用于潰瘍性結腸炎和相關疾病的抗tnf治療的生物標記物的制作方法

用于潰瘍性結腸炎和相關疾病的抗tnf治療的生物標記物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用于評估靶向療法的適用性和/或有效性的方法和試劑盒，該靶向療法用于受試者的與TNF介導相關的疾病，例如潰瘍性結腸炎，其中所述方法和試劑盒評價了在炎性腸胃疾病例如潰瘍性結腸炎中與抗TNF響應者相關的兩個或更多個基因表達量上調或下調的存在、不存在和/或程度。
【專利說明】用于潰瘍性結腸炎和相關疾病的抗TNF治療的生物標記物
[0001]本申請是以下申請的分案申請:申請日:2009年8月19日；申請號:200980133805.0 ;發明名稱:同上。
[0002]在先申請
[0003]本專利申請要求提交于2008年8月25日的美國專利申請Serial N0.61/091, 641的優先權，所述專利申請全文以引用方式并入本文。
【技術領域】
[0004]本發明涉及表征TNF介導的疾病(例如潰瘍性結腸炎)的表達譜和核酸的鑒別，以及該表達譜和核酸在診斷潰瘍性結腸炎和相關疾病中的用途。本發明還涉及用于鑒別、使用和測試調節潰瘍性結腸炎的候選試劑和/或靶點的方法。
【背景技術】
[0005]使用生物制劑治療潰瘍性結腸炎存在很多挑戰。確定要研究哪個患者群、預測哪些受試者會響應治療以及哪些受試者在治療后喪失響應，這些問題對治療和臨床研究設計具有重大影響。生物標記物可用于解決這些問題。
[0006]生物標記物被定義為可客觀測量和評價的特征，其作為一種指示物，可指示正常的生物過程、致病過程或對治療干預的藥理反應(Biomarkers Working Group, 2001年,見下文)。最近，生物標記物還被定義為這樣的蛋白質:其表達的改變可與疾病或疾病發展的風險增加相關，或可預測疾病對給定治療的響應。
[0007]腫瘤壞死因子a (TNFa)是先天性免疫反應中的一種重要細胞因子，其在適應性免疫系統激活前提供對抗侵入生物體的即刻宿主防御。TNFa表達為跨膜前體，其經蛋白酶解加工而形成可溶性三聚物。TNF的膜結合形式和可溶形式兩者與其受體TNFRSF1A和TNFRSF1B (也分別稱為TNFRl和TNFR2)的結合引發了幾種其他前炎性細胞因子和一般性炎癥標記物的表達。TNFa是已知的許多免疫介導的慢性炎性疾病的介體。
[0008]存在許多TNFa的生物拮抗劑，例如英夫利昔單抗{Kemiciide").戈利木單抗
(Simponi*),阿達木單抗^^謂遍織?)?以及依那西普pnbrel?),這些藥物已獲得批準可供
患者使用。主要機理是降低循環系統中TNF的水平，從而減輕全身炎癥、改善疾病的臨床征象，而不造成患者的全身免疫抑制。迄今為止，已表明它們在治療類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬性關節炎(PsA)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、銀屑病和強直性脊柱炎方面是有效的。
[0009]潰瘍性結腸炎(UC)是結腸的一種陣發性炎性腸疾病。UC的發病取決于遺傳因子、免疫反應、微生物感染和環境因子之間的相互作用，從而導致對通常存在于胃腸道中的細菌的異常反應。基因表達不僅控制整個疾病進程，還反映那些造成疾病活動期和疾病緩解期的臨床表現的過程。
[0010]目前的UC治療包括抗炎劑、免疫調節劑和抗腫瘤壞死因子a(TNFa)試劑(包括英夫利昔單抗)。英夫利昔單抗在患有UC的患者中引起并保持臨床反應和臨床緩解，如ACTl和ACT2試驗中所證實的。
[0011]盡管這些抗TNFd試劑中的任何一種都未獲批準用于治療潰瘍性結腸炎，但已經在炎性腸胃疾病的許多方面涉及了 TNFa。然而，在對于抗TNF療法的反應上存在個體差異，一些患者可能沒有獲得治療效果。據推測，多種遺傳變異可能在不同反應中起著關鍵作用。
[0012]因此，需要從血清或血漿中鑒別和表征新的基因標記物，這些新的基因標記物可用于開發診斷和治療免疫介導的炎性疾病(例如潰瘍性結腸炎，以及其他疾病和病癥)的方法，以及預測患者將如何響應治療干預的方法。

【發明內容】

[0013]本發明涉及用于診斷和/或治療潰瘍性結腸炎和/或相關疾病或病癥的方法或試劑盒，以及/或者用于預測治療用的候選試劑適用性的方法或試劑盒。本發明包括所關注的特定基因的發現，與對治療無反應的患者或用安慰劑治療的患者相比，對治療潰瘍性結腸炎有反映的患者(有效降低潰瘍性結腸炎的癥狀)中這些基因具有改良的表達水平。改良的表達水平構成了表達譜，該表達譜可用作可預測患者對治療的反應性的生物標記物譜和/或可提供優選的給藥途徑。
[0014]1.本文所公開的主題涉及在患有炎性腸胃疾病(例如潰瘍性結腸炎)的受試者中隨抗TNF治療上調或下調的一組基因(以及這些基因的表達)的遺傳相關性。上調或下調的基因包括BCL6 (基因庫登錄號AW264036 ;SEQ ID NO:118)和某基因(基因庫登錄號AI689210 ；SEQ ID NO: 123)，任選地還包括 C5AR1 (基因庫登錄號 NM001736 ;SEQ ID NO:119),FOLRl (基因庫登錄 號 U81501 ；SEQ ID NO:142)和 / 或 OSM (基因庫登錄號 A1079327 ；SEQ ID NO:173)，并且任選地還包括圖7中示出的基因(例如SEQ ID NO:110至203)。可以使用選自SEQ ID NO:1至109的一種或多種核酸探針檢測這些基因的表達譜。
[0015]受試者表現出對至少一種抗TNF a試劑(例如英夫利昔單抗、戈利木單抗、Enbrel?、Humira?，或其他抗TNF生物制劑或小分子藥物)的治療反應，其中受試者經診斷患有潰瘍性結腸炎或另一種腸胃疾病，例如(但不限于)克羅恩氏病、炎性腸道疾病等，包括輕度、中度、重度、小兒或成人類型，以及其他類型，例如(但不限于)類固醇抵抗型、甲氨蝶呤抵抗型或NSAID抵抗型的腸胃疾病。
[0016]在一個實施例中，本發明在評估候選試劑對治療潰瘍性結腸炎或相關疾病的有效性的方法中使用基因群(gene panel)，例如，在治療早期，治療的有效性不能通過癥狀或常規的疾病特征來衡量時。
[0017]在一個具體實施例中，本發明包括預測用于潰瘍性結腸炎的治療適用性的方法，該方法基于在治療之前構成該譜圖的一個或多個基因的基因表達模式。
[0018]另外，本發明包括通過評估基因群的這些TNF受體SNP中的一者或多者的表達譜，鑒別可作為用特定治療劑治療的候選者的患有潰瘍性結腸炎和/或相關疾病或病癥的受試者的方法。
[0019]在另一個實施例中，將潰瘍性結腸炎相關的基因譜用于產生目的為預后或診斷的基于陣列的方法，該方法包括:[0020]a)用從受試者獲得的樣本制備核酸樣品；以及
