一種膽鹽水解酶基因bsh及其重組原核表達載體的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種膽鹽水解酶基因BSH及其重組原核表達載體，該膽鹽水解酶基因BSH保藏號為CGMCC?NO.6540，來自屎腸球菌含有的兩個BSH基因BSH1、BSH2，經比對兩個序列相似性為68.10％。所述重組原核表達載體是在pET-32a載體的多克隆位點中插入屎腸球菌膽鹽水解酶基因BSH1、BSH2而獲得；所述pET-32a載體表達量高，并帶有Trx.Tag，His.Tag，S.Tag。本發明提供的膽鹽水解酶基因在E.coliBL21(DE3)宿主菌中進行了高效表達，也為研究出具有高效降解膽固醇的基因工程菌株提供了理論支持，同時為BSH基因在不同表達系統中的高效表達和表達調控的研究奠定基礎。
【專利說明】-種膽鹽水解酶基因 BSH及其重組原核表達載體 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明屬于基因【技術領域】，尤其涉及一種膽鹽水解酶基因 BSH及其重組原核表達 載體。 【背景技術】
[0002] 膽鹽水解酶（bile salt hydrolase, BSH)是微生物生長、繁殖過程中產生的一種 代謝產物。該酶能水解結合態牛磺酸膽鹽和甘氨酸膽鹽，最終將其轉變成氨基酸和游離膽 酸，具有降低血清膽固醇的功能（KOCIUBINSKI G, PEREZ P, ANTONI G. Screening of Bile Resistance and Bile Peicipitation in LacticAcid Bacteria and Bifidobacteria[J]. Food Prot, 1999, 62:905 ?912 ;Coleman JP, Hudson LL. Cloning and characterization of a conjugated bile acid hydrolase gene fromClostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol, 1995,61:2518?2520. )BSH通常為胞內酶，微酸環境下的最適pH 值一般在5和6之間，對氧氣不敏感，該酶已經從多種微生物中得到了分離和鑒定(李貴 節.降膽固醇乳桿菌的綜合評價及膽鹽水解酶活性研究.上海：上海交通大學.2008, 2;牛 治霞，劉恩梅.益生菌中膽鹽水解酶（BSHs)研究進展.中國乳品工業，2007, 35 (9) : 35? 40 ；BinderH. J, B. Filburn, M. Floch. Bileacidinhibition of intestinal anaerobic organism.Am. J. Clin. Nutr, 1975,28(10) :119 ?125 ;KIM G B, LEE B H. Biochemical and Molecular Insights Into Bile Salt Hydrolase in the Gastrointestinal Microflora a Review Asian-Aust[J].AnitaSci, 2005, 18:1505 ?1512)。目前，發現的產膽鹽水解酶 的菌株都是革蘭氏陽性菌，其中包括部分的益生菌株，如：乳酸菌、雙歧桿菌等；另外一部 分則是與宿主以共生的形式寄生于腸道中的菌株，如：類桿菌、梭狀芽孢桿菌、腸球菌等，通 常生長在無膽鹽的環境中菌株產生的BSH酶均不具有活性。
[0003] 迄今為止有關膽鹽水解酶的研究報道相對較少，國內的研究主要集中在降膽固醇 機理、高產BSH酶優良菌株的篩選、BSH酶的純化等方面；而國外也則正在進行有關BSH酶 微生物分子生物學等方面的研究，但還至今未見有突破性進展。
【發明內容】
[0004] 針對上述問題，本發明實施例的目的在于提供一種膽鹽水解酶基因 BSH及其重組 原核表達載體。
[0005] 本發明實施例是這樣實現的，一種膽鹽水解酶基因 BSH，該膽鹽水解酶基因 BSH保 藏號為CGMCC N 〇 . 6540,來自屎腸球菌含有的兩個BSH基因 BSH1、BSH2,經比對兩個序列 相似性為68. 10%。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種含有上述屎腸球菌膽鹽水解酶基因 BSHUBSH2 的重組原核高效表達載體，其特征在于：所述重組原核表達載體是在pET_32a載體的多克 隆位點中插入屎腸球菌膽鹽水解酶基因 BSH1、BSH2而獲得；所述pET-32a載體表達量高，并 帶有 Trx. Tag, His. Tag, S. Tag。
