例二所得的PIRES2-1L-2-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應產物，M為標記；
[0057]圖6為實施例三所得的帶有限制性內切酶粘性末端的MART-1基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴增產物A，2為PCR擴增產物B，M為標記；
[0058]圖7為實施例三所述的雜交PCR反應的流程圖；
[0059]圖8為實施例四所得的PIRES2-1L-2-MART-1重組載體圖譜；
[0060]圖9為實施例四所得的PIRES2-1L-2-MART-1重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，
I為EcoR I/BamH I雙酶切反應產物，2為BamH I/Not I雙酶切反應產物，3為EcoR I/NotI雙酶切反應產物，M為標記。
[0061]圖10為實施例五所得的含有特異性酶切位點序列的MART-1基因片段的電泳圖，其中，I為MART-1基因，M為標記；
[0062]圖11為實施例六所得的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體圖譜；
[0063]圖12為實施例六所得的PIRES2-MART-1-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應產物，M為標記；
[0064]圖13為實施例六所得的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應產物，M為標記；
[0065]圖14為實施例七所得的`帶有限制性內切酶粘性末端的IL-2基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴增產物C，2為PCR擴增產物D，M為標記；
[0066]圖15為實施例七所述的雜交PCR反應的流程圖；
[0067]圖16為實施例八所得的PIRES2-MART-1-1L-2重組載體圖譜；
[0068]圖17為實施例八所得的PIRES2-MART-1-1L-2重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，
I為Xho I/EcoR I雙酶切反應產物，2為EcoR I/Not I雙酶切反應產物，3為Xho I/Not I雙酶切反應產物，M為標記。
【具體實施方式】
[0069]下述實施例中，所用到的實驗技術，例如PCR技術、引物設計技術、載體構建技術、檢測技術、電泳技術等均為基因工程中的常規技術，本領域技術人員可根據現有技術實現(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，科學出版社第三版；或者按照產品說明書進行)。在操作過程中所用到的設備、試劑、載體、菌株等，均為通過市場購買得到的常規產品。
[0070]實施例一:獲取含有特異性酶切位點的IL-2基因片段
[0071]1、引物設計
[0072]根據IL-2基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)和pIRES2_EGFP質粒載體上預期插入的多克隆位點，設計特異性引物如下:
[0073]IL-2上游引物(如序列表中SEQ ID NO: 4所示):
[0074]5，-CCGGAATTCATGTACAGGATGCAACTCC-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點序列)，IL-2下游引物(如序列表中SEQ ID N0:5所示):
[0075]5，-CGCGGATCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3，(下劃線部分為 BamH I 酶切位點序列)。[0076]2、獲取cDNA模板
[0077]TRIzon法從CIK細胞(Cytokine-1nduced Killer,細胞因子誘導的殺傷細胞)或者人外周血分離的單個核細胞中，提取RNA (TRIzon總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，產品編號為CW0580)，并反轉錄成cDNA (反轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，產品編號為RR019A)。
[0078]3、獲取含有特異性酶切位點的IL-2基因片段
[0079]以所得到的cDNA為模板，在上述含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，通過PCR反應獲得IL-2基因片段，其上游含有EcoR I酶切位點序列，下游含有BamH I酶切位點序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電泳結果如圖1所示。
[0080]PCR反應體系如下(50 μ L):
[0081]
【權利要求】
1.1L-2和MART-1雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和IL-2基因; 所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根據權利要求1所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體，其特征在于:所述的載體為PIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2-1L-2-MART_l重組載體；其中，IL-2基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。
3.根據權利要求1所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體，其特征在于:所述的載體為PIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2-MART-l-1L_2重組載體；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
4.權利要求1所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟: O獲得含有特異性酶切位點的IL-2基因片段或MART-1基因片段； 2)將步驟I)得到的IL-2基因片段或MART-1基因片段連接于載體，構建含有IL-2基因或MART-1基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或IL-2基因片段； 4)將步驟3)得到的MART-1`基因片段或IL-2基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構建所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體。
5.權利要求2所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟: A)獲得含有特異性酶切位點的IL-2基因片段:從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位點序列的IL-2特異性引物進行PCR擴增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位點的IL-2基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； B)構建pIRES2-1L-2-EGFP重組載體:用限制性內切酶EcoR1、BamH I分別酶切PIRES2-EGFP質粒以及步驟A)得到的IL-2基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到pIRES2-1L-2-EGFP重組載體； C)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段:從黑色素瘤細胞A375獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應產物再進行雜交PCR反應，得到MART-1基因片段混合物，其中的一種MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； D)構建pIRES2-1L-2-MART-l重組載體:用限制性內切酶BstX1、Not I酶切步驟B)得到的pIRES2-1L-2-EGFP重組載體，將步驟C)得到的MART-1基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-1L-2-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-1L-2-MART-1 重組載體。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟A)所述的IL-2特異性引物為: IL-2 上游引物:5’ -CCGGAATTCATGTACAGGATGCAACTCC-3’， IL-2 下游引物:5’ -CGCGGATCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟C)所述的MART-1特異性引物包括MART-1第一引物對和MART-1第二引物對，所述的MART-1第一引物對由MART-1上游長弓丨物和MART-1下游長弓丨物組成，所述的MART-1第二引物對由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物組成: MART-1第一引物對為: MART-1 上游長引物:5’ -AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3’， MART-1 下游長引物:5’ -GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’ ； MART-1第二引物對為: MART-1 上游短引物:5’ -ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3’， MART-1 下游短引物:5’ -GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3’。
8.權利要求3所述的IL-2和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟: a)獲得含有特異性酶切位點的MART-1基因片段:從黑色素瘤細胞A375獲取cDNA作為模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位點序列的MART-1特異性引物進行PCR擴增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位點的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； b)構建pIRES2-MART-l-EGFP重組載體:用限制性內切酶Xho1、EcoR II分別酶切PIRES2-EGFP質粒以及步驟a)得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-MART-1-EGFP重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應產物再進行雜交PCR反應，得到IL-2基因片段混合物，其中的一種IL-2基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)構建pIRES2-MART-l-1L-2重組載體:用限制性內切酶BstX1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體，將步驟c)得到的IL-2基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MART-1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-MART-1-1L-2 重組載體。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟a)所述的MART-1特異性引物為: MART-1 上游引物:5’ -AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3’， MART-1 下游引物:5’ -CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟C)所述的IL-2特異性引物包括IL-2第一引物對和IL-2第二引物對，所述的IL-2第一引物對由IL-2上游長引物和IL-2下游長引物組成，所述的IL-2第二引物對由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物組成: IL-2第一引物對為: IL-2 上游長引物:5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’， IL-2 下游長引物:5’ -GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT-3’ ； IL-2第二引物對為: IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
【文檔編號】C12N15/66GK103555763SQ201310571900
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】栗炳南, 豐慧根, 左百樂, 林俊堂, 曹毓林 申請人:新鄉醫學院