[0021]b)將此樣品與核酸片段群(例如SEQ ID NO:1-109)接觸，這些核酸片段群包括一部分BCL6 (基因庫登錄號AW264036 ;SEQ ID NO:118)基因和tx82a04.xl (基因庫登錄號 AI689210 ；SEQ ID NO: 123)，任選地還包括 C5AR1 (基因庫登錄號 NM001736 ；SEQ ID NO:119),FOLRl (基因庫登錄號 U81501 ；SEQ ID NO:142)和 OSM (基因庫登錄號 A1079327 ；SEQID NO:173)，任選地還包括在圖7或10中列出的基因(例如SEQ ID NO:110_203)，其在患有潰瘍性結腸炎或其他腸胃疾病(例如(但不限于)克羅恩氏病、炎性腸道疾病等，包括輕度、中度、重度、小兒或成人類型，以及其他類型，例如(但不限于)類固醇抵抗型、甲氨蝶呤抵抗型或NSAID抵抗型的腸胃疾病)的受試者中，對抗TNF α試劑(例如英夫利昔單抗、戈利木單抗、Enbrel?、Humira?,或其他抗TNF生物制劑或小分子藥物)有治療反應。
[0022]可任選地是，對基因SNP對應基因群的成員的表達水平變化進行統計分析，以評估這些變化的顯著性以及鑒別哪些成員為該基因群的有意義成員。
[0023]在一個可供選擇的實施例中，本發明包括一種試劑盒，其用于根據基因表達模式來預測候選試劑對治療潰瘍性結腸炎和/或相關疾病或病癥的適用性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:在英夫利昔單抗響應者和未響應者之間的基線通路分布分析(Baselinepathway distribution analysis)。對響應者和未響應者之間在基線處差異表達的基因進行的通路分布分析表示為，給定通路中的基因占具有基因本體注釋的輸入表內的基因的總數的百分比(X軸)。所有富集在統計上是顯著的(Fisher精確檢驗p值〈0.05)。
[0025]圖2:使用20探針組基線分類器進行的層次聚類。在英夫利昔單抗治療之前使用20探針組分類器對整個12個響應者與11個未響應者樣品進行的層次聚類。使用O附近的皮爾遜相關分析(GeneSpri`ng中的標準相關分析)算出了相似矩陣。
[0026]圖3:使用5探針組基線分類器進行的層次聚類。在英夫利昔單抗治療之前使用5探針組分類器對整個來自訓練集(A)的12個響應者與11個未響應者樣品或者8個響應者與16個未響應者進行的層次聚類。使用O附近的皮爾遜相關分析(GeneSpring中的標準相關分析)算出了相似矩陣。
[0027]圖4:5探針組分類器的英夫利昔單抗響應者/未響應者表達譜。對5探針組分類器的英夫利昔單抗響應者和未響應者進行比較的點圖表示。圖中示出了每個樣品的歸一化強度(黑圓點)。圖中還示出了針對5個基因中各基因的各個響應者和未響應者群體的中值強度、75和25百分率以及最小值和最大值。
[0028]圖5:使用20探針組分類器在8個響應者和16個未響應者之間進行的Leuven隊列層次聚類表明，4個錯誤分類的未響應者和I個錯誤分類的響應者的表達譜分別非常類似于響應者和未響應者。
[0029]圖6:用驗證隊列對ACTl進行比較的通用探針組和獨特探針組
[0030]圖7:基線IFX探針組分類器[0031 ] 圖8:基線IFX預測性簽名的特性
[0032]圖9:在分泌囊泡膜或中性多形核白細胞的質膜內表達的蛋白。
[0033]圖10.使用基線差異表達基因對IFXR和NR進行比較。[0034]圖11.使用在基線處差異表達的細胞因子和趨化因子對IFXR和NR進行比較。
【具體實施方式】
[0035]定義
[0036]多肽的“活性”、“生物活性”和“功能活性”是指潰瘍性結腸炎相關的基因群中的基因或基因編碼的蛋白響應其與另一蛋白質或分子的特異性相互作用而發揮的活性，這可根據標準技術在體內、原位或體外測定。這種活性可以是直接的活性(例如與第二蛋白質締合或對第二蛋白質的酶活性)，或間接活性(例如通過該蛋白質與第二蛋白質的相互作用或通過如胞內信號傳導或凝血級聯中的一系列相互作用介導的細胞過程)。
[0037]“抗體”包括任何含有這樣的分子的多肽或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如(但不限于)重鏈或輕鏈或其配體結合部分的至少一個互補決定區(CDR)、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恒定區、骨架區或它們的任何部分、片段或變體。術語“抗體”還旨在涵蓋抗體、其消化片段、特定部分或變體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其特定片段或部分的結構和/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。例如，抗體片段包括(但不限于)Fab (例如通過木瓜蛋白酶消化)、Fab’(例如通過胃蛋白酶消化和部分還原)以及F(ab’)2 (例如通過胃蛋白酶消化)、facb (例如通過纖溶酶消化)、pFc’(例如通過胃蛋白酶或纖溶酶消化)、Fd (例如通過胃蛋白酶消化、部分還原和重聚合)、Fv或scFv (例如通過分子生物學技術)片段、以及單域抗體(例如Vh或 ')，這些涵蓋于本發明(參見例如，Colligan 等人(編輯)，Current Protocols in Immunology, Johnffiley&Sons, Inc., NY(1994-2001) ;Colligan 等人，Current Protocols in PolypeptideScience, John ffiley&Sons, NY(1997-2001))。
[0038]如本文所用，術語“陣列”或“微陣列”或“生物芯片”或“芯片”是指包括多個固定的靶標單元的制品或裝置，每個靶標單元包括“克隆”、“特征”、“點”或包含特定組合物的限定區域，例如固定至固體表面的生物分子(如核酸分子或多肽)，如以下深入討論。
[0039]本發明核酸序列的“互補序列”或與本發明核酸序列“互補”是指與第一多核苷酸相比具有互補堿基序列和反向取向的多核苷酸分子。
[0040]如本領域已知的，“同一性”是兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關系，可通過將所述序列進行比較確定。在本領域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性，可通過這些序列的字符串之間的匹配來確定。“同一性”和“相似性”可容易地通過已知的方法計算，包括(但不限于)以下文獻中描述的方法:Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.(編輯)，Oxford UniversityPress,New York, 1988 ；Biocomputing:1nformatics and Genome Projects,Smith, D.ff.(編輯)，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, PartI, Griffin, A.M.和 Griffin, H.G.(編輯)，Humana Press, New Jersey, 1994 ；SequenceAnalysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 ;以及 SequenceAnalysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J.