[0007] 本發明提供了一種屎腸球菌膽鹽水解酶基因 BSH的兩個不同的序列，分別命名 為基因 BSHI、BSH2,經比對兩個序列相似性為68. 10%，具有如SEQIDNo. 1所示的核苷酸 序列，還公開了含有該基因的重組原核表達載體，實驗結果表明膽鹽水解酶基因在E.coli BL21(DE3)宿主菌中進行了高效表達，也為研究出具有高效降解膽固醇的基因工程菌株提 供了理論支持，同時為BSH基因在不同表達系統中的高效表達和表達調控的研究奠定基 礎。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0008] 圖1為基因 BSH1溫度梯度PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，1泳道 為 DL2,000DNA Marker，2 ?9 泳道依次為 65 °C，64.2 °C，63 °C，61. 1 °C，58.7 °C， 56. 9°C，55. 7°C，55°C溫度梯度擴增產物；
[0009] 圖2為基因 BSH2溫度梯度PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，1泳道 為 DL2,000DNA Marker，2 ?9 泳道依次為 65 °C，64.2 °C，63 °C，61. 1 °C，58.7 °C， 56. 9°C，55. 7°C，55°C溫度梯度擴增產物；
[0010] 圖3為陽性克隆PMD19T-BSH的PCR、酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定，1泳道為 DL2, 000DNA Marker，2泳道為基因 BSH1回收產物(對照)，3-5泳道為pMD19T-BSHl菌落 PCR鑒定，6?8泳道為pMD19T-BSHl的EcoRI, Hindlll雙酶切鑒定，9泳道為DL2, 000DNA Marker, 10泳道為基因 BSH2回收產物(對照)，11?13泳道為pMD19T-BSH2菌落PCR鑒定， 14?16泳道為pMD19T-BSH2的BamHI, Hindlll雙酶切鑒定；
[0011] 圖4為陽性克隆pET-32a-BSH的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，1泳道為DL2, 000DNA Marker，2?6泳道為pET-32a-BSHl EcoRI, Hindlll雙酶切鑒定，7泳道為BSH1回收產物 (對照），8 泳道為 DL2, 000DNA Marker，9 ?13 泳道為 pET-32a-BSH2 的 BamHI, Hindlll 雙酶 切鑒定，14泳道為BSH2回收產物(對照）；
[0012] 圖5為BL21 (DE3)-pET-32a-BSHl表達產物SDS-PAGE分析，1泳道為蛋白 maker，2泳道為BL21 (DE3) -pET-32aIPTG誘導（陰性對照)，3泳道為未經IPTG誘導的 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl 重組菌（陰性對照），4 ?8 泳道為 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl IPTG 誘導2, 4, 6, 8, 10h結果；
[0013] 圖6為為BL21 (DE3) -pET-32a-BSH2表達產物SDS-PAGE分析，1泳道為蛋白 maker，2泳道為BL21 (DE3) -pET-32aIPTG誘導（陰性對照），3泳道為未經IPTG誘導的 BL21 (DE3)-pET-32a-BSH2 重組菌（陰性對照），4 ?8 泳道為 BL21 (DE3)-pET-32a-BSH2IPTG 誘導2, 4, 6, 8, 10h結果；
[0014] 圖7為基因 BSH1原核表達蛋白的Western-blot檢測結果；
[0015] 圖8為基因 BSH2原核表達蛋白的Western-blot檢測結果；
[0016] 圖9為融合蛋白純化后SDS-PAGE檢測，1泳道為蛋白maker，2泳道為 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl 表達產物純化結果，3 泳道為 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl 表 達產物未純化對照，4泳道為BL21 (DE3) -pET-32a-BSH2表達產物純化結果，5泳道為 BL21 (DE3)-pET-32a-BSH2表達產物未純化對照；
[0017] 圖 10 為純化產物的 Western-blot 檢測；1 為 BL21 (DE3)-pET-32a-BSHl 純化結果 檢測，2為BL21 (DE3) -pET-32a-BSH2純化結果檢測。 【具體實施方式】