(編輯)，M Stockton Press, New York, 1991 ；以及 Carillo, H.和 Lipman, D.，SiamJ.Applied Math.，48:1073 (1988)。另外，同一性百分比的數值可從用 Vector NTI Suite8.0 (Informax, Frederick, MD)的 AlignX 組件的默認設置產生的氨基酸和核苷酸序列比對獲得。[0041]如本文所用，術語“與…特異性雜交”、“與…特異性雜交的”、“特異性雜交”和“與…選擇性雜交”是指在嚴格條件下核酸分子優先與特定核苷酸序列結合、形成雙鏈或雜交。術語“嚴格條件”是指在探針將優先雜交于其靶標序列并且在較小程度上或根本不雜交于其他序列的條件。在核酸雜交背景下(例如在陣列、DNA印跡雜交或RNA印跡雜交中)“嚴格雜交”和“嚴格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同環境參數下是不同的。以下詳細描述了可用于實施本發明的備選雜交條件。在可供選擇的方面，在溫和條件、嚴格條件和極度嚴格條件下進行雜交和/或洗滌，如以下更為詳細的描述。備選的洗滌條件也用于不同的方面，如本文更詳細描述的。
[0042]如本文所用，短語“標記的生物分子”或“用可檢測組合物標記的”或“用可檢測部分標記的”是指含有可檢測組合物(即標簽)的生物分子(如核酸)，如下文詳述。標簽也可為另一種生物分子，如核酸，例如作為“分子信標”的莖環結構形式的核酸，如下文所述。這包括通過例如切口平移、隨機引物延伸、用簡并引物擴增等，將標記的堿基(或可結合到可檢測標記的堿基)整合入核酸。可使用任何標簽，如化學發光標簽、放射標簽、酶標簽等等。可通過任何手段來檢測標簽，如肉眼檢測、光譜檢測、光化學檢測、生物化學檢測、免疫化學檢測、物理檢測、化學檢測和/或化學發光檢測。本發明可使用包含具有可檢測標簽的固定化核酸的陣列。
[0043]如本文所用，術語“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。該術語涵蓋含有已知的天然核苷酸類似物的核酸。術語“核酸”可與基因、DNA、RNA、cDNA、mRNA、寡核苷酸引物、探針和擴增產物互換使用。該術語也涵蓋DNA主鏈類似物，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3’ -硫縮醛、亞甲基(甲基亞氨基)、3’ -N-氨基甲酸酯、嗎啉代氨基甲酸酯和肽核酸(PNA)。
[0044]如本文所用，術語“樣品”或“核酸樣品”是指含有DNA或RNA的樣品，或代表從天然來源分離的DNA或RNA的核酸。“核酸樣品”為適合雜交到另一個核酸(例如固定化探針)的形式(例如作為可溶性`水溶液)。樣品核酸可從特定的細胞或組織分離、克隆或提取。用于制備核酸樣品的細胞或組織樣品通常取自患有或疑似患有UC或相關疾病或病癥的患者。分離細胞和組織樣品的方法為本領域的技術人員所熟知，包括(但不限于)抽吸、組織切片、穿刺活檢等。通常，樣品為“臨床樣品”，即源自患者的樣品，包括組織切片，例如取自用于組織學目的的冷凍切片或石蠟切片。樣品也可源自(細胞的)上清液或可以是取自患者或細胞培養物的細胞本身、組織培養的細胞以及其中可期望檢測到對候選藥物的響應的其他介質。在一些情況下，可用標準技術(例如PCR)在雜交前擴增核酸。探針可產生自并且可共同代表來自一個或多個特定(預先選擇)部分的(例如)聚合酶鏈反應(PCR)擴增產物集合的核酸來源，其基本上是整個染色體或染色體片段，或基本上是整個基因組，例如克隆集合的形式(例如BAC、PAC、YAC等等)(參見下文)。
[0045]“核酸”為核苷酸的聚合物，其中核苷酸包含與糖連接的堿基，糖繼而通過一居間的至少二價的分子(例如磷酸)彼此連接。天然存在的核酸中，糖為2’-脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)。非天然多核苷酸或寡核苷酸含有經修飾的堿基、糖或連接分子，但通常被認為模仿了天然存在的核酸的互補性(非天然多核苷酸或寡核苷酸仿照此而設計)。非天然寡核苷酸的一個例子為具有硫代磷酸酯主鏈的反義分子組合物。“寡核苷酸”通常是指具有少于30個核苷酸的核酸分子。
[0046]術語“譜”意指模式并與多個特征的變化幅度和方向有關。譜可被嚴格地判讀，即要求其中在譜內顯示特性的特征的幅度和/或數量的變化基本上類似于參考譜，或其可被不太嚴格地判讀，例如要求一種趨勢而不要求全部特征特性或其子集的絕對匹配。
[0047]術語“蛋白質”、“多肽”和“肽”包括“類似物”或“保守變體”和“模擬體”或“擬肽”，其具有的結構和活性大致對應于所述變體從其衍生的多肽，如上文詳細描述的。
[0048]“多肽”為通過肽鍵接合的氨基酸殘基的聚合物，肽通常是指含有12個或更少殘基的氨基酸聚合物。肽鍵可通過核酸模板引導而天然產生或用本領域熟知的方法合成而產生。
[0049]“蛋白質”為包含一個或多個多肽鏈的大分子。蛋白質還可包含連接至不參與肽鍵形成的氨基酸側基的取代基。通常，通過真核細胞表達形成的蛋白質還含有碳水化合物。在本文中蛋白質是按其氨基酸序列或主鏈來定義，不指定取代基，無論是否已知。
[0050]術語“受體”表示能夠通過與特定配體或結合伴侶相互作用而影響例如細胞內的生物活性的分子。細胞膜結合受體通過胞外配體結合結構域、一個或多個跨膜或穿膜結構域以及通常涉及信號轉導的胞內效應結構域來表征。配體結合至細胞膜受體可引起胞外域變化，這些變化被橫跨細胞膜傳遞，與一個或多個胞內蛋白質直接或間接相互作用，并改變細胞的特性，例如酶活性、細胞形狀或基因表達譜。受體也可不固定到細胞表面，并可以是胞質受體、核受體，或一起從細胞釋放。非細胞相關受體稱為可溶性受體或配體。
[0051]無論是否相應地明確指出，本文引用的所有出版物或專利的全文均以引用方式并入本文中，因為它們顯示了本發明時的技術水平和/或提供了本發明的描述和使本發明得以實現。出版物是指任何科學出版物或專利公布，或可以任何媒體形式獲得的任何其他信息，所述媒體形式包括所有記錄形式、電子形式或印刷形式。以下參考文獻全部以引用方式并入本文中:Ausubel 等人(編輯),Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons, Inc., NY(1987-2008) ；Sambrook 等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor, NY(1989) ;Harlow和Lane,antibodies, aLaboratoryManual, Cold Spring Harbor, NY(1989) ;Colligan 等人(編輯)，Current Protocols inImmunology, John ffiley&Sons, Inc., NY(1994-2008) ;Colligan 等人，Current Protocolsin Protein Science, John ffiley&Sons, NY(1997-2008)?
[0052]基因群鑒別和驗證
[0053]本發明提供了用于篩選可調節潰瘍性結腸炎癥狀的分子的新方法。本發明公開了在患有炎性腸胃疾病(例如潰瘍性結腸炎)中隨抗TNF響應者上調或下調的一組基因的遺傳相關性，其中BCL6 (基因庫登錄號AW264036 ；SEQ ID NO:118)和tx82a04.xl (基因庫登錄號AI689210 ;SEQ ID NO: 123)，任選地還包括C5AR1 (基因庫登錄號NM001736 ;SEQ IDNO:119),F0LR1 (基因庫登錄號 U81501 ；SEQ ID NO:142)和 OSM (基因庫登錄號 A1079327 ;SEQ ID NO: 173)，任選地還包括圖7所示的基因(例如SEQ ID NO:110_203)，其在患有潰瘍性結腸炎或其他腸胃疾病(例如(但不限于)克羅恩氏病、炎性腸道疾病等，包括輕度、中度、重度、小兒或成人類型，以及其他類型，例如(但不限于)類固醇抵抗型、甲氨蝶呤抵抗型或NSAID抵抗型的腸胃疾病)的受試者中，對抗TNFa試劑(例如英夫利昔單抗、戈利木單抗、Enbrel?、Humira?,或其他抗TNF生物制劑或小分子藥物)有治療反應。[0054]對于這些僅在疾病組織中或響應抗TNF治療而被差異表達的序列(基因序列或在下文中稱作“潰瘍性結腸炎相關基因序列”)的鑒別，使得該信息能夠以多種方式被使用。例如，可用由UC相關生物標記物基因的表達譜提供的信息來評估特定治療方案。
[0055]這可通過制備含有與這些序列互補的序列組的生物芯片來完成，該生物芯片隨后可用于這些篩選(例如SEQ ID NO:l-109)o也可在蛋白質基礎上實施這些方法，也就是說，可對這些潰瘍性結腸炎相關基因產物蛋白的蛋白表達水平進行評估，以用于診斷目的或選擇抗TNF治療響應者或用于篩選另外的候選治療劑。另外，在治療前，可用包含潰瘍性結腸炎相關基因譜的核酸序列測量患者是否可能對治療有反應。
[0056]潰瘍性結腸炎相關基因序列可包括核酸序列和氨基酸序列這兩者。在一個優選的實施例中，潰瘍性結腸炎相關基因序列是重組核酸。本文中所謂術語“重組核酸”是指通常通過聚合酶和核酸內切酶操作核酸而最初形成于體外且為一般不存在于自然界中的形式的核酸。因此，對本發明來說，分離的核酸(為線性形式)或通過連接在正常情況下不接合的DNA分子而形成于體外的表達載體這兩者均被認為是重組的。應當理解，重組核酸一經制成并重新引入宿主細胞或生物體后，它就會以非重組方式復制，即，使用宿主細胞的體內細胞機器而非體外操作來復制；然而，對本發明而言，此類核酸一旦被重組產生，即使隨后會以非重組方式復制，也仍然被認為是重組的。
[0057]實施本發明的方法
[0058]本發明提供了基于體外、原位、或計算機、核酸、蛋白質和/或陣列的方法，這些方法依賴兩份或更多份樣品中的結合分子的相對量(例如核酸序列)。也提供了計算機實現的方法，用于確定兩份或更多份樣品中的結合分子的相對量(例如核酸序列)，并使用確定的相對結合量來預測對具體療法的反應性，以及監控和增強治療處理。
[0059]在實踐本發明的方法時，標記的生物分子(例如核酸)的一種或多種樣品被用于兩個或更多個檢測分析或陣列，其中該檢測分析或陣列具有基本上相同的固定化結合分子的互補序列(例如能夠雜交到`標記的樣品核酸上的固定化核酸)。所述兩個或更多個陣列通常為相同陣列的多個拷貝。然而，因為陣列上的各個“點”、“克隆”或“特征”具有相似的生物分子(如相同序列的核酸)，并且各個點中的生物分子(如核酸)是已知的(這是核酸或其他陣列的典型特征)，用于本發明的多個陣列在構造上不必相同，只需要每個特征在基片上的位置是已知的，即具有一個地址。因此，在一方面，將樣品中的多個生物分子(例如核酸)相對地結合到該陣列(例如同時雜交)，并且將收集的信息進行編碼以便使結果基于該特征的內在性質(例如核酸序列)而不是在該基片上的位置。
_0] 核酸的擴增
[0061] 一些熟知的采用寡核苷酸引物的核酸擴增方法可用于產生用于本發明組合物和方法的核酸，以檢測或測量雜交至陣列的測試樣品或對照樣品的水平等，例如檢測本發明的TNFR SNP多態性的存在。技術人員可選擇和設計合適的寡核苷酸擴增引物。擴增方法也是本領域所熟知的，并且包括(例如)聚合酶鏈反應(PCR) (PCR PROTOCOLS, A⑶IDETO METHODS AND APPLICATIONS, Innis (編輯)，Academic Press, N.Y.(1990)和 PCRSTRATEGIES (1995)，Innis (編輯)，Academic Press, Inc.，N.Y.)、連接酶鏈反應(LCR)(參見例如 Wu (1989) Genomics4:560 ；Landegren (1988) Science241:1077 ；Barringer (1990)Gene89:117)、轉錄擴增(參見例如 Kwoh (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173)、以及自主序列復制(參見例如 Guatelli (1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874)、Qβ 復制酶擴增(參見例如 Smith(1997) J.Clin.Microbiol.35:1477-1491)、自動復制酶擴增測定(參見例如Burg(1996)Mol.Cell.Probesl0:257_271)以及其他RNA聚合酶介導的技術(例如 NASBA，Cangenej Mississauga, Ontario);還可參見 Berger (1987)MethodsEnzymol.152:307-316 ；Sambrook ；Ausubel ;美國專利 N0.4，683，195 和 4，683，202 ；Sooknanan (1995)Biotechnology13:563-564。
_2] 核酸雜交
[0063]在實施本發明的方法時，使核酸的測試樣品和對照樣品與(例如)陣列上的固定化核酸探針雜交。在可供選擇的方面，在溫和條件、嚴格條件和極嚴格條件下進行雜交和/或洗漆。核酸雜交的詳盡指南可在例如Sambrook Ausubel, Ti jssen的文章中找到。通常,對于在確定離子強度和PH下的特定序列，將高嚴格雜交和洗滌條件選擇為低于熱熔點(Tm)約5°C。Tm為50%的靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和pH下)。對于特定的探針，將極嚴格條件選擇為等于Tm。用于互補核酸(在陣列上或在DNA印跡或RNA印跡的濾膜上具有超過100個互補殘基)雜交的嚴格雜交條件的例子為在42°C下使用標準雜交溶液(參見例如Sambrook)進行過夜雜交。高嚴格洗滌條件的例子為在72°C下用0.15M NaCl洗滌約15分鐘。嚴格洗滌條件的例子為在65°C下用0.2 X SSC洗滌15分鐘(參見例如Sambrook)。通常，在高嚴格洗滌之前用中等或低嚴格洗滌去除背景探針信號。用于例如多于100個核苷酸的雙鏈的中等嚴格洗滌的例子是在45°C下用I X SSC洗滌15分鐘。用于(例如)多于100個核苷酸的雙鏈的低嚴格洗滌的例子是在40°C下用4X至6XSSC洗滌15分鐘。
[0064]在本發明的組合物和方法的可供選擇的方面，例如在比較核酸雜交的實施中，例
如用陣列進行比較基因組雜交(CGH)時，使用熒光染料Cy3RlPCy5e來差異性標記來自
兩個樣品的核酸片段，例如固定于陣列的核酸和樣品核酸、或者產生自對照細胞或組織的核酸和產生自測試細胞或組織的核酸。許多商品化的儀器設計成適于這兩種染料的檢測。
為了增加CyS'熒光染料或其他氧化敏感性化合物的穩定性，可在雜交混合物、雜交溶液
和/或洗滌溶液中使用抗氧化劑和自由基清除劑。因此，Cy5:@信號顯著增加，并且更長的
雜交時間成為可能。參見W00194630A2和美國專利申請N0.20020006622。