[0018] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0019] 以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0020] 優選實施例中使用的材料：屎腸球菌篩選保存；高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚 合酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、pMD19-T載體、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、 蛋白質分子量標準及蛋白質雙色預染Marker、DNA Marker III購自天根生化科技（北京） 有限公司；氨節青霉素（Ampicillin，Amp)和卡拉霉素（Kanamycin，Kan)為Sigma公司產 品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術有限公司完成；其它化學試劑購自北京鼎國 生物技術有限責任公司；大腸桿菌JM109、BL21(DE3)由本實驗室保存。
[0021] 本發明在前期研究的基礎上，根據網上已公布BSH基因序列設計引物進行PCR擴 ±曾，克隆得到兩個BSH基因，經比對，兩序列相似性為68. 10%。并分別對兩個基因進行了原 核表達，實現了該基因的商效表達。
[0022] 一、BSH基因的克隆與測序
[0023] 根據GenBank已公布的BSH基因序列，利用Primer5. 0和01igo6. 0軟件設計分別 設計了特異引物:h游引物 BSH1F :5' -CCGGAATTCCGGATGTGTACATCCATTGTTTATG-3' (SEQ ID No. 2)，下劃線部分為 EcoRI 酶切位點；下游引物 BSH1R :5'-CCCAAGCTTGGGTTATTTGTTTAAAT AATGTATTTGT-3'（SEQ ID No. 3)，下劃線部分為 Hind III 酶切位點；上游引物 BSH2F :5'-C GCGGATCCGCGATGTGTACGTCTATTACTTA
[0024] TGTAAC-3'（SEQIDNo. 2)，下劃線部分為 BamHI 酶切位點；下游引物 BSH2R :5' -CC CAAGCTTGGGCTAATTTATATATTTAATTTGTTGTTT-3, (SEQIDNo. 3)，下劃線部分為 Hind III 酶切 位點。參照CTAB菌基因組DNA提取方法提取屎腸球菌基因組DNA。以基因組DNA為模板， 用特異性引物進行PCR擴增，擴增體系及條件如下：PCR反應條件：95°C預變性3min，95°C 變性30s，55°C _65°C退火30s，72°C延伸lmin，循環數35,72°C充分延伸10min。PCR反應體 系為25yL:上下游混合引物lyL，模板lyL，Mix (加酶）12.5yL，ddH2010.5yL。采用溫 度梯度PCR方法擴增擴增結果均在約1000bp處呈單一特異性條帶，與GenBank報道的基因 BSH大小相符，如圖1、圖2所示。
[0025] 將PCR產物進行1. 0%(g/mL)瓊脂糖凝膠電泳檢測，再按照DNA凝膠回收試劑盒說 明書進行切膠回收純化；純化的DNA片段與pMD19-T載體在T4DNA連接酶的作用下于16°C 連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽 性克隆，提取質粒，酶切鑒定片段大小后測序，得重組載體PMD19T-BSH1、pMD19T-BSH2。
[0026] 重組載體pMD19T-BSHl、pMD19T-BSH2的菌落PCR鑒定及酶切鑒定結果如圖3所 示，可見 PMD19T-BSH1 和 pMD19T-BSH2 用 PCR 鑒定及 EcoRI/Hindlll、BamHI/Hindlll 雙酶 切均可得到約l〇〇〇bp的目的片段，與預期結果相符，證實目的片段已連入pMD19-T載體且 為正向連接。
[0027] 測序結果顯示，膽鹽水解酶基因 BSH1全長為978bp，BSH2全長975bp，分別編碼 325、324個氨基酸，經比對BSH1、BSH2編碼的氨基酸序列相似性為67. 69%。
[0028] 二、BSH基因重組原核表達載體的構建
[〇〇29] 根據原核表達載體pET_32a表達量高，并帶有Trx. Tag，His. Tag，S. Tag，有利于 表達產物的純化等特點，在其多克隆位點處分別通過限制性內切酶EC〇RI/HindIII、BamHI/ Hindlll引入膽鹽水解酶基因 BSH1、BSH2,實現基因的重組原核表達。