[0065]可在受控的不飽和濕度環境下進行雜交以增加雜交靈敏度；因此，當濕度不飽和時雜交效率得到顯著改善。參見W00194630A2和美國專利申請N0.20020006622。如果濕度是動態控制的，即如果濕度在雜交期間改變，那么雜交效率可得到改善。在動態平衡的濕度環境下將促進傳質。雜交環境中的濕度可逐步調節或連續調節。可使用包括殼體和控制器的陣列裝置，所述殼體和控制器使操作者能控制預雜交、雜交、洗滌和/或檢測步驟期間的濕度。該裝置可具有檢測、控制和存儲元件以使得能對濕度和溫度控制(其為恒定和精確的或為波動的)進行預先編程，以及整個程序循環期間(包括預雜交、雜交、洗滌和檢測步驟)的其他參數進行預先編程。參見W00194630A2和美國專利申請N0.20020006622。
[0066]本發明的方法可包括具有滲透性波動的雜交條件。雜交效率(即達到平衡的時間)也可通過包含變化的高滲透性/低滲透性(例如溶質梯度)的雜交環境來提高。在裝置中產生溶質梯度。例如，將低鹽雜交溶液置于陣列雜交室的一側，而將較高濃度的鹽緩沖液置于另一側，從而在室中產生溶質梯度。參見W00194630A2和美國專利申請N0.20020006622。_7] 封閉重復核酸序列進行雜交的能力
[0068]本發明的方法可包括封閉重復核酸序列在固定化核酸片段中進行雜交的能力(SP封閉“雜交能力”)的步驟。可通過將樣品核酸序列與未標記的或標記的重復核酸序列混合而封閉樣品核酸序列中重復核酸序列的雜交能力。可將樣品核酸序列在與固定在陣列上的核酸片段接觸的步驟前，與重復核酸序列混合。封閉序列為(例如)Cot-lDNA、鮭魚精DNA或特異性的重復基因組序列。重復核酸序列可以是未標記的。使用(例如)使用例如Cot-1來移除和/或去能重復序列的雜交容量的多種方法是已知的；參見(例如)Craig(1997)Hum.Genet.100:472-476 ;W093/18186。使用磁性純化和親和力PCR可從文庫探針中去除重復DNA 序列，參見(例如)Rauch (2000) J.Biochem.Biophys.Methods44:59-72。
[0069]陣列一般是固定在平板表面上的定義為“點”或“簇”或“特征”的多個靶標單元，其中每個靶標單元包含一個或多個生物分子(例如核酸或多肽)，該分子固定在固體表面，用于特異性結合(例如雜交)到樣品中的特定分子。固定化核酸可以包含來自特定信息(例如作為cDNA文庫)或基因(例如基因組文庫，包括人類基因組)的序列。其他靶標單元可含有參照序列等。陣列的生物分子可以不同的大小和不同的密度排列在固體表面上。生物分子在簇中的密度和簇在陣列上的數量取決于多種因素，例如標簽的性質、固體載體、基片表面的疏水性程度等。各個特征可以包含基本上相同的生物分子(例如核酸)，或生物分子的混合物(例如不同長度和/或序列的核酸)。因此，例如一個特征可含有多于一個拷貝的DNA克隆片段，并且每個拷貝可斷裂成不同長度的片段。
[0070]其上固定有生物分子(例如核酸)的陣列基片表面可包括硝化纖維、玻璃、石英、熔融二氧化硅、塑料等等，如下文深入論述。本發明的組合物和方法可以整體地或部分地包含陣列的設計以及相關組分 和方法，例如在美國專利N0.6，344，316 ;6，197，503 ;6，174，684 ；6，159，685 ;6，156，501 ;6，093，370 ;6，087，112 ;6，087，103 ;6，087，102 ;6，083，697 ；6，080，585 ;6，054，270 ;6，048，695 ;6，045，996 ;6，022，963 ;6，013，440 ;5，959，098 ；5，856，174 ;5，843，655 ;5，837，832 ;5，770，456 ;5，723，320 ;5，700，637 ;5，695，940 ；5，556，752 ;5，143，854 中所述；還可參見例如 W099/51773 ；W099/09217 ；W097/46313 ；W096/17958 ；W089/10977 ；還可參見例如 Johnston(1998)Curr.Biol.8:R171-174 ；Schummer(1997)Biotechniques23:1087-1092 ；Kern(1997)Biotechniques23:120-124 ；Solinas-Toldo(1997)Genes, Chromosomes&Cancer20:399-407 ；Bowtell (1999)NatureGenetics Supp.21:25-32 ；Epstein (2000)Current Opinion in Biotech.11:36-41 ;Mendoza(1999Biotechniques27:778-788 ;Lueking(1999)Anal.Biochem.270:103-111 ；Dav ies (1999)Biotechniques27:1258-1261。
[0071 ] 基片表面
[0072]可用于本發明組合物和方法的基片表面包括(例如)玻璃(參見例如美國專利N0.5，843，767)、陶瓷和石英。陣列可具有剛性、半剛性或撓性材料的基片表面。基片表面可以是平坦的或平面的，也成形為深凹、凸起區域、蝕刻溝槽、孔、小珠、細絲等。基片表面還可包括各種材料，例如硝化纖維、紙張、晶體基片(例如砷化鎵)、金屬、準金屬，聚丙烯酰嗎
啉、多種塑料和塑料共聚物、Nylon?、Teflon?、聚乙烯、聚丙烯、乳膠、聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、人造絲、尼龍、聚(丁酸乙烯酯)和乙酸纖維素。可對基片進行涂覆，可使基片和涂層官能化以(例如)使得能與胺結合。
[0073]包含校[H序列的陣列
[0074]本發明仔細考慮了包含使基于陣列的雜交反應的結果歸一化的固定化校正序列的陣列以及采用這些校正序列的方法的應用，例如用以確定校正序列的拷貝數，從而“歸一化”或“校正”比率分布。該校正序列可與陣列上固定化的核酸序列中的獨特序列大致相同。例如，來自陣列上每個“點”或“生物位點”的“標記物”序列(其僅位于該點，從而使其成為該點的“標記物”)用一個或多個“對照”或“校正”點上的對應序列表示。
[0075]用“對照點”或“校正點”來“歸一化”以提供可靠并且可重復的信息。對照點可提供一致的結果，而與雜交到陣列的標記樣品(或來自樣品的標記結合分子)無關。對照點可用于產生“歸一化”或“校正”曲線以抵消本發明的基于計算機的、基于陣列的方法中使用的兩個陣列(或更多)之間可能的強度誤差。
[0076]在陣列上產生對照的一種方法可以是使用被點樣到該陣列上的所有生物分子(例如核酸序列)的等摩爾混合物并產生一個單點。該單點將具有與來自陣列上所有其他點的生物分子(例如核酸序列)相等的量。可通過改變該等摩爾混合物的濃度來產生多個對照點。
[0077]樣品和樣本
[0078]樣品核酸可從特定的細胞、組織或其他樣本中分離、克隆或提取。用于制備核酸樣品的細胞或組織樣品通常取自患有或疑似患有潰瘍性結腸炎或相關病癥的患者。分離細胞和組織樣品的方法為本領域的技術人員所熟知，包括(但不限于)抽吸、組織切片、穿刺活檢等。通常，樣品為“臨床樣品”，即源自患者的樣品，包括全血、血清、血漿或組織切片，例如取自用于組織學目的的冰凍切片或石蠟切片。樣品也可源自(細胞的)上清液或可以是取自患者或細胞培養物的細胞本身、組織培養的細胞以及其中可期望檢測到對候選藥物的響應的其他介質。在一些情況下，可用標準技術(例如PCR)在雜交前擴增核酸。
[0079]在一個實施例中，本發明為預測疾病消退或治愈的治療前方法。該方法包括:(I)從診斷患有潰瘍性結腸炎或相關疾病或病癥的個體取合適的組織活檢或其他樣本，(2)測量基因群中譜圖基因的表達水平，(3)將基因的治療前的表達水平與來自治療響應者的治療前的參照譜進行比較，以及(4)通過監測基因群的表達水平來預測治療反應。
_0] 評估生物標記物實用性的方法
[0081]本發明生物標記物基因群用于評估患者對治療的響應或疾病預后的實用性可通過使用其他評估患者疾病狀態的方法來驗證。例如，可通過某種成像方法評估并記錄疾病的總測量結果，例如(但不限于):通過攝影、輻射測量或磁共振技術成像來進行。健康或疾病的綜合指標還包括血清或血液組成(蛋白質、肝酶、pH、電解質、紅細胞容積、血細胞比容、血紅蛋白或特異性蛋白質)。然而，在一些疾病中，病因學還不是很清楚。潰瘍性結腸炎是此類疾病的一例。
[0082]患者的評 估與監察
[0083]還未曾在潰瘍性結腸炎或其他腸胃疾病的治療中研究在治療過程中的基因表達模式，并且沒有一個被確認為具有預測價值。本文所公開的基因表達生物標記物群使得能建立快速可靠的預測方法、預測潰瘍性結腸炎試驗的臨床效果的診斷工具或跟蹤潰瘍性結腸炎治療功效的預后工具。提供了基于檢測樣品中這些基因的預后方法。例如，可將這些組合物與一系列免疫介導的炎性疾病的診斷、預防和治療結合使用。
[0084] 治療劑_5] 拮抗劑
[0086]如本文所用，術語“拮抗劑”是指這樣一類物質，其可抑制或中和本發明的潰瘍性結腸炎相關的基因群的基因產物的生物活性。此類拮抗劑可以多種方式達到這種效果。一類拮抗劑會以足夠的親和力和特異性與所述基因產物蛋白結合，以中和該蛋白質的生物效應。包括在這類分子中的是抗體和抗體片段(例如，F(ab)或F(ab’)2分子)。另一類拮抗劑包括基因產物蛋白的片段、突變蛋白或小有機分子(即擬肽)，此類拮抗劑會結合至所述基因產物的同源結合伴侶或配體，由此抑制基因產物與其同源配體或受體的特異性相互作用的生物活性。潰瘍性結腸炎相關基因拮抗劑可以是這些類別中的任何一類，只要其為可抑制所述基因產物的一種生物活性的物質。
[0087]拮抗劑包括針對基因產物蛋白或其片段的一個或多個區域的抗體、針對同源配體或受體的抗體、以及可抑制基因產物一種生物活性的基因產物的部分肽或其同源配體。另一類拮抗劑包括本領域已知并在本文公開的靶向基因序列的siRNA、shRNA、反義分子和DNA 酶。
[0088]合適的抗體包括那些與阻礙潰瘍性結腸炎相關基因產物激活或防止潰瘍性結腸炎相關基因產物結合到其同源配體或阻止潰瘍性結腸炎相關基因產物信號轉導的單克隆抗體競爭，以結合到潰瘍性結腸炎相關基因產物上的抗體。
[0089]靶向潰瘍性結腸炎相關基因產物誘導劑的治療劑可提供更大的成功機會。基因表達可以幾種不同的方式調節，包括使用siRNA、shRNA、反義分子和DNA酶。合成的siRNA、shRNA和DNA酶可被設計成特異性地靶向一個或多個基因并且它們可容易地導入體外或體內的細胞中。`
[0090]本發明涵蓋反義核酸分子，即與將潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽編碼的正義核酸互補的分子，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補。因此，反義核酸可與正義核酸以氫鍵結合。反義核酸可與整個編碼鏈互補或只與其一部分互補，例如與全部或部分蛋白編碼區(或開放讀框)互補。反義核酸分子可與將潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽編碼的核酸序列的編碼鏈的非編碼區的全部或部分是反義的。非編碼區(“5’和3’非翻譯區”)為位于編碼區兩側的5’和3’序列并且不翻譯成氨基酸。
[0091 ] 本發明還提供嵌合蛋白或融合蛋白。如本文所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的全部或(優選地具生物活性的)部分，所述潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽可有效連接到異源多肽(即除了相同UC相關基因產物多肽之外的多肽)上。在融合蛋白中，術語“有效連接”用于表示潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽與異源多肽彼此框內融合。異源多肽可融合至潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的氨基端或羧基端。在另一個實施例中，潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽或其結構域或活性片段可與異源蛋白質序列或其片段融合而形成嵌合蛋白，其中所述多肽、結構域或片段不是首尾相連地融合而是插入于異源蛋白骨架中。
[0092]在另一個實施例中，融合蛋白為免疫球蛋白融合蛋白，其中潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的全部或部分融合至源自免疫球蛋白家族成員的序列。可將本發明的免疫球蛋白融合蛋白摻入藥物組合物中并施用給受試者以抑制配體(可溶性的或膜結合的)和細胞表面上的蛋白質(受體)之間的相互作用，從而抑制體內的信號轉導。免疫球蛋白融合蛋白可用于影響潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的同源配體的生物利用率。抑制配體/受體相互作用在治療學上可以是有用的，既可用于治療增殖性和分化性疾病，又可用于調節(例如促進或抑制)細胞存活。此外，本發明的免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原來產生針對受試者中的潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的抗體，以純化配體以及用于篩選試驗以鑒別可抑制受體與配體相互作用的分子。
[0093]組合物及其用途
[0094]根據本發明，中和抗潰瘍性結腸炎相關基因產物的拮抗劑，例如本文所述的單克隆抗體，可用于抑制潰瘍性結腸炎相關基因產物的活性。另外，此類拮抗劑可用于抑制適合用此類拮抗劑治療的潰瘍性結腸炎和相關炎性疾病的發病，這些疾病包括(但不限于)風濕性疾病。待治療的個體可以是任何哺乳動物，優選靈長類、屬于哺乳動物的伴侶動物，最優選人類患者。所施用的拮抗劑的量可根據其使用目的和施用方法而變化。
[0095]潰瘍性結腸炎相關基因產物的拮抗劑，可用多種可在期望病理活性被預防或終止的組織中產生效果的方法加以施用。此外，抗潰瘍性結腸炎相關基因產物的拮抗劑無需在局部施用于賦予對潰瘍性結腸炎相關基因產物活性的效果，因此，可將它們施用到可實現與含有潰瘍性結腸炎相關基因產物的體腔或流體接觸的任何部位。就發炎的、惡性的或者說是受損的組織而言，這些方法可包括直接施用含有所述拮抗劑的制劑。這些方法包括靜脈注射液體組合物、透皮施用液體或固體制劑、口服、局部施用或間質施用或術間施用。給藥可以通過植入其主要功能不 是用作藥物遞送載體的裝置來完成。
[0096]對于抗體，優選的劑量為約0.lmg/kg至100mg/kg體重(通常為約10mg/kg至20mg/kg)o如果抗體是在腦中起作用，則約50mg/kg至100mg/kg的劑量通常是合適的。一般地，部分人抗體和全人抗體在人體中具有比其他抗體更長的半衰期。因此，采用較低劑量和較低頻率的給藥通常是可能的。可用修飾(例如脂化)來穩定抗體并增加攝取和組織滲透(例如滲透進腦中)。Cruikshank等人描述了抗體脂化的方法((1997) J.Acquired ImmuneDeficiency Syndromes and Human Retrovirologyl4:193)。
[0097]可將潰瘍性結腸炎相關基因產物的拮抗劑核酸分子插入載體中并用作基因療法載體。基因療法載體可通過(例如)靜脈注射、局部施用(美國專利N0.5，328，470)，或通過立體定位注射(參見例如 Chen 等人，(1994) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:3054-3057)遞送給受試者。基因療法載體的藥物制劑可包括可接受稀釋劑中的基因療法載體，或可包含其中嵌入了基因遞送載體的緩釋基質。作為另外一種選擇，當完整基因遞送載體(例如逆轉錄病毒載體)可無損地由重組細胞產生時，藥物制劑可包括產生基因遞送體系的一個或多個細胞。