[0030] 將含有基因 BSH1、BSH2 的重組載體用 pMD19T-BSHl、pMD19T-BSH2 分別用 EcoRI/ Hindlll、BamHI/Hindlll 雙酶切，回收基因 BSH1、BSH2 片段，再與同樣經 EcoRI/Hindlll、 BamHI/Hindlll雙酶切的pET-32a載體在T4DNA連接酶的作用下于16°C連接過夜，連接產 物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有卡拉霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒， PCR和酶切鑒定，即得基因 BSH1、BSH2重組原核表達載體pET-32a-BSHl、pET-32a-BSH2。隨 后將 pET-32a-BSHl、pET-32a-BSH2 轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)，-80°C保存備用。
[0031] 基因 BSH1、BSH2重組原核表達載體pET-32a-BSHl、pET-32a-BSH2的PCR鑒定和酶 切鑒定結果如圖4所示，結果顯示目的片段已經連入pET-32a載體中，并將重組子進行了測 序鑒定，保證連入片段的準確性。測序結果與前期測序結果完全相同，可用于表達。
[0032] 三、重組蛋白的誘導表達及鑒定
[0033] 設空載體pET-32a轉化BL21 (DE3) IPTG誘導組、重組菌未誘導組作為陰性對照。將 經鑒定含有重組質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)接種于5mLLB (含氨芐青霉素)中，37°C培養過 夜，按1:100的比例轉接到新鮮的LB(含氨芐青霉素)中，37°C培養2-3h至0D600=0. 5-0. 8之 間，加入IPTG至終濃度ImM于30°C繼續培養，摸索最佳誘導培養時間，收集菌體。SDS-PAGE 檢測蛋白表達情況，結果如圖5、圖6所示。預測N端融合了表達載體標簽的重組蛋白大小 約為45KD。比較對照組與重組菌誘導組可見在預期位置有一帶，且隨誘導時間的加長誘導 產物明顯增加，且6h為最佳誘導時間。文獻報道，融合表達有時會產生兩種表達產物，一種 是融合表達目的蛋白，一種是斷裂的目的蛋白，就是丟失了融合部分的目的蛋白。因此由檢 測結果推斷目標基因是以融合蛋白的形式表達，沒有斷裂的目的蛋白表達。
[0034] 重組菌經IPTG誘導培養后，將培養物4°C下5000r/min離心lOmin，收集粗酶液。 為了確定目的蛋白質的表達形式，采用超聲波并結合溶菌酶破碎細胞的方法分別對表達菌 體的裂解上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。結果表明，目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，表 明表達的重組蛋白主要以包涵體形式存在。
[0035] 融合蛋白Western blot檢測：誘導后菌體蛋白和純化后的融合蛋白經
[0036] 120g/L的分離膠SDS-PAGE電泳后，電轉移至硝酸纖維素膜上膜上，進行
[0037] Western blot印跡分析。一抗為鼠抗人Anti_6XHis( 1:1000稀釋)，二抗為辣根 過氧化物酶偶聯的羊抗鼠 IgG抗體（1:5000稀釋)，采用ECL化學發光法顯影，曝光后在預 期大小處可見清晰條帶，分子量約45KD出現黑色條帶，與預期的所要表達的6 XHis融合蛋 白分子量大小相符，表明目的蛋白得到正確的表達。Western-blot檢測如圖7、圖8所示。
[0038] 融合蛋白的純化：按QIAGEN公司的Ni-NTAAgarose包涵體純化步驟進行，純化結 果進行SDS-PAGE檢測，并進行Western-blot檢測，在正確位置檢測到目標蛋白，大小一 致。檢測結果如圖9、圖10。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發 明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明 的保護范圍之內。 [0039]
【權利要求】
1. 一種膽鹽水解酶基因 BSH，其特征在于，該膽鹽水解酶基因 BSH保藏號為CGMCC N 〇 .6540,來自屎腸球菌含有的兩個BSH基因 BSH1、BSH2,經比對兩個序列相似性為 68. 10%。
2. -種含有權利要求1所述屎腸球菌膽鹽水解酶基因 BSHUBSH2的重組原核高效表達 載體，其特征在于：所述重組原核表達載體是在pET-32a載體的多克隆位點中插入屎腸球 菌膽鹽水解酶基因 BSH1、BSH2而獲得；所述pET-32a載體表達量高，并帶有Trx. Tag，His. Tag, S. Tag。
【文檔編號】C12R1/01GK104087606SQ201310576384
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年2月1日
【發明者】李曉輝, 包凌霞 申請人:李曉輝