[0098]藥物組合物可與給藥說明書一起放于容器、包裝或分配器中。
[0099]藥物遺傳學
[0100]可將如通過本文所描述的篩選試驗所確認的對潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的活性或表達具有刺激或抑制效應的試劑或調節劑施用給個體，以(預防性地或治療性地)處理與該多肽的異常活性相關的疾病。結合這樣的治療，可考慮藥物基因組學即，研究個體的基因型和該個體對外來化合物或藥物的響應之間關系的學科)。治療劑代謝的差異可通過改變藥理活性藥物的劑量和血液濃度之間的關系導致嚴重毒性或治療失敗。因此，藥物基因組學使得選擇有效試劑(例如藥物)成為可能，以進行基于個體基因型考慮的預防性或治療性處理。這種藥物遺傳學還可用于確定合適的劑量和治療方案。因此，可確定個體中潰瘍性結腸炎相關基因廣物多妝的活性、潰瘍性結腸炎相關基因廣物核酸的表達或潰瘍性結腸炎相關基因產物基因的突變量，從而選擇合適的試劑用于個體的治療性或預防性處理。
[0101]由于患者中改變的藥物處置和異常行為，藥物遺傳學研究可處理對藥物響應的臨床上顯著的遺傳變異。參見例如Linder (1997)Clin.Chem.43(2):254-266。通常，可區分兩類藥物遺傳學病癥。以改變藥物對人體作用方式的單個因子傳遞的遺傳病癥被稱為“改變的藥物作用”。以改變人體對藥物作用方式的單個因子傳遞的遺傳病癥被稱為“改變的藥物代謝”。這些藥物遺傳學病癥可以罕見的缺陷或以多態性形式發生。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺陷是常見的遺傳性酶病，其主要的臨床并發癥為攝入氧化劑藥物(抗瘧疾藥物、磺胺類藥物、止痛藥、硝基呋喃類藥物)和食用蠶豆后出現的溶血。
[0102]作為示例性實施例，藥物代謝酶的活性為藥物作用的強度和持續時間的主要決定因素。一些患者在服用標準和安全劑量的藥物后不能獲得預期藥物效果或表現出過度的藥物反應和嚴重毒性，藥物代謝酶(例如N-乙酰基轉移酶2 (NAT2)和細胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的基因多態性的發現對此作出了解釋。這些多態性在人群中表達成兩種表型:強代謝者(EM)和弱代謝者(PM)。PM在不同人群中的流行率是不同的。例如，編碼CYP2D6的基因是高度多態性的，并且在PM中鑒別了幾種突變，這些突變都導致功能性CYP2D6的喪失。CYP2D6和CYP2C19的弱代謝者在接受標準劑量時通常經歷過度的藥物反應和副作用。如果代謝物為活性治療部分，則PM將不顯示治療反應，如通過CYP2D6形成的代謝物嗎啡所介導的可待因的鎮痛作用所證實的。其他極端情況為所謂的對標準劑量無響應的超快代謝者。最近，已鑒別超快代謝的分子基礎是由于CYP2D6基因的擴增。
[0103]因此，可確定個體中潰瘍性結腸炎或其他腸胃疾病相關基因產物多肽的活性、多肽的編碼核酸的表達或多肽的編碼基因的突變量，從而選擇適合用于該個體的治療性或預防性處理的藥劑。此外，可利用藥物遺傳學研究，將編碼藥物代謝酶的多態性等位基因的基因型應用于鑒別個體的藥物響應表型。在應用于劑量或藥物選擇時，該知識可避免在使用多肽活性或表達的調節劑(例如通過本文所述的示例性篩選試驗之一所鑒定的調節劑)治療受試者時發生不良反應或治療失敗，從而增強治療或預防的效果。
[0104]處理方法
[0105]本發明為對于有這樣一種疾病的風險(或易患該疾病)或患有該疾病的受試者提供預防及治療方法創造了條件，所述疾病與潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的異常表達或活性相關并且/或者其中涉及潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽。
[0106]如本領域所知或如本文所述，本發明提供用于在細胞、組織、器官、動物或患者中使用潰瘍性結腸炎相 關基因產物的拮抗劑來調節或治療與潰瘍性結腸炎相關基因產物相關的疾病或病癥的方法。潰瘍性結腸炎相關基因產物的拮抗劑的組合物可具有治療潰瘍性結腸炎或相關病癥(例如潰瘍性結腸炎或其他TNF介導的疾病)的治療用途。
[0107]本發明也提供用于在細胞、組織、器官、動物或患者中調節或治療TNF介導的免疫相關疾病的方法，所述疾病包括(但不限于)胃潰瘍、炎性腸疾病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病等等。參見例如，the Merck Manual,第 12-17版,Merck&Company, Rahway, NJ(1972，1977,1982, 1987, 1992, 1999) ；Pharmacotherapy Handbook,Wells 等人(編輯)，第二版,Appletonand Lange, Stamford, Conn.(1998，2000),各自以引用方式全文并入本文。
[0108]以潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的異常表達或活性表征的疾病在本公開的其他部分另有述及。
[0109]預防方法
[0110]在一個方面，本發明提供了用于在受試者中基本上預防與潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的異常表達或活性相關的疾病或病癥的方法，即給受試者施用可調節該多肽的表達或某個活性的試劑。可通過(例如)本文所述的診斷檢測或預后檢測中的任一者或兩者的組合來確認有患潰瘍性結腸炎相關基因產物的異常表達或活性引起或造成的疾病的風險的受試者。可在表現出所述異常的特征性癥狀之前施用預防試劑，使得疾病或病癥得到預防，或者疾病的進展被延遲。例如，可根據異常的類型使用激動劑或拮抗劑治療受試者。可根據本文所述的篩選試驗來確定合適的試劑。
[0111]治療方法
[0112]本發明的另一個方面涉及目的在于治療的調節潰瘍性結腸炎相關基因或基因產物的表達或活性的方法。本發明的調節方法涉及使細胞與可調節所述多肽的一種或多種活性的試劑接觸。調節活性的試劑可以是本文所述的試劑，例如核酸或蛋白質、多肽的天然存在的同源配體、肽、擬肽或其他小分子。在一個實施例中，該試劑可刺激多肽的一種或多種生物活性。在另一個實施例中，該試劑可抑制潰瘍性結腸炎相關基因或基因產物多肽的一種或多種生物活性。這種抑制劑的例子包括反義核酸分子和抗體以及本文所述的其他方法。這些調節方法可在體外(例如通過用試劑培養細胞)進行或作為另外一種選擇，在體內(例如通過將試劑施用到受試者)進行。因此，本發明提供治療患有以潰瘍性結腸炎相關基因產物多肽的異常表達或活性為特征的疾病或病癥的個體的方法。在一個實施例中，本方法涉及施用一種試劑(例如通過`本文所述篩選試驗鑒別的試劑)，或施用調節(例如上調或下調)表達或活性的試劑組合。在其中活性或表達異常高或上調和/或其中減少的活性可能具有有益效果的情況下，對活性進行抑制是可取的。
[0113]雖然已概括地描述了本發明，但還將在以下的實例中進一步公開本發明的實施例，所述實例不應理解為對本權利要求所保護的范圍的限制。
[0114]縮寫:
[0115]ACTl活動期潰瘍性結腸炎試驗I
[0116]ANOVA方差分析
[0117]C5a補體 5a
[0118]DC樹突狀細胞
[0119]FDR錯誤發現率
[0120]IEC腸上皮細胞
[0121]IL白介素
[0122]mRNA信使 RNA
[0123]PMN多形核白細胞
[0124]TLRtoll 樣受體
[0125]TNFa腫瘤壞死因子a[0126]Th輔助性T細胞
[0127]TREM-1在髓系細胞上表達的觸發受體
[0128]UC潰瘍性結腸炎
[0129]實施例
[0130]實例I
[0131]使用得自臨床研究中患者亞組的結腸粘膜活檢，作了信使RNA(mRNA)表達的回顧性分析。確認了 mRNA表達模式，其在英夫利昔單抗治療之前提供了對治療的響應者與未響應者進行區分的分子譜。鑒定的分子用于限定20基因的分子反應簽名和5基因的分子反應簽名，這兩種簽名準確地將患者分類為響應者或未響應者。
[0132]反應簽名探針組被施用于第二獨立隊列。結果證實了探針組能夠在英夫利昔單抗治療前準確分類受試者。
[0133]英夫利昔單抗是一種抗TNFa單克隆抗體，可有效治療潰瘍性結腸炎(UC)，其引起超過60%的患者對治療有反應。因此,約40%的患者無反應。該實驗分析了來自參與臨床試驗(“ACT1”)的患者的粘膜基因表達，以提供用于英夫利昔單抗治療的預測性反應簽名。
[0134]22位患者在英夫利昔單抗治療前進行了結腸鏡檢查伴活組織檢查。對英夫利昔單抗的反應被定義為第8周時的內窺鏡和組織學治愈。從英夫利昔單抗治療前的活檢組織中分離出信使RNA，將其標記并雜交到AfTymetrix HGU133Plus_2.0陣列。該預測性反應簽名為一個獨立的數據集所驗證。
`[0135]當比較12個英夫利昔單抗響應者和10個英夫利昔單抗未響應者的粘膜表達譜時，確認了 109個差異表達的探針組。對與中性粒細胞功能、粘膜上皮屏障功能和先天性免疫反應相關的基因進行富集。從這109個基因中確定了由20個探針組構成的預測性反應簽名，表明具有95.4%(21/22)的總體精確度、91.7% (11/12響應者)的靈敏度和100% (10/10未響應者)的特異性。減少到5個探針組，仍保持了 90.9%(20/22)的總體精確度、91.7%(11/12響應者)的靈敏度和90.0% (9/10未響應者)的特異性。在一個獨立隊列驗證這兩種探針組簽名，均得到了 75%(18/24)的總體精確度、87.5% (7/8響應者)的靈敏度和68.8%(11/16未響應者)的特異性。微陣列數據以序列登錄號GSE12251存放于高通量基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus) (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=rdatvkmqcaiqizk&acc=GSE12251)。
[0136]材料和方法
[0137]在方案規定的時間點，從隨機進行ACTl的患者亞組中收集患者的活檢組織。從接受了 5或10mg/kg的英夫利昔單抗的22名患者亞組分析在第O周獲得的23個活檢組織(11個活檢組織來自10個未響應者，12個活檢組織來自12個響應者；兩周內從同一受試者獲得的兩個未響應者活檢組織)。在第8周確定反應。對英夫利昔單抗的反應被定義為粘膜完全治愈(即O或I的Mayo內窺鏡小分)和針對UC的O或I級的組織學評分。盡管一些患者顯示了組織學上的改善，未達到粘膜治愈的患者均被認為是未響應者。表1中示出了該隊列的基線特性。
[0138]表1:研究隊列的基線特性
[0139]
【權利要求】
1.一種用于預測通過抗TNF療法治療受試者所患的與TNF介導相關的疾病的適用性的方法，所述方法包括: a)用從所述受試者獲得的樣本制備核酸樣品；以及 b)用雜交到BCL6(基因庫登錄號AW264036 ;SEQ ID NO:118)和tx82a04.xl (基因庫登錄號AI689210 ;SEQ ID NO:123)的標記核酸片段群測定所述樣品，其中所述基因的下調與治療炎性腸胃疾病的療效相關。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述測定還包括測定與選自以下的成員進行的核酸雜交:C5AR1 (基因庫登錄號NM001736 ;SEQ ID NO: 119), FOLRl (基因庫登錄號U81501 ;SEQ ID NO:142)和 OSM (基因庫登錄號 A1079327 ;SEQ ID NO:173)0
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述測定還包括測定與選自SEQID NO:110至203的基因進行的核酸雜交。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗TNF療法選自英夫利昔單抗、戈利木單抗、EnbreI? 和 Humira?。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述炎性腸胃疾病選自克羅恩氏病、炎性腸疾病和潰瘍性結腸炎。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述炎性腸胃疾病選自輕度、中度、重度、小兒或成人類型。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述抗TNF抗體為戈利木單抗或英夫利昔單抗，并且所述與TNF介導相關的疾病是潰瘍性結腸炎。
8.根據權利要求1所述的方法，其中集合是選自SEQID NO:1至109的核酸片段的陣列。
9.一種基于陣列的測試方法，所述方法用于預測用抗TNF療法治療與TNF介導相關的患者疾病的適用性，所述方法包括: a)用取自所述患者的樣本制備核酸混合物； b)用雜交到BCL6(基因庫登錄號AW264036 ；SEQ ID NO:118)和tx82a04.xl (基因庫登錄號AI689210 ;SEQ ID NO:123)的標記核酸探針群測定所述樣品，其中所述探針包括SEQID N0:37和SEQ ID NO:41，其中所述基因的下調與治療炎性腸胃疾病的療效相關。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述測定還包括測定C5AR1(基因庫登錄號NMOO1736 ;SEQ ID NO:119), FOLRl (基因庫登錄號 U81501 ;SEQ ID NO:142)或 OSM (基因庫登錄號 A1079327 ;SEQ ID NO:173)。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述測定還包括測定SEQID NO:110-203的基因中的一個。
12.根據權利要求9所述的方法，其中所述抗TNF療法選自英夫利昔單抗、戈利木單抗、EnbreI?和Humira?，或另一抗TNF生物制劑或小分子藥物。
13.一種預后或診斷用途的試劑盒，包含寡核苷酸、或與編碼標記基因的多核苷酸互補的寡核苷酸或其互補鏈以及表達所述標記基因的細胞，其中所述標記基因選自編碼一部分的 BCL6(基因庫登錄號 AW264036 ；SEQ ID NO:118)和 tx82a04.xl(基因庫登錄號 AI689210 ；SEQ ID NO:123)的核苷酸序列。
14.根據權利要求13所述的試劑盒，其中所述標記基因還包括C5AR1(基因庫登錄號NMOO1736 ;SEQ ID NO:119)、FOLRl (基因庫登錄號 U81501 ;SEQ ID NO:142)或 OSM (基因庫登錄號 A1079327 ;SEQ ID NO:173)0
15.根據權利要求14所述的試劑盒，其中所述標記基因還包括在SEQ ID NO =110-203中列出的基因，并且所述寡核苷酸包含S`EQ ID NO:1-109中任意一個的探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773843SQ201310576327
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2009年8月19日 優先權日:2008年8月25日
【發明者】K.李, F.巴里鮑德 申請人:詹森生物科技公司